Abstract

O câncer colorretal é um dos tipos mais comuns de câncer com mais de cinquenta por cento dos pacientes que se apresentam em um estágio avançado. O ácido retinóico é um metabolito da vitamina A e é essencial para o crescimento celular normal e o metabolismo do ácido retinóico aberrante está implicada na tumorigénese. Este estudo tem perfilado a expressão de enzimas que metabolizam ácido retinóico utilizando um tissue microarray câncer colorretal bem caracterizado contendo 650 cancros colo primárias, 285 linfonodo metástases e 50 amostras de mucosa do cólon normais. A imuno-histoquímica foi efectuada no tissue microarray utilizando anticorpos monoclonais que se desenvolveram para a metabolização do ácido retinóico enzimas de CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 e lecitina de retinol aciltransferase (LRAT) utilizando um esquema de pontuação semi-quantitativo para avaliar a expressão. expressão moderada ou forte de CYP26A1was observada em 32,5% dos cancros em comparação com 10% de amostras de epitélio do cólon normal (p 0,001). CYP26B1 foi moderadamente ou fortemente expressa em 25,2% dos tumores e foi significativamente menor expresso no epitélio do cólon normal (p 0,001). CYP26C1 não era expresso em qualquer amostra. LRAT também mostraram significativamente a expressão aumentada em cancros colorectais primários em comparação com o epitélio do cólon normal (p 0,001). expressão CYP26B1 forte foi significativamente associada com mau prognóstico (HR = 1,239, IC 95% = 1,104-1,390, χ

2 = 15,063, p = 0,002). Strong LRAT também foi associado com pior resultado (HR = 1,321, IC 95% = 1,034-1,688, χ

2 = 5,039, p = 0,025). Nos tumores proficientes de reparo incompatível CYP26B1 forte (HR = 1,330, IC 95% = 1,173-1,509, χ

2 = 21,493, p 0,001) e forte LRAT (HR = 1,464, IC 95% = 1,110-1,930, χ

2 = 7,425, p = 0,006) também foram associados com pior prognóstico. Este estudo mostrou que a metabolização do ácido retinóico enzimas CYP26A1, CYP26B1 e LRAT são significativamente sobre-expressos em câncer colorretal e que CYP26B1 e LRAT estão significativamente associados com o prognóstico tanto na coorte total e nos tumores que são de reparo incompatível proficiente. CYP26B1 era independente prognóstico em um modelo multivariado, tanto em toda a coorte de pacientes (HR = 1,177, IC 95% = 1,020-1,216, p = 0,026) e em tumores proficientes reparação incompatibilidade (HR = 1,255, IC 95% = 1,073-1,467, p = 0,004)

Citation:. Brown GT, Dinheiro BG, Blihoghe D, Johansson P, Alnabulsi A, Murray GI (2014) a expressão e significado prognóstico de ácido retinóico enzimas que metabolizam no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (3): e90776. doi: 10.1371 /journal.pone.0090776

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2013; Aceito: 04 de fevereiro de 2014; Publicação: 07 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Brown et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado pela Universidade de Aberdeen Development Trust (https://www.abdn.ac.uk/giving/) e englobam (https://www.encompass-scotland.co.uk/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Graeme Murray é um assessor científico Vertebrados anticorpos, que contribuíram para esta pesquisa. Sem remuneração financeira foi ou é recebida para esta posição nem se detém quaisquer acções nesta empresa. Beatriz Caixa e Ayham Alnabulsi são funcionários de Vertebrados anticorpos. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal é um dos mais comuns tipos de tumores malignos cujo 5 sobrevivência ano permanece em cerca de cinquenta por cento apesar da introdução de programas de rastreio do cancro do intestino [1]. Embora a patogénese molecular deste tipo de tumor é cada vez mais compreendida e definida principalmente nas fases iniciais do desenvolvimento do cancro colo-rectal, onde as alterações moleculares foram delineados com um alto grau de detalhe [2] – [4]. No entanto, existe ainda uma necessidade clara para identificar biomarcadores de cancro colo-rectal, incluindo marcadores de prognóstico, diagnóstico preditivos e [5] -. [15]

O ácido retinóico (RA) é um metabolito da vitamina A (retinol), que executa funções essenciais no crescimento celular normal e na diferenciação e o metabolismo do ácido retinóico desregulada tem sido implicada em tumorigénese [16], [17]. Os retinóides, um termo utilizado para descrever compostos naturais ou sintéticos que mostram uma semelhança estrutural ou funcional para o retinol, têm papeis importantes a desempenhar no crescimento celular, diferenciação e a apoptose [16]. A forma mais activa da AR, o ácido all-trans retinóico (ATRA), tem uma função reguladora de genes e desempenha um papel crucial no desenvolvimento de múltiplos órgãos. 4-oxo-l, 9-cis-retinóico (9-cis-RA) e 4-oxo-13-cis-retinóico (13-cis-RA) são estéreo-isómeros de atRA e também desempenham um papel importante na sinalização RA . Alguns retinóides possuem propriedades anti-câncer que já foram exploradas para o tratamento de vários tipos de cancro, incluindo o cancro do colo do útero e leucemia promielocítica.

O processamento intracelular de retinol envolve lecitina de retinol aciltransferase (LRAT) que é responsável pela a esterificação de retinol [18], [19] enquanto que a hidroxilação de retinol é realizada pelos hidroxilases do ácido retinóico (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1), que são todos membros do citocromo P450 (P450) a família de enzimas [20], [21] .

os três membros da família CYP26 são todos capazes de metabolizadoras atRA em menos biologicamente activa 4-hidroxi-, 4-oxo-, e intermediários 18-hidroxi-RA [22] – [24], de que, de 4-oxo-RA é o metabólito mais comum [16]. Embora estudos anteriores investigaram a expressão P450 em tumores e mostrado tumor expressão seletiva de P450 individuais mais notavelmente CYP1B1 [25] a família CYP26 de P450 tem recebido pouca atenção antes em relação à sua expressão em tumores.

Este estudo tem perfilado a expressão da metabolização do ácido retinóico enzimas de CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 e LRAT utilizando um microarray colorrectal bem caracterizado tecido de cancro com anticorpos monoclonais para CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 e LRAT respectivamente, que foram desenvolvidos e caracterizado por a sua utilização por imuno-histoquímica em formalina cera de tecido embebido fixa.

Os anticorpos monoclonais Materiais e Métodos

Os anticorpos monoclonais para CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 e LRAT foram desenvolvidos em colaboração com Vertebrate anticorpos Ltd (Aberdeen, Reino Unido ) utilizando péptidos sintéticos. Os péptidos foram identificados dentro das sequências de proteína putativos que foram antigénico, exposta na superfície e única para a proteína alvo. As sequências de aminoácidos e localização sobre as proteínas são indicadas na Tabela 1. Os péptidos foram obtidos a partir de Almac Sciences Ltd, (Edinburgh, Reino Unido) e conjugado individualmente a ovalbumina para a imunização e a albumina de soro bovino para os testes de ELISA [26]. A imunização de ratinhos, a produção de células de hibridoma e rastreio de ELISA foram realizados essencialmente como descrito anteriormente [26] excepto que o antigénio foi administrado por via subcutânea. Os hibridomas foram clonados por diluição limitante, até que uma única colónia positiva foi cultivada de ELISA numa placa de 96 poços. As linhas celulares individuais foram então cultivadas a alta densidade de células para a preparação do material de anticorpo que foi utilizado subsequentemente para a sua caracterização por immunoblotting e imuno-histoquímica.

imunotransferência

lisados ​​de células inteiras a partir de células (células embrionárias de rim humano) que sobre-expressam CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 LRAT e foram utilizados como controlos positivos para imunotransferência, enquanto os lisados ​​de células contendo o vector foram utilizados apenas como controles negativos. O lisado celular CYP26A1 e seu controlo foram adquiridos a Abnova (Taipei, Taiwan) enquanto CYP26B1, CYP26C1 LRAT e os lisados ​​de células contendo os seus controlos correspondentes e foram obtidos a partir de (Novus Biologicals, Cambridge, Reino Unido). Os lisados ​​celulares (5 ug de proteína /pista) foram resolvidas por electroforese em NuPAGE 4-12% Bis-Tris géis (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido). Após a transferência de proteína, as membranas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente em solução salina tamponada com fosfato-Tween-20 (PBST) contendo 1% (w /v) de leite em pó desnatado. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com CYP26A1 (diluição 1/5), CYP26B1 (1/2 diluição), CYP26C1 (1/2 diluição) ou LRAT (1/2 diluição) anticorpos monoclonais diluídos em PBST. As membranas foram lavadas (6 vezes) durante 1 hora em 1% de leite desnatado. As membranas foram subsequentemente sondadas, durante 1 hora com um ratinho anti-IgG de anticorpo secundário conjugado peroxidase de rábano-conjugado (1/2000, Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido). As membranas foram então lavadas (6 vezes) durante 1 hora em 1% de leite desnatado e de bandas de proteína visualizada utilizando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Fisher Scientific).

colorrectal tecido de cancro da micromatriz

Todos os casos de câncer colorretal incluídos neste estudo foram selecionados, retrospectivamente a partir do banco de tumores colorectal Aberdeen (agora incorporado dentro e governanced pelo NHS Grampian biorrepositório, Aberdeen, UK). No total, as amostras tumorais de 650 pacientes foram envolvidos neste estudo, em cada caso, um diagnóstico de câncer colorretal primário tinha sido feita, e os pacientes foram submetidos à cirurgia eletiva para o câncer colorretal primário, em Aberdeen, entre 1994 e 2009. Nenhum dos os pacientes tinham recebido qualquer forma de quimioterapia pré-operatória ou radioterapia. Em pacientes particulares com câncer retal que tinham recebido terapia neoadjuvante incluindo curta radioterapia curso foram excluídos. Os dados para os pacientes e seus tumores incluídos neste estudo está detalhado na Tabela S1. informações Survival (todas as causas de mortalidade) estava disponível para todos os pacientes e, no momento da censura dados sobre resultados de pacientes houve 309 (47,5%) óbitos. A sobrevivência média dos pacientes foi de 115 meses (IC 95% 108-123 meses).

Os tumores foram relatados de acordo com o Royal College of Pathologists diretrizes do Reino Unido para a comunicação histopatológico de espécimes de ressecção de cancro colorrectal e que incorpora orientação de versão 5 do sistema de estadiamento TNM [27]. O processamento histopatológico das amostras de excisão do cancro colorectal é detalhado em Materiais e Métodos S1.

A tissue microarray câncer colorretal foi construído contendo amostras normais da mucosa do cólon (n = 50), primário (n = 650) e colorretal metastático amostras de cancro (n = 285) como anteriormente descrito [28] – [30]. Os pormenores de construção do tissue microarray são dadas em Materiais e Métodos S1.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica para cada anticorpo foi realizada com o sistema de Dako Envision livre-biotina (Dako, Ely, RU) usando um Dako Autostainer (Dako), como previamente descrito [28] – [30]. Detalhes da imuno-histoquímica são dadas em Materiais e Métodos S1. As secções foram avaliadas por exame microscópico de luz e a intensidade da imunocoloração em cada núcleo avaliada independentemente por dois investigadores (GTB e GIM) utilizando um sistema de pontuação descrito anteriormente para a avaliação da expressão de proteínas em microarrays de tumores [28] – [30]. A intensidade da imunocoloração em cada núcleo foi classificada como negativa, fraca, moderada ou forte. A localização sub-celular (nuclear, citoplasmática ou membranoso) da imunocoloração também foi registrado. Variação em imunocoloração entre os núcleos de cada caso não foi identificado. Qualquer discrepância na avaliação imuno-histoquímica dos núcleos de tecido entre os dois observadores foram resolvidas por re-avaliação microscópica simultânea.

Avaliação do estado de reparo incompatível

estado de reparação de incompatibilidade (MMR) foi avaliada por imuno-histoquímica utilizando anticorpos para MLH1 e MSH2 como descrito anteriormente [28], [30]. estatuto MMR foi registrada como proficientes ou com defeito.

Estatísticas

A análise estatística dos dados, incluindo o teste de Mann-Whitney, Wilcoxon signed rank test, teste do qui-quadrado, a sobrevivência de Kaplan-Meier análise, teste log-rank e Cox análise multi-variada (variáveis ​​entrou como variáveis ​​categóricas), incluindo o cálculo das taxas de risco e 95% IC foi realizada utilizando IBM SPSS versão 21 para Windows 7 ™ (IBM, Portsmouth, Reino Unido). O teste de log rank foi utilizado para determinar as diferenças de sobrevivência entre grupos individuais. Um valor de probabilidade de p ≤ 0,05 foi considerado significativo. A influência de diferentes pontos de corte em relação à sobrevida foi investigada por dicotomizando a pontuação de intensidade para cada marcador. Os grupos analisados ​​foram coloração negativa contra qualquer coloração positiva, coloração negativa e fraca contra coloração moderada e forte e coloração negativa, fraco e moderado, contra coloração forte.

Ética

O projeto teve o aprovação do norte da Escócia comitê de ética em pesquisa (ref. nn. 08 /S0801 /81 e 11 /NS /0015). O comitê de ética em pesquisa não exige o consentimento do paciente escrito para as amostras de tecido retrospectivos que foram incluídos na tissue microarray câncer colorretal.

Resultados

Os anticorpos monoclonais

A especificidade do os anticorpos monoclonais para CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 LRAT e foram determinados por ELISA utilizando os péptidos imunogénicos e também por imunotransferência (Figura 1), utilizando lisados ​​de células inteiras a partir de células que sobre-expressam cada proteína. Observou-se uma banda migrando com o peso molecular esperado para cada anticorpo num lisado preparado a partir de células que sobre-expressam a proteína relevante, enquanto não foram detectadas bandas com o lisado de controlo correspondente.

A faixa do lado esquerdo de cada painel de controlo contém células lisado, enquanto a faixa da direita de cada painel contém lisado preparado a partir de células que sobre-expressam a proteína relevante. 5 microgramas de proteína foram carregadas por poço.

Imunohistoquímica

CYP26A1, CYP26B1 e LRAT todos mostraram imuno tanto epitélio do cólon normal e câncer colorretal primário e metastático e em cada caso imunocoloração foi localizada no citoplasma das células (Figura 2). Não houve imunoreactivity membrana nuclear ou de superfície celular. Em condições normais imunocoloração epitélio do cólon foi localizado predominantemente células epiteliais da superfície e não a heterogeneidade intratumour foi observada tanto em tumores colorectais primários ou metastáticos. CYP26C1 não apresentaram imunocoloração em qualquer uma das amostras de tecidos examinados.

A intensidade da imunomarcação foi significativamente maior no câncer colorretal primário em comparação com mucosa normal do cólon para CYP26A1 (p = 0,002), CYP26B1 (p 0,001) e LRAT (p 0,001) (Figura 3, tabela 2). Não houve diferença na intensidade da expressão de ambos os CYP26A1 ou CYP26B1 entre cancro colorectal Dukes C e a sua correspondente metástases nos linfonodos enquanto que para LRAT houve uma diminuição significativa na imunorreactividade no metástases nos linfonodos em comparação com os tumores primárias correspondentes (p 0,001 ) (Figura 3 e tabela 2)

A expressão do CYP26A1 foi fortemente correlacionada com tanto a expressão CYP26B1 (χ

2 = 192,2, p . 0.001) e expressão LRAT (χ

2 = 89,54, p 0,001), enquanto expressão CYP26B1 também se correlacionou com a expressão de LRAT (χ

2 = 144,88, p . 0.001)

Relacionamento com os parâmetros clínico-patológicos

as comparações entre a expressão do CYP26A1, CYP26B1 e parâmetros LRAT e clínico-patológicos são resumidos na tabela 3. CYP26B1 e LRAT ambos mostraram associações significativas com o local do tumor, tumor (T) palco, invasão venosa extramuros e estágio global. Em contraste, CYP26A1 só mostrou uma relação com o local do tumor e não mostrou relação com qualquer um dos outros parâmetros clínico-patológicos investigados.

A análise de sobrevida

Whole paciente coorte.

a relação entre a expressão da CYP26A1, CYP26B1 e LRAT com a sobrevida global foi investigado utilizando-se diferentes pontos de corte (negativo v fraco v v moderada forte, negativo v positivo, negativo /fraco v positiva moderada /forte e negativo /fraca /v moderada forte) da pontuação imuno-histoquímica, é resumida na tabela 4 e figura inteira 4.

a-D coorte paciente. sobrevida global A. mostrando categorias CYP26B1 individuais. Em B-D mostra-se a influência de diferentes pontos de corte. E-H incompatibilidade reparar coorte proficiente. E. sobrevida global mostrando categorias CYP26B1 individuais. Na F-H é mostrada a influência de diferentes pontos de corte.

Houve uma associação consistente e significativa entre a expressão CYP26B1 e os resultados (Figura 4). Considerando cada grupo intensidade CYP26B1 separadamente, aumentando a intensidade da imunorreatividade CYP26B1 foi associado com pior prognóstico (HR = 1,239, IC 95% = 1,104-1,390, χ

2 = 15,063, p = 0,002). Para os tumores negativos CYP26B1 (n = 242) a sobrevida média foi de 133 meses (95% CI = 118-148 meses), para os tumores CYP26B1 fraca expressão (n = 216), a sobrevida média foi de 106 meses (IC 95% = 95-116 meses), para tumores CYP26B1 moderada expressão (n = 106), a sobrevida média foi de 103 meses (95% CI = 85-120 meses) e para expressar fortemente tumores CYP26B1 (n = 58), a sobrevida média foi de 81 meses (IC 95% = 60-101 meses).

Comparando tumores negativos CYP26B1 com tumores que mostraram qualquer imunorreactividade CYP26B1 então pior sobrevida foi associada com a expressão CYP26B1 (HR = 1,352, IC 95% = 1,054-1,735, χ

2 = 5,707, p = 0,017). Para os tumores negativos CYP26B1 (n = 242) a sobrevida média foi de 133 meses (95% CI = 118-148 meses), enquanto para os tumores positivos CYP26B1 (n = 380), a sobrevida média foi de 107 meses (IC 95% = 98-116 meses ). Comparando tumores negativos e fracamente positivos CYP26B1 com CYP26B1 moderada e tumores que expressam fortes mostraram que houve uma associação altamente significativa com a sobrevida (HR = 1,465, IC 95% = 1,151-1,865, χ

2 = 9,832, p = 0,002). sobrevida média para os tumores negativos /fracos (n = 458) foi de 125 meses (95% CI = 115-135 meses), enquanto a sobrevida média para o grupo forte moderada /de tumores (n = 164) foi de 96 meses (IC 95% = 108-124 meses). CYP26B1 negativos /fracos /moderados tumores que expressam quando comparado com CYP26B1 tumores que expressam fortemente também mostrou uma associação altamente significativa com a sobrevida (HR = 1,737, IC 95% = 1,248-2,418, χ

2 = 11,092, p = 0,001). A sobrevida média para o grupo CYP26B1 negativo /fraca /moderada (n = 564) foi de 119 meses (95% CI = 111-128 meses) enquanto que a sobrevida média para os tumores fortes CYP26B1 (n = 58) foi de 80 meses (IC 95% = 60-101 meses).

Para LRAT houve uma relação significativa com a sobrevida (HR = 1,321, IC 95% = 1,034-1,688, χ

2 = 5,039, p = 0,025), quando a imuno-histoquímica pontuação intensidade foram dicotomizados em LRAT casos negativos e fracos (n = 239) versus LRAT casos moderados e fortes (n = 383) (figura 5). Para LRAT casos negativos e fracos sobrevida média foi de 132 meses (95% CI = 119-146 meses) enquanto que para LRAT casos moderados e fortes sobrevida média foi de 106 meses (IC 95% = 96-116 meses). Não houve associação entre CYP26A1 e sobrevivência em todo o grupo de pacientes.

A. A relação de LRAT e sobrevivência em todos os cânceres colorretais e B. A relação de LRAT e sobrevivência nos tumores proficientes reparação incompatibilidade.

A relação detalhada entre CYP26A1, CYP26B1 e expressão LRAT, parâmetros patológicos e sobrevida global é mostrada nas Tabelas S2, S3, S4, S5 e.

em CYP26B1 análise multivariada permaneceram independentemente prognóstico (p = 0,026), enquanto não houve significância prognóstico independente de expressão LRAT (tabela 5). Se o modelo de análise multivariada contém apenas as variáveis ​​que estariam disponíveis a partir de uma biópsia de câncer colorretal (ou seja, nenhuma informação sobre fase pT, estágio pN e EMVI), em seguida, CYP26B1 é um marcador prognóstico independente significativa (p = 0,017, Tabela S6)

MMR coorte proficiente.

Nos tumores proficientes MMR havia uma relação consistente entre a intensidade de expressão CYP26B1 e sobrevida global (tabela 6, figura 4). O aumento da intensidade de imuno CYP26B1 foi associado com pior prognóstico (HR = 1,330, IC 95% = 1,173-1,509, χ

2 = 21,493, p 0,001). Para os tumores negativos CYP26B1 (n = 200), a sobrevida média foi de 143 meses (95% CI = 127-158 meses), para os tumores fracos CYP26B1 (n = 186), a sobrevida média foi de 106 meses (IC 95% = 94-116 meses ), para os tumores moderados CYP26B1 (n = 87), a sobrevida média foi de 96 meses (95% CI = 82-112 meses) e para expressar fortemente tumores CYP26B1 (n = 49), a sobrevida média foi de 77 meses (IC 95% 56- 98 meses).

Comparando tumores negativos CYP26B1 com tumores que mostraram qualquer imunorreactividade CYP26B1 então pior sobrevida foi associada com a expressão CYP26B1 (HR = 1,604, IC 95% = 1,207-2,132, χ

2 = 10,796, p = 0,001). Para os tumores negativos CYP26B1 (n = 200), a sobrevida média foi de 143 meses (95% CI = 127-158 meses), enquanto para os tumores positivos CYP26B1 (n = 322), a sobrevida média foi de 104 meses (IC 95% = 94-114 meses ). Comparando tumores negativos e fracamente positivos CYP26B1 com CYP26B1 moderada e tumores que expressam fortes mostrou uma associação altamente significativa com a sobrevida (HR = 1,617, IC 95% = 1,242-2,105, χ

2 = 12,962, p 0,001). sobrevida média para os tumores negativos /fracos (n = 386) foi de 130 meses (95% CI = 120-141 meses) ea sobrevida média para o grupo forte moderada /de tumores foi de 92 meses (IC 95% = 79-106 meses ). CYP26B1 negativos /fracos /moderados tumores que expressam quando comparado com CYP26B1 tumores que expressam fortemente também mostrou uma associação altamente significativa com a sobrevida (HR = 1,948, IC 95% = 1,366-2,777, χ

2 = 14,149, p 0,001). A sobrevida média para o grupo CYP26B1 negativo /fraca /moderada (n = 473) foi de 123 meses (95% CI = 113-132 meses) ea sobrevida média para CYP26B1 tumores que expressam fortemente foi 77 meses (IC 95% = 56-98 meses).

Para LRAT houve uma relação significativa com a sobrevida (HR = 1,464, IC 95% = 1,110-1,930, χ

2 = 7,425, p = 0,006), quando as pontuações de intensidade de imuno-histoquímica foram dicotomizados em LRAT casos negativos e fracas (n = 198) versus LRAT casos moderados e fortes (N = 326) (Figura 5). Para LRAT casos negativos e fracos sobrevida média foi de 139 meses (95% CI = 124-156 meses) enquanto que para LRAT casos moderados e fortes sobrevida média foi de 106 meses (IC 95% = 96-116 meses). Não houve associação entre CYP26A1 e sobrevivência no MMR coorte proficiente paciente.

Em CYP26B1 análise multivariada permaneceram independentemente prognóstico (p = 0,026), enquanto não houve significância prognóstico independente de expressão LRAT (Tabela 7). Se o modelo de análise multivariada contém apenas as variáveis ​​que estariam disponíveis a partir de uma biópsia de câncer colorretal (ou seja, nenhuma informação sobre o estágio do tumor, estágio nodal e invasão venosa extra-mural), em seguida, CYP26B1 é um marcador prognóstico independente altamente significativa (p = 0,001, tabela S6)

não houve relação de tumores defeituosos MMR com CYP26A1, CYP26B1 ou expressão LRAT e sobrevida global.

Discussão

o câncer colorretal é um dos tipos mais comuns de cancro cuja incidência continua a aumentar e ao mesmo tempo os eventos moleculares que caracterizam a fase precoce de desenvolvimento do cancro colo-rectal têm sido descritas em detalhe ainda há necessidade clara para identificar, caracterizar e validar biomarcadores de cancro colo-rectal [4] – [6] , [12].

Este estudo definiu o perfil da metabolização do ácido retinóico expressão enzimas CYP26A1, CYP26B1 e CYP26C1 que são membros da família P450 de enzimas e LRAT em uma grande coorte de cânceres colorretais bem caracterizados. O significado prognóstico da expressão dessas enzimas metabolizadoras de ácido retinóico Também foi estabelecido

Os P450 são um grande grupo de hidroxilases dependentes NADP classificados em famílias e sub-famílias e membros individuais [31] – [34]. . Existem dois grupos funcionais distintos de P450 com base na sua especificidade de substrato tanto para xenobióticos ou compostos endógenos. CYP1, CYP2 e CYP3 são as famílias predominantes envolvidos no metabolismo de xenobióticos enquanto outras famílias de cima CYP4 estão envolvidas no metabolismo de grupos específicos de compostos endógenos biologicamente activos incluindo eicosanóides, hormonas esteróides, ácidos biliares e vitaminas, incluindo vitamina A e D [ ,,,0],35] – [42]. Eles têm múltiplos da transcrição e-transcricional pós mecanismos de regulação [43]. As formas metabolizadoras de xenobióticos da P450 têm sido extensivamente estudados em tumores e muitos membros individuais têm sido mostrados para ser sobre-expresso em tipos específicos de tumores mais notavelmente CYP1B1 que tem sido demonstrado que têm uma expressão aumentada em uma ampla variedade de tumores [25], [44 ] – [52]. A expressão selectiva do tumor de P450 tem sido proposto como um alvo terapêutico especialmente para P450 mediada por activação pró-drogas [51] – [57]. Os P450 envolvidas no metabolismo composto endógeno têm geralmente recebido muito menos estudo em tumores com excepção dos P450 envolvidas no hormônios sexuais (estrogênio e testosterona) metabolismo em relação às metas no cancro da mama e próstata, respectivamente [58] – [60].

Estruturalmente as P450s mostrar maior diversidade de aminoácidos no seu C-terminais, que é o componente hidrofílico da proteína em contraste com o N-terminal que é o componente mais lipofílico da proteína. Dada a variação de aminoácidos marcados C-terminal e a sua hidrofilicidade da utilização de péptidos para o terminal C da P450 indivíduo como imunogénios para produzir anticorpos monoclonais para as formas individuais do P450 tem demonstrado por muitos grupos de investigação, incluindo o nosso próprio para ser uma estratégia altamente eficiente para desenvolver indivíduo monoclonal P450 específico do formulário e policlonais [30], [61], [62].

neste estudo, produziram anticorpos que são específicos para as formas individuais da família CYP26 nomeadamente CYP26A1, CYP26B1 e CYP26C1. Todas as três enzimas CYP26 ácido retinóico hidroxilado e o CYP26A1 mais completamente caracterizada é que é a forma predominante envolvido na hidroxilação do ácido retinóico. CYP26B1 e CYP26C1 são mais recentemente identificados membros da família CYP26 e estão menos bem caracterizadas, em comparação com CYP26A1. CYP26C1 parece ter expressão predominante, mas não necessariamente exclusiva em regiões específicas do cérebro [22], [23].

cânceres colorretais podem ser classificados de acordo com o seu estado instabilidade de microssatélites /MMR e isto representa uma importante via de desenvolvimento do cancro colo-rectal [63], [64]. Neste estudo encontramos significado prognóstico para CYP26B1 tanto em toda a coorte paciente e naqueles tumores que foram definidos como intacta microssatélites ou estável. Em contraste aqueles tumores que estavam MMR com defeito não mostraram qualquer significância prognóstica sugerindo que mecanismos regulatórios distintos pode estar operando em MMR proficiente e MMR tumores defeituosos.

As enzimas CYP26 têm sido propostos como alvos de drogas anti-câncer [65 ] e o aumento da expressão de CYP26A1 e CYP26B1 no cancro colorrectal sugere que essas enzimas podem ser alvos terapêuticos relevantes neste tipo de tumores. Várias séries de compostos com base em diferentes propriedades estruturais foram sintetizados que inibem CYP26 [66] – [69]. Estes compostos são altamente selectivos para CYP26 e mostram elevada actividade inibidora (potência nanomolar) no sentido de CYP26A1. No entanto, ainda não foi avaliada a actividade inibidora destes compostos para com CYP26B1 e CYP26C1. A evidência epidemiológica propôs igualmente alvo de retinóides e as vias de ácido retinóico para quimioprevenção do câncer colorretal e o aumento da expressão da CYP26A1 e CYP26B1 no cancro colorectal indicaria que a segmentação dessas enzimas pode ser uma abordagem útil [70] – [72].

Este estudo também constatou aumento da expressão de LRAT no câncer colorretal primário em comparação com o epitélio do cólon normal. Esta constatação parece contrastar com estudos anteriores de outros tipos de tumores, incluindo o câncer de bexiga [73], o cancro da mama [74] e câncer de próstata [75], que sugeriram a expressão LRAT reduzida em células cancerosas ainda que esses estudos um número relativamente pequeno de amostras de tumores estavam ensaios analisados ​​e, principalmente, bioquímicos de extractos de tumores inteiras foram usadas resultando na avaliação de um “nível médio”, como estroma tumoral e tecidos necróticos terão sido incluídos. Houve associações significativas entre a expressão LRAT tanto em toda a coorte paciente e tumores proficientes MMR quando as notas LRAT foram dicotomizados em negativo /fraca /moderada e forte. Essa associação não foi tão marcante para outros pontos de corte e foi menos robusto do que o observado para CYP26B1 em termos de significados prognósticos.

O principal problema com a maioria dos tipos de cancro, incluindo o cancro colorectal, é a doença metastática e tratamento é geralmente dirigida a metástase embora a avaliação fenotípica em que as decisões de tratamento são muitas vezes feitas por análise de amostras de tumores primários. Em contraste com os eventos moleculares bem definidas que conduzem ao desenvolvimento de cancro colorectal as vias de metástases ter recebido menos atenção [76]. Este estudo foi desenhado para incluir a avaliação da expressão fenotípica em ambos os tumores primários e sua correspondente metástases em linfonodos. Verificou-se que não houve diferença na expressão de CYP26A1 ou CYP26B1 entre os tumores primários e metástases correspondente nó de linfa. No entanto, LRAT mostrou diminuição significativa na expressão em metástase ganglionar comparados com os tumores primários correspondentes. Isto sugere ambos os factores relacionados com o tumor primário e factores micro-ambientais estão envolvidos na regulação da expressão destas enzimas na metástase do cancro colorectal. As potenciais consequências de expressão alterada de CYP26A1, CYP26B1 e LRAT em células de câncer colorretal metastático e sua contribuição para um fenótipo pró-metastático estão descritas na figura 6.

A.