Sumário

O factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) via de sinalização foi encontrado para desempenhar papéis importantes no desenvolvimento e progressão de cancros humanos através da regulação dos processos de proliferação celular, apoptose, migração, invasão, metástase, e a aquisição da transição (EMT) fenótipo epitelial-mesenquimal. Além disso, a sinalização de PDGF também foi encontrada para alterar o perfil de expressão miARNs, conduzindo à inversão do fenótipo de EMT. Embora o papel dos miRNAs em câncer tem sido documentada, há muito poucos estudos que documentam as conseqüências celulares da re-expressão alvo de miRNAs específicos. Portanto, nós investigamos se o tratamento de células cancerosas pancreáticas humanas com PDGF podem mudar o perfil de miRNAs expressão, e também avaliou as consequências celulares. O nosso estudo demonstra que o miR-221 é essencial para o fenótipo mediada por PDGF EMT, migração e crescimento de células de cancro do pâncreas. A sub-regulação de TRPS1 por miR-221 é crítico para a aquisição de PDGF-mediada do fenótipo EMT. Além disso, o aumento dependente do PDGF na proliferação de células parece ser mediada pela inibição de um alvo específico do miR-221 e a sub-regulação de p27Kip1

citação:. Um Su, ele s, Tian B, W Hu , Zhang Z (2013) MicroRNA-221 medeia os efeitos de PDGF-BB na migração, proliferação, ea epitelial-mesenquimal Transição em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (8): e71309. doi: 10.1371 /journal.pone.0071309

editor: Takashi Tokino, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 27 de junho de 2013; Publicação: 13 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta causa mais comum de câncer. -relacionados morte nos Estados Unidos [1], e a agressividade do cancro do pâncreas é em parte devido às suas características de resistência a drogas intrínsecas e extrínsecas, que também estão associados com a aquisição da epitelial para mesenquimal transição (EMT) fenótipo [ ,,,0],2], [3]. A EMT é um processo que é sugestivo de características células cancerosas estaminais semelhante, pelo qual as células epiteliais com um fenótipo de paralelepípedos adquirem características de células mesenquimais com uma morfologia do tipo fibroblastos em forma de fuso [3], [4]. Este processo envolve a desmontagem das junções célula-célula, incluindo o sub-regulação de marcadores epiteliais fenótipo de células (E-caderina, zonula occludens-1), assim como a translocação de β-catenina a partir da membrana celular para o núcleo, reorganização do citoesqueleto de actina, e a sobre-regulação de marcadores do fenótipo das células mesenquimais (vimentina, fibronectina e N-caderina) [4]. Este processo reduz a capacidade adesiva das células mesenquimais fenotípicas, o que leva a um aumento da migração e invasão celular, resultando em agressividade do tumor [5].

factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) pode regular muitos processos celulares, incluindo células proliferação, transformação, migração, invasão, angiogénese e metástase, através da activação do seu receptor cognato [6]. Nos últimos anos, o PDGF-BB como o beta-receptores de tirosina-quinase cognatos foram encontrados para desempenhar papéis importantes na aquisição da transição (EMT) fenótipo epitelial-mesenquimal de células cancerosas [5], [7]. O tratamento de células cancerosas epiteliais-como com a proteína PDGF purificada resultou em diminuição significativa expressão de E-caderina e aumento da expressão de E-caixa de zinc-finger homeo-box 2 (ZEB2) ligação em ambos os níveis de mRNA e proteína em associação com indução das características EMT [8]. ZEB2 demonstrou estar envolvida na regulação negativa da expressão de vários genes que codificam para proteínas cruciais do fenótipo de células epiteliais, incluindo E-caderina, concomitante com a sobre-regulação da expressão de vimentina [9]. É importante notar que o PDGF também aumentou significativamente a expressão de fibronectina, N-caderina e vimentina, com concomitante perda de E-caderina. No entanto, ainda mais em profundidade estudos mecanísticos são necessários para a compreensão de como PDGF regula os processos envolvidos no fenótipo EMT.

MicroRNAs (miARNs) foram identificados que melhorar vários aspectos da patogénese do cancro do pâncreas, incluindo metástase, invasão, e auto-renovação [10]. Algumas evidências sugerem que a expressão de genes que são fundamentais para a aquisição do fenótipo EMT e de células de tumor agressividade são regulados por miARNs que levam à repressão quer translacional ou a degradação de ARNm-alvo [11], [12]. O miR-221 é altamente expresso em várias células derivadas de cancro, incluindo o carcinoma pancreático, carcinoma da próstata e células de carcinoma da tiróide [13], [14], [15]. Estudos recentes têm mostrado que o miR-221 regula o EMT por segmentação TRPS1 (tricho-Rhino-falângica síndrome do tipo 1) e aliviando a inibição da ZEB2 [16]. Além disso, níveis elevados de miR-221 foram mostrados para promover a proliferação destas células através da ligação à 3′-UTR do inibidor do ciclo celular e p27Kip1 supressor tumoral e inibir a sua expressão [13], [15]. Nos últimos anos, a sinalização de PDGF tem sido encontrado para alterar o perfil de expressão miARNs, que conduz à reversão do fenótipo de EMT [17], [18].

Embora o papel de miARN no cancro tem sido documentada, existem muito poucos estudos que documentam a consequência celular da re-expressão alvo de miRNAs específicos. Portanto, temos a hipótese de que a sinalização PDGF pode modular o fenótipo EMT via regulação do miRNA biogênese. Neste estudo, nós investigamos se o tratamento de células cancerosas pancreáticas humanas com PDGF podem mudar o perfil de miRNAs expressão, e também avaliou as consequências celulares. Os resultados demonstram que o PDGF apresenta os seus efeitos sobre tanto a proliferação de células e o fenótipo de EMT através da indução de miR-221 expressão, que resulta na sub-regulação de p27Kip1 e TRPS1 em células de cancro pancreático.

Materiais e Métodos

cultura de células

O câncer de pâncreas ASPC-1 linhas de células humanas estáveis ​​obtidos a partir de banco de células comissão preservação da cultura típica, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen, CA) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mmol /L de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. Todas as células foram mantidas numa atmosfera de CO2 a 5% humidificado a 37 ° C

Investigação Reagentes e anticorpos

recombinante humano PDGF-BB foi adquirido a R .; D Systems. Quimicamente sintetizados inibidores de miARN, mimetiza, e mexidos controlos foram obtidos a partir de Dharmacon ou Ambion. Os pequenos RNAs de interferência (siRNAs sintéticos) visando TRPS1 ou p27Kip1 humana foram discrição Select RNAi (Invitrogen) e HP Validated siRNA (Qiagen). As células foram semeadas a 100000 para 300000 células /ml e foram transfectadas, por Oligofectamine (Invitrogen), DharmaFECT3 reagente de transfecção (Dharmacon) ou ARNi MAX (Invitrogen) com as concentrações indicadas. Os anticorpos contra ZEB2, N-caderina e vimentina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra ZEB1, Snail1, Snail2, torção, E47, E-caderina e ZO-1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz. Os anticorpos contra TRPS1, p27Kip1 e GAPDH foram adquiridos a partir Abcam. FITC-conjugado anti-IgG de rato para vimentina e E-caderina de coloração foi adquirido de Invitrogen. O kit de isolamento Mirvana miRNA e Taqman miRNA Os ensaios foram comprado de Ambion and Applied Biosystems.

A transfecção de miRNA Mimics e Específico Anti-miRNAs

AsPC-1 células foram semeadas a 3 × 10

5 células por poço em placas de seis cavidades e foram transfectadas, com o miR-221 imita ou miARN mexidos controlos a uma concentração final de 20 nM utilizando Oligofectamine (Invitrogen). células AsPC-1 foram transfectadas com anti-miR221 (inibidores de miARN) ou um controlo de anti-miARN a uma concentração final de 200 nm, utilizando o reagente de transfecção DharmaFECT3 (Dharmacon). Após 3 dias de transfecção, as células foram divididas e transfectadas repetidamente com miR-221, inibidores de miARN, ou controlar a cada 3-4 dias durante os tempos indicados.

pequeno ARN interferente e transfecção

células AsPC-1 foram transfectadas com 100 nmol /L TRPS1 humano, ARN interferente pequeno p27Kip1 (Si) ou um ARNsi de controlo (Santa Cruz), utilizando o reagente de transfecção de RNAi MAX. Os meios foram removidos depois de uma transfecção de 24 horas, e, em seguida, as células foram incubadas em meio contendo FBS a 5% durante mais 24 horas. Os lisados ​​celulares foram preparados para análise de transferência de Western, e o ARN total foi extraído para o ensaio em tempo real de reacção em cadeia de polimerase de transcrição-reversa.

Ensaio de Proliferação Celular

O ensaio de MTT foi realizado como descrito anteriormente [19]. No total, 6 × 10

3 células foram divididas em placas de 96 poços. As células foram tratadas com ou sem 20 ng /mL de PDGF-BB por 24 h, seguido por um ensaio de proliferação celular utilizando um ensaio de proliferação celular não radioactivo CellTiter96 (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância a 490 nm foi lida por um leitor de placas de ensaio de imunossorvente ligado a enzima. Para o antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) coloração [20], as células AsPC-1 foram coradas com um anticorpo conjugado com FITC anti-PCNA (clone PC10) de BioLegend bem como DAPI. Pelo menos 150 células foram contadas por condição, e as porcentagens de células PCNA-positivas são apresentados.

Cicatrização Ensaio

Uma ferida ensaio de cura foi realizada para examinar a capacidade de migração e invasão celular , tal como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, após as células cresceram até 90-95% de confluência em placas de 6 poços, uma única ferida zero foi gerado com uma ponta de pipeta descartável de 200 ul. As feridas scratch foram fotografados mais de 7 h com um microscópio Nikon invertido com uma câmera digital em anexo, e suas larguras foram quantificados com o software ImageJ. Os dados foram representados como a percentagem de encerramento de feridas, definindo a largura do zero inicial como 100%. Os resultados são apresentados como a média de medições em triplicado por condição em três experiências independentes.

invasão celular Ensaio

Os comportamentos invasivas das células foram testados utilizando um ensaio de invasão de Matrigel transmembranar. Transwell câmaras (Millipore) (8 um de tamanho de poro) foram revestidas com Matrigel (15 ug /filtro). As células (2,0 x 10

4) em meio isento de soro foram plaqueadas na câmara superior e poços de fundo foram cheios com meio completo. As células foram deixadas a invadir através da membrana de Matrigel-revestido durante 72 h a 37 ° C em 5% de CO2. Após a incubação, as células foram removidas da superfície superior do filtro por raspagem com uma cotonete. As células invadidas que aderiram ao fundo da membrana foram fixadas com metanol e coradas com DAPI. O número de células que penetrou a membrana foi determinada por contagem do número médio de células em cinco campos de alta potência seleccionados aleatoriamente.

quantitativa PCR em tempo real

O RNA foi purificado utilizando RNeasy (Qiagen) ou Mirvana (Ambion) kits com a digestão DNase em colunas RNeasy. DNA complementar (cDNA) foi gerado com o High-Capacity kit cDNA Transcrição Reversa (Roche). A análise quantitativa da alteração nos níveis de expressão foi calculada pela máquina em tempo real, PCR (IQ5, Bio-Rad). As condições dos ciclos de PCR foram 94 ° C durante 3 min e 40 ciclos de (94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 20 s e 72 ° C durante 40 s). PCR em Tempo Real foi utilizado para quantificar a expressão de mRNA. As reacções foram realizadas em duplicado, e o limite delta-delta-Ciclo valores (DDCT) foram calculados com base na média dos genes de normalização. ensaios Taqman miARN foram usadas para a quantificação de miR-221, e os resultados foram normalizados para a média dos resultados obtidos para RNU6B.

Análise Western Blot

análise por Western blot foi realizada utilizando o total de Os lisados ​​celulares. Total de lisados ​​celulares de diferentes experiências foram obtidos por lise das células em tampão RIPA contendo Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, fluoreto de sódio a 2 mM, Na3VO42 2 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM e 1 mM, cocktail inibidor de protease. Os lisados ​​celulares totais foram separadas em géis de SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Millipore), imunotransferidas com anticorpos, e visualizada utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences). As bandas de proteína foram quantificadas por densitometria utilizando o software ImageJ análise em gel (rsbweb.nih.gov/ij). Todos os valores foram normalizados para GAPDH.

Microscopia de imunofluorescência

Resumidamente, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 e, em seguida, bloqueadas com soro de cabra a 10%. As células foram incubadas durante 1 hora com anticorpos contra a E-caderina (1:200) ou vimentina (pré-diluída) em soro de cabra a 5%, e, em seguida, eles foram corados durante 1 hora com um anticorpo secundário conjugado com FITC (1:250 ). As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência, e as imagens foram analisadas usando o software Advanced Sport (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Análise estatística

Os resultados apresentados são a média de pelo menos três experiências, cada uma realizada em triplicado, com os erros padrão. As análises estatísticas foram realizadas por análise de variância, seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey ou teste t de Student usando SPSS15.0. valores de p de 0,05 foram considerados significativos e são indicados com asteriscos.

Resultados

PDGF Promovido migração e proliferação celular e alterou o Epithelial- mesenquimais transição Fenótipo em ASPC-1 Células

em primeiro lugar, examinou se PDGF promove a migração de células usando um ensaio ferida zero in vitro e ensaio de transmembrana invasão Matrigel. Em células AsPC-1, o tratamento com PDGF fortemente promovida a migração celular (Fig. 1A, B). Nós também determinar-se se a proliferação celular foi aumentada por PDGF-BB (20 ng /mL, 24 h) em células AsPC-1. Os resultados do ensaio de proliferação celular do MTT indicaram que o PDGF aumentou o número de células viáveis ​​de 1,9 vezes em comparação com o controlo (Fig. 1C). Em seguida, confirmou estes resultados utilizando análise quantitativa de coloração PCNA. ASPC-1 As células tratadas com veículo ou PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h foram coradas com PCNA para medir o número de células em proliferação (Fig. 1D). O resultado mostrou que o aumento mediado por PDGF na proliferação de células (1,6 vezes) foi consistente com os resultados do ensaio de MTT na Fig. 1B.

AsPC-1 células incubadas com veículo ou PDGF-BB (20 ng /ml) foram submetidos ao ensaio de zero ferida (A) e ensaio de invasão de Matrigel transmembranar (B). Os resultados são a média ± DP. de triplicados de medições de três experiências independentes. AsPC-1 células incubadas com veículo ou PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h foram submetidos ao ensaio de proliferação celular do MTT (Os resultados são indicados como as leituras de absorvância a 490 nm) (C) ou marcadas com um FITC anticorpo conjugado contra o PCNA proliferação marcador e DAPI (150 células foram contados para cada condição, e a percentagem de células PCNA positivas é apresentado.) (D). Os resultados são a média ± DP. para os ensaios em triplicado de três experiências independentes. Real-Time PCR foi usado para determinar os níveis de mRNA para avaliar a expressão regulada positivamente de factores de transcrição (E) e os genes específicos da EMT (F) em células AsPC-1 incubadas com veículo ou PDGF-BB (20 ng /mL, 24 h ). Os níveis relativos de ARNm foram normalizados para GAPDH. Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± DP. L: Fotomicrografias de células AsPC-1 incubadas com veículo ou PDGF-BB (20 ng /mL, 24 h). ampliação original, 200X.

Neste estudo, usando PCR em tempo real, também descobrimos que o tratamento PDGF-BB (20 ng /ml, 24 hr) upregulated significativamente a expressão de repressores de transcrição no processos do EMT, indutores, tais como os genes em células ZEB2 AsPC-1 (Fig. 1E). Descobrimos que ele não tem nenhuma mudança na expressão de Snail 1, Snail 2, Twist and E47. Estas mudanças na expressão foram concomitante com a perda de E-caderina e zonula occludens-1 e com o ganho de vimentina, fibronectina e a expressão de N-caderina (Fig. 1F). Mais importante ainda, as células AsPC-1 tratadas com PDGF-BB mostrada uma morfologia alongada /fibroblastóide irregular, que mostrou a aparência de paralelepípedos epitelial (Fig. 1G). Estes resultados sugerem que o PDGF levou à aquisição do fenótipo EMT.

Regulamento de miARN Expressão por PDGF-BB Tratamento em ASPC-1 Células

Real-time PCR foi usado para determinar se o tratamento das células com FCDP-BB (20 ng /mL, 24 h) pode alterar a expressão de miARN em comparação com células não tratadas. Descobrimos que o miR-221-3p e miR-221-5p eram dois nos poucos miARNs enriquecidas em células AsPC-1 tratadas com PDGF-BB (Fig. 2A), sugerindo que o miR-221 de expressão pode ser activado por sinalização do PDGF. Um curso temporal da expressão de miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p e miR-222-5p foi avaliada após o tratamento PDGF-BB em células AsPC-1. Mir-221-3p e foram induzidos miR-221-5p 2,4 vezes e 1,7 vezes, respectivamente, após 4 h de tratamento com PDGF e gradualmente diminuiu 10 h (Fig. 2B). Importante, a indução robusta de ambos os transcritos primários (Pri-miR-221) e o produto intermediário (Pré-miR-221) de miR-221 foi observado tão cedo quanto 2 horas após o tratamento de PDGF, sugerindo que o miR-221 é susceptível de ser transcrição induzida por PDGF sinalização (Fig 2C.)

A:. Os níveis relativos de miRNA em células ASPC-1 tratados com veículo ou PDGF-BB (20 ng /ml, 24 horas) B, C: Tempo -Curso expressão da expressão relativa de miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p e miR-222-5p (B), e miR-221 transcritos (Pri-miR-221), pré miR-221 ou amadurecer miR-221 (C) normalizados para GAPDH (para Pri-miR-221 ou pré-miR-221), ou U6 RNA nuclear pequeno (para miR-221-3p, miR-221-5p, miR- 222-3p, miR-222-5p e amadurecer o miR-221) em células AsPC-1 tratados com veículo ou PDGF-BB (20 ng /mL, 24 h). D: células AsPC-1 foram tratados com veículo ou PDGF-BB (20 ng /ml), ou transf ectadas com um controlo negativo, o miR-221 mímico, anti-miR-221, ou anti-miR-221 e seguido por PDGF -BB tratamento., e submetido a qRT-PCR de miR221. Todos os tratamentos nesta figura foram realizados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± SD.

miR-221 é essencial para a PDGF-mediada epitelial-mesenquimal Transição Fenótipo, Migração e Crescimento de AsPC-1 células

Nós transfectadas células AsPC-1 com sintético miR-221 (miR-221 mímico) ou controlar mímica (contendo uma sequência de GFP) e examinou o fenótipo EMT. Exógeno miR-221 regulado positivamente a expressão de ARNm e proteína ZEB2 e vimentina, e é reduzida a expressão de E-caderina e ARNm de proteína, semelhante ao efeito de PDGF (Fig. 3A, B, C). Em seguida, os oligonucleótidos de ARN contra o miR-221 (anti-miR-221) foram transfectados em células AsPC-1 para inibir a função de miR-221. Anti-miR-221 transfecção reduziu tanto a expressão basal e induzida por PDGF de miR-221 por mais de 70% (Fig. 2C). A análise por Western blot (Fig. 3B) e PCR em tempo real (Fig. 3C) indicou que o fenótipo de EMT por PDGF-BB foi mediada significativamente prejudicada quando o miR-221 foi inibida. Estes resultados confirmam que o miR-221 desempenha um papel essencial no fenótipo EMT PDGF-mediada.

AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo, o miR-221 imitam, ou oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 ( anti-miR-221). As células foram então tratadas com PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h e submetida a qRT-PCR (A, C) ou a análise de Western blot (B) dos factores de transcrição e marcadores de genes específicos de EMT-. células AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo, o miR-221 imitam, ou oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221) e submetidas ao ensaio transmembranar invasão de Matrigel (D) na presença ou ausência de 20 ng /mL de PDGF-BB. células AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo, o miR-221 imitam, ou oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221), seguido por tratamento do PDGF-BB por 24 h, e em seguida foram coradas com um FITC anticorpo conjugado contra o PCNA proliferação marcador e DAPI. No total, 150 células foram contados para cada condição, e a percentagem de células PCNA positivas (e) seja apresentada. Todas as experiências de tratamento nesta figura foram efectuados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± DP.

PDGF não só pode mediar o fenótipo EMT mas também pode promover a migração e proliferação celular. Portanto, AsPC-1 foram transfectadas com um miR-221 mímico, anti-miR-221, ou anti-GFP (controlo) para analisar se a indução de miR-221 por PDGF desempenha um papel na migração celular e proliferação. Quando o miR-221 função foi bloqueada por anticorpos anti-miR-221, PDGF não alterou o nível de migração e proliferação celular, o que sugere que a indução de miR-221 é essencial para a migração celular PDGF-dependente (Fig. 3D) e a proliferação (Fig . 3E). Por outro lado, a transfecção do miR-221 mímico migração celular sozinha significativamente elevados (Fig. 3D) e a proliferação (Fig. 3E) para um nível semelhante ao das células não transfectadas tratadas com PDGF. Estes resultados indicam que a indução de PDGF-dependente de miR-221 é essencial para promover a migração e proliferação celular.

Assim, o miR-221 medeia os efeitos do FCDP sobre a migração, proliferação e diferenciação de células ASPC-1 . Este resultado levanta a questão de saber se um único miR-221-alvo pode ser responsável por todos esses fenômenos ou se miR-221 pode enviar o sinal através de múltiplos alvos funcionalmente e fisicamente distintos.

miR-221 Promove a EMT ao direcionar TRPS1

Um estudo anterior mostrou que a TRPS1 repressor da transcrição da família GATA pode inibir a EMT, diminuindo a expressão ZEB2 [16], [22]. MiR-221 foi anteriormente mostrado para sequências alvo de ARNm TRPS1, levando à expressão reduzida dos produtos do gene através da degradação de ARNm e /ou a inibição de translação [16]. Em primeiro lugar, investigou se o ARNm TRPS1 ou os níveis de proteína são modulados por PDGF-BB em células AsPC-1. O nível de ARNm TRPS1 foi diminuída em cerca de 55% (Fig. 4A) por tratamento de células AsPC-1 com PDGF-BB por 24 h, sob condições que inibiram significativamente a expressão de marcadores EMT (Fig. 3B e C). Portanto, TRPS1 é regulado por sinalização de PDGF. Para avaliar se o miR-221 é responsável para o PDGF-dependente a sub-regulação de TRPS1, o imitador de miR-221 foi transfectada em células ASPC-1, e, em seguida, os níveis de proteína e ARNm de TRPS1, ZEB2, E-caderina e vimentina eram examinado por análise de transferência de Western e PCR em tempo real. Exógeno miR-221 reduziu significativamente a expressão de TRPS1 e E-caderina e aumentou a expressão de ZEB2 e vimentina (Fig. 4B, C, D, E). Pelo contrário, quando mais de 70% de endógena miR-221 foi esgotada por anti-miR-221, os níveis de mRNA e proteína TRPS1 foram elevados (Fig. 4A, B), e as células AsPC-1 apresentou o fenótipo de EMT (Fig. 4F, L). Além disso, observou-se que o miR-221 exógena não alterou ainda mais a expressão do fenótipo após EMT TRPS1 knockdown por siRNA. Mais importante ainda, o tratamento com FCDP-BB não reprimir TRPS1 na presença de anti-miR-221 (Fig. 4A). Estes resultados demonstraram que o miR-221 tem como alvo directamente o ARNm TRPS1, como observado anteriormente [16].

AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo mímico, os miR-221 imitador, oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 ( anti-miR-221) ou TRPS1 siRNA. As células foram então tratadas com PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h e submetida a qRT-PCR de TRPS1. células AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo mímico, os miR-221 imitador, oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221) ou TRPS1 siRNA para 3 dias e sujeitas a análise de Western blot de TRPS1, ZEB2, E- caderina e vimentina. células AsPC-1 foram transfectadas com os oligonucleidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221). As células foram então tratadas com um controlo negativo ou de miR-221 mímico durante 3 dias e submetida a qRT-PCR para ZEB2 (C), E-caderina (D) e vimentina (E). células AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo imitar, os miR-221 imitam ou oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221). As células foram então tratadas com PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h e submetida a coloração por imunofluorescência para vimentina (F) e E-caderina (L) Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado, e os resultados são apresentado como médias ± DP.

a inibição mediada por PDGF de p27Kip1 por miR-221 promove a proliferação celular

p27Kip1 é um membro da família Cip /Kip de quinase dependente de ciclina (CDK) inibidores que actuam para regular negativamente a progressão do ciclo celular de G1 para a fase S por ligação a CDK2 e complexos de ciclina e [23]. Para testar o papel da p27Kip1 na proliferação celular AsPC-1, que reduziu o nível endógeno p27Kip1 por siARN (Si-p27Kip1) (Fig. 5A, B) e medido o crescimento celular ao longo de 4 dias (Fig. 5C). A proliferação de células SI-p27Kip1-transfectadas foi significativamente aumentada em comparação com células de controlo, sugerindo que a diminuição da expressão de p27Kip1 pode promover o crescimento celular em células AsPC-1. Portanto, a hipótese de que a promoção de PDGF-dependente da proliferação das células AsPC-1 pode ser mediada através de sub-regulação de p27Kip1. A análise quantitativa da coloração com PCNA mostraram que a expressão p27Kip1 foi inibida por PDGF-BB (20 ng /ml) após 24 h de tratamento, e a transfecção de Si-p27Kip1 aumentou o número de células em proliferação para um grau semelhante ao tratamento de PDGF (Fig. 5 C, D, E). MiR-221 foi anteriormente mostrado para inibir p27Kip1 e promover a proliferação de células [13], [24], [25]. Por isso, nós investigamos se a proliferação mediada por PDGF de células AsPC-1 é afectada pela inibição de miR-221-mediada de p27Kip1. A transfecção do miR-221 mímico reduziu significativamente a expressão de p27Kip1 (Fig. 5A, B) e a proliferação de células elevada (Fig. 5D, E), de forma semelhante às células transfectadas com Si-p27Kip1 (Fig. 5A, B, D, E ). Quando endógena miR-221 foi esgotada por anti-miR-221, o tratamento de PDGF-BB não reprimir a expressão de p27Kip1 (Fig. 5A, B). Assim, o aumento do PDGF-dependente na proliferação de células parece ser mediada pela inibição de um alvo específico do miR-221 e a sub-regulação de p27Kip1

(A, B):. Células ASPC-1 foram transfectadas com um controle negativo imitar, os miR-221 oligonucleotídeos mímica, anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221) ou p27Kip1 siRNA. As células foram então tratadas com PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h e submetida a qRT-PCR (A) e análise por Western blot (B) para p27Kip1. (C): células AsPC-1 foram transfectadas com controlo negativo ou p27Kip1 siRNA e submetido ao ensaio de proliferação celular do MTT (Os resultados são indicados como as leituras de absorvância a 490 nm). (C) (D, E): células AsPC-1 foram transfectadas com um controlo negativo mímico, os miR-221 mímico, oligonucleótidos anti-sentido para miR-221 (anti-miR-221) ou p27Kip1 siARN. As células foram então tratadas com PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 horas e submetidos a coloração com um anticorpo conjugado com FITC contra o PCNA proliferação marcador e DAPI (E). No total, 150 células foram contados para cada condição, e a percentagem de células PCNA positivas é apresentado (D). Todos os experimentos nesta figura foram realizados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± SD.

Discussão

Um crescente corpo de literatura sugere fortemente que PDGF pode funcionar como um jogador-chave no desenvolvimento e progressão de cancros humanos, regulando os processos de proliferação celular, apoptose, migração, invasão, angiogênese e metástase. Tem sido relatado que a sinalização de PDGF desregulada é frequentemente em tumores humanos, e expressão sobre-regulada de PDGF foi encontrado no pâncreas, da próstata, do pulmão, renal, cancros do ovário e do cérebro [6]. Nos últimos anos, a sinalização de PDGF tem sido encontrado para desempenhar papéis importantes na aquisição do fenótipo EMT em células cancerosas [6], [8], [26]. Além disso, tornou-se cada vez mais claro que a EMT desempenha um papel importante na progressão do cancro e também é responsável pela resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos convencionais. Por isso, a sinalização de PDGF tem sido considerado como sendo importante em malignidades humanas, e, assim, a sinalização de PDGF pode representar um novo alvo terapêutico, sugerindo que o desenvolvimento de agentes que têm como alvo a sinalização de PDGF é susceptível de ter um impacto terapêutico significativo em cancros humanos. O nosso estudo mostrou claramente que o tratamento com PDGF-BB promoveu a migração e proliferação celular e resultou na aquisição do fenótipo EMT por sobre-regulação de marcadores de células mesenquimais (ZEB1, ZEB2, Snail2, e vimentina) e a sub-regulação de uma célula epitelial marcador (E-caderina) em células AsPC-1. Assim, a segmentação de sinalização de PDGF pode inibir a aquisição do fenótipo EMT, o que irá resultar na reversão da resistência aos fármacos no tratamento da doença metastática.

No estudo actual, temos ainda demonstrado que o gene de miR-221 a transcrição é regulada por sinalização de PDGF. A via de PDGF é bem conhecido como um modulador da expressão de vários genes codificadores de proteínas, mas o miR-221 é o primeiro gene de miARN encontrado para ser regulada por PDGF. É intrigante especular que PDGF pode ativar miR-221 a transcrição através do recrutamento do fator de transcrição associada à microftalmia ou outras proteínas de ligação E-box. Descobrimos que o miR-221 foi induzido 2,5 vezes após 4 h de tratamento com PDGF, e ambos os transcritos primários e produtos intermédios de miR-221 foram observadas tão cedo quanto 2 horas após o tratamento de PDGF, sugerindo que o miR-221 de expressão é activada por sinalização do PDGF. miR-221 é altamente expresso em várias células derivadas de cancro, incluindo o carcinoma pancreático, carcinoma da próstata e células de carcinoma da tiróide [14], [15]. Além disso, o miR-221 foi mostrada para estimular a vários aspectos da patogénese do cancro, incluindo metástase, invasão e auto-renovação [27], [28], [29]. Quando o miR-221 foi bloqueado por função anti-miR-221, verificou-se que o PDGF não alterou o nível de migração e proliferação celular e resultar na aquisição do fenótipo EMT. Estes resultados confirmam que o miR-221 desempenha um papel essencial na mediada por PDGF epitelial-mesenquimal fenótipo transição, migração e crescimento de células AsPC-1. MiR-221 e miR-222 partilham a mesma sequência de semente, indicando um grande grau de sobreposição funcional entre estes dois mRNAs.