Abstract

A reprogramação do metabolismo energético é fundamental para o câncer, então mitocôndrias são alvos potenciais para terapia antineoplásica. Um estudo anterior demonstrou a actividade anti-proliferativa de uma nova classe de rosamines-direccionamento mitocôndrias. Este estudo descreve

in vitro

citotoxicidade de análogos rosamine de segunda geração, seu modo de ação, e os seus

In vivo

eficácias em um rato modelo tumor aloenxertada. Aqui, demonstramos que estes compostos exibiram citotoxicidade potente (IC média

50 0,5? M), Complexo inibida II e ATP sintase actividades da via de fosforilação oxidativa mitocondrial e perda induzida do potencial transmembranar mitocondrial. A linhas de células NCI-60 ecrã ainda indicado que os análogos rosamine 4 e 5 exibiram efeitos antiproliferativos potentes com Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 mM) e foram mais eficazes contra um câncer colorretal sub-painel de outras linhas celulares. Preliminar

In vivo

estudos em ratinhos 4T1 /c murinos do cancro da mama de rolamento do sexo feminino BALB indicaram que o tratamento com o análogo de 5 em uma única dose de 5 mg /kg ou um esquema de dosagem de 3 mg /kg uma vez a cada 2 dias para 6 vezes (q2d x 6) apresentava apenas indução mínima de retardamento do crescimento tumoral. Nossos resultados sugerem que os análogos rosamine pode ser desenvolvido como agentes de segmentação mitocondrial. Sem dúvida estratégias adequadas devem ser concebidos para melhorar a absorção de tumor de rosamines, ou seja, a integração às moléculas de transporte para melhor resultado terapêutico

Citation:. Lim SH, Wu L, Kiew LV, Chung LY, Burgess K, Lee HB (2014) Rosamines Segmentação do cancro da fosforilação oxidativo Caminho. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10.1371 /journal.pone.0082934

editor: Siyaram Pandey, da Universidade de Windsor, Canadá |

Recebido: 13 de junho de 2013; Aceito: 30 de outubro de 2013; Publicação: 12 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Cancer Research Initiatives Foundation, Malásia Ministério das subvenções HIR-Mohe do Ensino Superior (UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /17 e UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /33), Universiti Malaya Post Graduate Research Grant (PS204 /2010B) e por doações para KB dos Institutos Nacionais de Saúde (GM087981) eo Robert A. Welch Foundation (A-1121). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

quimioterapia para o cancro convencional depende fármacos que actuam através da interrupção da replicação de ADN, ou seja, através da inibição da síntese ou função de novos materiais nucleicos, ou causando danos irreparáveis ​​ácidos nucleicos vitais por meio de intercalação, de alquilação ou de inibição enzimática. A falta de selectividade para células neoplásicas exibiram por estas drogas normalmente limita o seu sucesso como agentes de tratamento. estratégias quimioterapêuticos que têm como alvo contemporâneos vias de sinalização ou de genes particulares produtos tendem a ser limitado a cancros dirigidos por um oncogene dominante e são muitas vezes vulnerável a resistência através da multiplicidade de vias de sinalização tumorigénese [1]. Por exemplo, a maioria dos HER-2 pacientes com câncer de mama metastático positivo que inicialmente responderam ao tratamento com trastuzumab desenvolver resistência trastuzumab secundária dentro de um ano após o tratamento começou [2]. Observações semelhantes foram feitas para vemurafenib segmentada por BRAF para a terapia de melanoma [3] e gefitinib ou erlotinib para o tratamento de câncer de pulmão não-pequenas células alvo EGFR [4].

Uma alternativa relativamente nova ao DNA alvo e enzimas nas células que proliferam rapidamente, ou vias de sinalização específicas é se concentrar em organelas, como as mitocôndrias. As mitocôndrias são os geradores de energia que mantêm a vida da célula e funções celulares essenciais, incluindo várias cascatas de sinalização que regulam as células, por exemplo, o metabolismo, controle do ciclo celular, desenvolvimento e morte celular [5]. Na quimioterapia do cancro, drogas de direccionamento mitocôndrias interferem com os metabolismos de células de cancro por pertubing o potencial transmembranar mitocondrial, inibindo os complexos de cadeia redox de electrões, interferindo transmembranar permeabilidade mitocôndrias, e direccionamento mitocondrial do ADN-[6],. Os tipos mais comuns de drogas-alvo As mitocôndrias são lipofílicos, drogas catiônicas; estes são selectivos para células cancerosas, porque elas tendem a ter potenciais de membrana mitocondrial mais elevadas do que as células epiteliais normais [8], [9].

Descrevemos previamente relações estrutura-actividade (SAR) para as propriedades anti-cancro de um série de rosamines (Fig. 1A) [10], [11]. Estes compostos são cátions deslocalizados lipofílicos (DLC) com aminas cíclicas periféricos e vários grupos no

meso

posição; A maioria destes catiões são substancialmente mais potentes do que a rodamina-123, que é um catião lipofílico deslocalizada bem estudado. Consistência com este, os dados SAR para o rosamines sugeriu boas potências correlacionadas com aminas cíclicas hidrofóbicos e

meso

substituintes -arilo. Tiofurilo e 4-iodofenil

meso

substituição correspondeu a melhoria de aproximadamente 5 vezes na potência em relação à substituição de um grupo fenilo. Além disso, os dados indicaram que significativamente inferior IC

50 valores foram obtidos para compostos não simétricos (X

1 não mesmo que x

2), mas a combinação de substituintes de amina não simétricas com tiofurilo e 4-iodofenil

meso

substituição não foi explorada. imagiologia intracelular em exemplos representativos destes compostos indicados acumular nas mitocôndrias. Estes compostos (isto é, rosamine 2 e 5) também se encontram a ser mais citotóxico contra as células cancerosas em comparação com as células normais epiteliais imortalizadas do mesmo tipo de órgãos [10].

(A) dos corantes rosamine diversamente funcionalizadas na

meso

posição como previamente relatado por Lim et al. (Anticancer Drugs 2009, 20: 461-468), os mostrados aqui com

meso viajantes – tiofurano ou 4-iodofenil tinham actividades anticancerígenos superiores em ensaios celulares. (B) Metas de segunda geração apresentado neste trabalho

A pesquisa aqui relatada foi realizado para investigar como duas modificações moleculares afetar citotoxicidades nesta série:. (I) substituição de

Para

-iodo ou grupos tiofurano com outros

para

-halogeneto ou furano grupos; e, (ii) combinação de tiofurilo e 4-iodofenil

meso

substituição com combinações de piperidina /morfolina. Assim, relatam a síntese de rosamines de segunda geração (Fig. 1B) e as suas citotoxicidades relativas a um painel de linhas celulares de tumores sólidos. Os compostos com atividade promissora foram ainda avaliadas em tela linhas do NCI-60 humana de células tumorais. rosamines selecionados também foram examinados pelos seus efeitos sobre os sistemas redox celular e para os efeitos em um

in vivo

modelo de tumor.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos analisados ​​e aprovados pelo Dr. Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Laboratório animal Center (LAC) animal Care e Use Committee da Faculdade de Medicina da Universidade de Malaya (número de referência FAR /14/07 /2010 /LSH). Fêmeas BALB /c com idades entre 6-8 semanas com um peso mínimo de 17 g, foram mantidos num ambiente controlado de 12 h de ciclos de luz-escuridão com livre acesso a alimento (dieta padrão sedimento comprado de Altromin Internacional, Lage, Alemanha) e água purificada. ratinhos fêmea foram utilizados porque o ambiente hormonal essencial para o desenvolvimento do carcinoma mamário de rato implantado 4Ti estaria presente.

Materiais

meio essencial mínimo com sal de Earl e L-glutamina, meio RPMI 1640 com L -glutamina, soro fetal de bovino, Pen-Strep (10 000 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina), a tripsina × 10 foram fornecidos pela GIBCO, Invitrogen (Auckland, Nova Zelândia). JC-1 foi adquirido a partir de Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, EUA). Dimetil sulfóxido (DMSO), ácido clorídrico a 37%, polietileno-glicol 400 (PEG 400) e 2-propanol foram adquiridos a Merck (Hohenbrunn, Alemanha). Etilenoglicol

bis

(aminoetílico) –

tetra

acético (EGTA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 3 – (

N

-morfolino) propanossulfónico (MOPS ), cloreto de potássio, di-hidrogeno-ortofosfato de potássio, cloreto de sódio, hidrogeno-carbonato de sódio, ortofosfato de hidrogénio dissódico anidro, sacarose e Tris foram comprados Fisher Scientific (Leicestershire, Reino Unido). Tiazoil brometo de tetrazólio azul (MTT) foi comprado de Amresco (Ohio, EUA). Solução salina (0,9% de cloreto de sódio) foi obtida a partir de Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Malásia). Carbonil cianeto de 3-clorofenilhidrazona (CCCP) foi adquirido da Sigma (Steinheim, Alemanha). ensaio de proteína concentrado de reagente corante foi obtido a partir de Bio-Rad Laboratories (Califórnia, EUA). Complexo I, complexo II, IV e complexo enzima ATP-sintase kit de ensaio da actividade de microplacas foram adquiridos a MitoSciences (Oregon, EUA).

Síntese de Análogos Rosamine

Rosamines foram sintetizados e purificados como descrito anteriormente [11]. O material de partida de ditriflato xantona foi preparado em solução por triflação dos fenóis, seguido por uma animação do triflato com piperidina para dar simétrico aminas substituição cíclico (Fig. 2A) ou por adição gradual de piperidina e morfolina para se obter assimétrico aminas substituição cíclico ( A Fig. 2B) [11]. A resultou 3,6-diamino-xanten-9-ona foi feita reagir com reagentes de organolítio ou de Grignard para se obter as estruturas rosamine desejados.

(A) O material de partida de ditriflato xantona foi preparado em solução por triflação do fenóis, seguido por uma animação do triflato com piperidina para dar aminas de substituição simétrica ou cíclico; (B), por adição gradual de piperidina e morfolina para se obter assimétrico aminas cíclicas substituição.

De um modo geral, foi adicionado um reagente de Grignard ou reagente de lítio (1,0 mmol) gota a gota ao longo de 1 min para a solução de 0,2 mmol 3,6-diamino-xanten-9-ona em 5 ml de THF a 0 ° C. A mistura de reacção foi agitada durante 12 h à temperatura ambiente. Após a conclusão da reacção, 2 ml de solução aquosa de HCl 2 M foi adicionada, agitada durante 10 minutos para extinguir a reacção e diluiu-se com 20 mL de CH

2Cl

2. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, secou-se sobre Na anidro

2SO

4, e concentrou-se sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (5% a 10% de MeOH /CH

2Cl

2) para dar o produto puro.

Os dados espectrais para os compostos sintetizados estão listados aqui, excepto a síntese ea Os dados espectrais para rosamines 1, 2 e 5 foram conforme relatado anteriormente [11]. Eles são nomeados abaixo de uma forma que descreve os

meso

substituintes e assume o composto é simétrica salvo indicação em contrário.

4-bromobenzeno Rosamine 3.

1H RMN (300 MHz, CDCl

3) δ 7,72 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,27-7,21 (m, 4H), 7,09 (dd, 2H,

J

= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2H,

J

= 2,6 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (largo, 12H);

13C RMN (75 MHz, CDCl

3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0; λ

max abs 570 nm, λ

max Emiss 590 nm, ε 110.800 M

-1 cm

-1, FWHM 38 nm, Φ 0,78 ± 0,02 em CH

2 Cl

2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)

+ C

29H

30BrN

2O 501,1542; encontrado 501,1539.

4-clorobenzeno Rosamine 4.

1H NMR (300 MHz, CDCl

3) δ 7,56 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2H,

J

= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2H,

J

= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2H,

J

= 2,4 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (largo, 12H);

13C RMN (125 MHz, CDCl

3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1; λ

max abs 570 nm, λ

max Emiss 590 nm, ε 119100 M

-1 cm

-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 em CH

2 Cl

2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)

+ C

29H

30ClN

2O 457,2047; encontrado 457,2052.

Furan Rosamine 6.

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 7,97 (d, 2H,

J

= 9,7 Hz), 7,92-7,91 (m, 1H), 7,18 (dd, 2H,

J

= 9,7, 2,6 Hz), 7,15-7,14 (m, 1H), 6,90 (d, 2H,

J

= 2,6 Hz), 6,82-6,81 (m, 1H), 3,74-3,72 (m, 8H), 1,76 (largo, 12H);

13C RMN (125 MHz, CDCl

3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1; λ

max abs 592 nm, λ

max Emiss 627 nm, ε 86900 M

-1 cm

-1, FWHM 105 nm, Φ 0,38 ± 0,01 em CH

2 Cl

2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)

+ C

27H

29N

2O

2 413,2229; encontrado 413,2232.

assimétrico 4-iodofenil Rosamine 7.

1H NMR (300 MHz, CDCl

3) δ 7,96 (d, 2H,

J

= 8,3 Hz), 7,35-7,29 (m, 2H), 7,17-7,09 (m, 6H), 3,88 (t, 4H,

J

= 4,7 Hz), 3,78-3,71 (m, 8H) , 1,77 (br, 6H);

13C RMN (75 MHz, CDCl

3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66,4, 49,5, 47,4, 26,1, 24,0; λ

max abs 565 nm, λ

max Emiss 586 nm, ε 80900 M

-1 cm

-1, FWHM 39 nm, Φ 0,52 ± 0,02 em CH

2 Cl

2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)

+ C

28H

28Em

2O

2 551,1195; encontrado 551,1192.

assimétrico tiofurilo Rosamine 8.

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 7,69 (dd, 1H,

J

= 4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1H,

J

= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1H,

J

= 9,7 Hz), 7,26-7,22 (m, 2H) , 7,19 (dd, 1H,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1H,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1H,

J

= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1H,

J

= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4H,

J

= 4,9 Hz), 3,68-3,65 (m , 8H), 1,67 (br, 6H);

13C RMN (75 MHz, CDCl

3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (dois picos: 130,62, 130.56), 128,2, 115,2, 114,6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9; λ

max abs 576 nm, λ

max Emiss 599 nm, ε 87600 M

-1 cm

-1, FWHM 42 nm, Φ 0,30 ± 0,01 em CH

2 Cl

2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)

+ C

26H

27N

2O

2S 431,1793; encontrado 431,1795.

Cultura de Células e

In Vitro

celular Viabilidade Ensaio

MCF-7 de carcinoma da mama e HCT-116 linhas de células de carcinoma do cólon foram obtidas a partir Culture Collection American Tissue ( Virgínia, EUA) e mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. HSC-2 células de carcinoma escamoso humano da cavidade oral foram obtidos a partir de Ciências da Saúde Research Resources Bank (Japão). HK-1, uma previamente caracterizados células de carcinoma escamoso da nasofaringe [12] é um dom pelo Prof. Wong Y.C. da Universidade de Hong Kong. Ambas as linhas celulares foram crescidas em meio MEM suplementado com FBS a 10%. Para o ensaio de viabilidade de células, as células a 4000 células /poço, em 80 ul de meio foram inoculados em placas de 96 poços e foram deixadas a aderir durante a noite. As células foram então tratadas com cada composto a concentrações que variaram desde 0,001-10 uM dando um volume final de 100 uL em cada poço. No final do período de incubação, 15 ul de 5,0 mg /mL de MTT em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubou-se durante 4 h. MTT forma excessiva e foram aspirados e o formazano resultante foi solubilizado com 100 ml de sulfóxido de dimetilo. A absorvância foi lida a 570 nm com SpectraMax M4 espectrofotómetro de microplacas (Molecular Devices, CA).

NCI-60 Humana Tumor Linha Celular Tela

NCI-60 do painel de rastreio de células foi realizada pelo NCI /National Institutes of programa de terapias de desenvolvimento de Saúde (Bethesda, EUA). Essa plataforma permite a determinação dos perfis de inibição de crescimento dos compostos de teste em 60 linhas de células cancerosas humanas diferentes, representando leucemia, melanoma e cancros do pulmão, do cólon, do sistema nervoso central, do ovário, da mama, da próstata, e subpainel renal. ensaio de sulforodamina B foi utilizado para avaliar a citotoxicidade de agentes de teste em um painel de 60 linhas de células [13]. Resumidamente, as linhas celulares de tumores humanos do painel de rastreio do cancro foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 5% de FBS e 2 mM de L-glutamina. Para uma experiência de rastreio típico, as células foram inoculadas em placas de microtitulação de 96 poços em 100 ul em densidades de revestimento, dependendo do tempo de duplicação de linhas de células individuais. Após a inoculação de células, as placas de microtitulação são incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 e 100% de humidade relativa durante 24 h. Após a incubação, aliquotas de 100 ul do composto a diferentes diluições foram adicionados aos poços de microtitulação adequadas e foram ainda incubadas durante 48 h. No ponto final do ensaio, as células foram fixadas com ácido tricloroacético seguido de Sulforodamina B coloração para teor de proteína celular. Sulforodamina B absorvância foi lida a um comprimento de onda de 515 nm como uma medição da densidade celular.

mitocôndrias Isolamento e detergente de solubilização

mitocôndrias funcionais foram isolados a partir de fígado de rato pelo método de centrifugação diferencial [14]. Em resumo, um rato (~ 30 g) foi jejuadas durante a noite antes sacrificados por deslocamento cervical. O fígado foi colhido imediatamente e lavados com tampão arrefecido com gelo mitocôndrias isolamento (10 mM de Tris-MOPS, 1 mM de EGTA /Tris, 0,2 M de sacarose, pH 7,4) até ficar livre de sangue. O fígado foi então cortado em pedaços pequenos em um copo com uma tesoura, mantendo em banho de gelo. O tampão foi substituído com 5 ml de tampão de isolamento fresco e o fígado foi homogeneizado com uma sonda Polytron (Ultra-Turrax T8, IKA-Werke, Alemanha) até ficar liso. O homogenato foi centrifugado a 1000 g durante 15 min a 4 ° C. O sedimento foi descartado e o sobrenadante foi centrifugado a 12000 g durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as mitocôndrias. As mitocôndrias foram lavadas duas vezes por ressuspensão em 4 volumes de tampão de isolamento contendo 1 × cocktail inibidor de protease. A concentração de proteína mitocondrial foi determinada utilizando o método de Bradford (ensaio de proteínas Biorad). As mitocôndrias foram congelados em 10 mg /ml de aliquota a -80 ° C.

detergente de solubilização das proteínas mitocondriais foi feito antes da medição da actividade de complexos de fosforilação oxidativa. As mitocôndrias foram diluídos para 5,5 mg /ml com PBS e solubilizadas por adição de um volume de 10 1 /de detergente fornecida para dar a concentração final de proteínas de 5 mg /ml. A mistura foi incubada em gelo durante 30 min e centrifugadas a 17 000 g a 4 ° C durante 20 min. O sobrenadante foi recolhido e diluído até à concentração apropriada para cada actividade complexos da fosforilação oxidativa.

Medição da fosforilação oxidativa Complexos Actividade

Medições das actividades de fosforilação oxidativa mitocondrial para Complexo I, II, IV e ATP sintase foram realizadas utilizando o kit de microplacas imunocaptura ensaio ELISA de acordo com protocolos do fabricante respectivo [15]. Em geral, a placa pré-revestida com anticorpo de imunocaptura apropriado foi incubado com a mitocôndria extrair a concentração recomendada para permitir a imobilização dos respectivos complexos. Complexos de actividade foi medida por adição de solução de mistura de substratos fornecida pelo kit e o composto foi adicionado numa concentração variando 0,01-10 uM em triplicado. Os poços de controlo tratados apenas com 0,1% de DMSO (v /v) e os poços sem extracto de incubação as mitocôndrias foram incluídos como referência fundo. A cinética da atividade de complexos foi gravado com SpectraMax M4 leitor de microplacas espectrofotômetro usando os parâmetros de medição sugeridas.

JC-1 Análise da Membrana Mitocondrial Potencial

O potencial de membrana mitocondrial foi medida com base no potencial acumulação dependente do catiónico JC-1 corante que resulta num desvio de emissão de fluorescência de verde (~525 nm) para vermelho (~590 nm) devido à formação de agregados de J-[16]. Portanto, a despolarização mitocondrial é indicado por uma diminuição no rácio de intensidade de fluorescência vermelho /verde. Resumidamente, as células foram recolhidas e suspensas em 1 ml de meio aquecido a cerca de 1 × 10

6 células /ml. Num tubo de controlo, foi adicionado 1 ml de CCCP 50 mM e incubou-se a 37 ° C durante 5 min. Em seguida, 10 ul de 200 uM JC-1 foi adicionado para as células e incubaram-se a 37 ° C durante 30 min. As células foram lavadas duas vezes com PBS quente, ressuspensas em 500 ul de PBS e analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur utilizando filtros de 488 nm de excitação com a 530/30 nm e 585/42 nm de banda de emissão.

In Vivo

antitumoral Eficácia

enxertos de tumor foram iniciadas por injecção subcutânea de 5 × 10

5 4T1 de carcinoma mamário de rato em 0,1 ml RPMI 1640 nas inguinais mamárias de gordura-pads de ratos [17]. O crescimento do tumor foi monitorado e tratamentos foram iniciados quando os tumores atingiram o volume de cerca de 200 mm

3. Para avaliar a inibição do crescimento do tumor, os ratinhos portadores de tumor 4T1 foram divididos aleatoriamente em grupos com pelo menos oito animais por grupo. O composto 5 foi preparado a 0,3 mg /ml em solução salina normal e o tratamento foi administrado por via intravenosa com 5 mg /kg em encenar dia ou 3 mg /kg a cada dois dias durante seis tratamentos (Q2Dx6). Para o grupo controle, foi dado soro fisiológico normal. O volume do tumor e os pesos dos animais foram medidos três vezes por semana durante 14 d. O volume do tumor foi calculado utilizando a equação: (comprimento x largura

2) foi calculada /2 e em relação volume do tumor (RTV) para cada volume de tumor em qualquer momento dado (V

T) em relação ao volume do tumor em estadiamento dia (V

0) usando a equação: V

t /V

0. O RTV – perfil de tempo para cada grupo foram representados graficamente e determinou-se retardamento do crescimento tumoral na obtenção de um determinado número de duplicações em comparação com o controlo [18], [19]. Os resultados foram expressos como intervalo médio de confiança ± 95% (n = 8).

Análise Estatística

A significância estatística foram realizadas utilizando one-way

Cartão Postal de ANOVA hoc com teste de Bonferroni (SPSS 16.0, IBM Corporation, Armonk, NY) ea diferença foi considerado significativo quando

P

. 0,05

resultados e Discussão

Rosamine análogos

o nosso estudo anterior indicados

meso

-substituído com 4-iodobenzeno 2 e tiofurano 5 foram 5 vezes mais ativo do que o composto fenil substituído 1. os compostos 3, 4 e 6 foram sintetizados para testar se

meso

-Substituição com 4-bromobenzeno 3, 4-clorobenzeno 4 ou 2-furilo 6 grupos iria afectar a actividade anti-cancro. Além disso, o 4-iodobenzeno 7 ou 2-tiofurano

meso

substituintes 8

e substituintes assimétricos

amina piperidina /morfina foram sintetizados e investigados. Rosamines 1-4 e 7 não foram apreciavelmente solúvel em água para que eles foram reconstituídos em DMSO a 10 mM como estoque de tratamento. Rosamines 5, 6 e 8 foram prontamente solubilizado em meio aquoso em concentrações semelhantes, por isso foram usados ​​sem DMSO.

In Vitro

antitumoral Eficácia de Rosamine e NCI-60 Tela

O

in vitro

actividade antitumoral de rosamines foi avaliada utilizando um ensaio de viabilidade celular 48 h extremidade methylthiazolyldiphenyl-brometo de tetrazólio (MTT) contra um painel de linhas celulares de tumores sólidos humanos, incluindo carcinoma da mama (MCF-7), cólon carcinoma (HCT-116), carcinoma de células escamosas oral (HSC-2) e carcinoma da nasofaringe (HK-1). A IC

50 valores para estes rosamines em todo o painel de linhas celulares tumorais testadas variou 0,07-1,2 uM como resumido na Tabela 1. A partir deste estudo, rosamines rolamento halogeneto fenilo ou heterocíclicos porções foram significativamente (

P

0,05) mais potente do que 1. fenilo substituído rosamine haletos substituição resultou na melhoria da citotoxicidade; isso era esperado, pois a substituição de

H

por haleto é comumente usado para aumentar composto lipofilicidade que melhora a permeabilidade da membrana lipídica bicamada [20]. Dentro da série halogeneto, citotoxicidades aumentar na seguinte ordem 4 3 2 (Cl Br I), embora não seja estatisticamente significativa (

P

0,05). Os compostos com

meso

substituintes heterociclico 5 e 6 foram mais potentes do que os halogenetos aromáticos 2-4. Dos dois compostos com

meso

-heterocycles o tiofurano-substituída 5 foi ligeiramente mais ativa do que 6, o substituído-furano um.

Os compostos 7 e 8 têm uma combinação mais polar substituintes de amina do que o simétrico

bis

piperidina 2, e que provou ser mais citotóxicos (Quadro 1). Isto é consistente com os nossos dados anteriores sobre 2-metilbenzenos assimetricamente substituídos com piperidina e morfolina, que mostrou que quase duas vezes mais baixa IC

50 valores em comparação com a estrutura simétrica hidrofóbico contendo apenas piperidina [10]. Enquanto isso para o

meso

-thiofuran 5, a substituição de um dos grupos piperidina por morfolina dá 8, que tem um pouco

diminuiu

atividade, ao contrário das nossas expectativas.

Rosamines podem exibir fototoxicidade devido à geração de espécies reactivas de oxigénio na presença de luz. Para testar para este, uma placa foi irradiada duplicado com 5,3 J /cm

2 de luz de largo espectro, durante 2 h, após tratamento com o composto em paralelo com uma placa mantida no escuro. Não houve diferenças significativas na IC

50 valores obtidos entre os dois experimentos irradiadas e não irradiadas (dados não mostrados), indicando fototoxicidade não foi um problema.

Com base nas conclusões acima, rosamines 4 ( NSC751819) e 5 (NSC751817) foram submetidos à NCI-60 linhas celulares tumorais humanas tela para fornecer mais informações sobre os perfis de crescimento inibitórias contra 60 linhas de células humanas de câncer diferentes, representando leucemia, melanoma e cancro do pulmão, do cólon, do sistema nervoso central ,, da mama, da próstata, renal e subpainel ovário. Esta plataforma permite que o modo de ação a ser inferida por comparação com os padrões de atividade de drogas de agentes padrão com características de segmentação conhecidos usando COMPARAR (algoritmo computadorizado de reconhecimento de padrões) analisa [21]. O GI

50 valores gerados a partir da tela NCI-60 linhas celulares indicaram que tanto rosamine 4 e 5 exibiram efeitos antiproliferativos potentes com Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 mM) e eram particularmente eficazes contra mais de um sub-painel de linhas celulares de cancro colorrectal (Fig. 3). COMPARAR análises indicaram que ambas as rosamines tiveram padrões similares de atividade com violeta de metilo (NSC271967), um corante catiônico triarilmetano que foi anteriormente utilizado na medicina para a sua antimicrobiana, antifúngica e propriedades anti-helmíntico. Esta classe de corantes tinha sido demonstrado para promover a inibição da respiração mitocondrial através da inibição da síntese de ATP, dissipando-se o potencial de membrana mitocondrial e indução de transição de permeabilidade mitocondrial [22], [23]. Assim, a tela do NCI-60 linhas de células indicou os compostos testados tinham uma única assinatura para agentes anticancerígenos-alvo metabolismo energético.

GI

50 (inibição do crescimento de 50%) gráficos médios que mostram os padrões de 4 de atividade, 5 e violeta de metilo (NSC271967) nas telas de linha celular NCI-60. Ambos os rosamines exibiu efeitos antiproliferativos potentes com Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 mM) e foram particularmente mais eficaz contra o painel de cancro colorrectal. COMPARAR análises indicaram 4 e 5 têm padrão semelhante de actividade como violeta de metilo com a Pearson valores do coeficiente de correlação de 0,767 e 0,72, respectivamente.

Rosamines interferido a Redox Energia

Temos demonstrado anteriormente rosamines que localizam principalmente na mitocôndria [10] e que a acumulação de DLC citotóxica é conhecida por alterar potenciais transmembrana mitocondrial [24], [25]. Assim, alterações do potencial de membrana mitocondrial causadas por rosamines 2 e 5 foram monitorados com base na acumulação de potencial dependente JC-1 corante que resultou em uma mudança de emissão de fluorescência de verde (~525 nm) para vermelho (~590 nm) devido para a formação de J-agregados. A partir do estudo, as células HSC-2 tratada com 2 a 0,1? M, 9% da população de células exibiu o aparecimento de transmembrana mitocondrial perda de potencial dentro de 1 hora após o tratamento e, gradualmente aumentada para 19% (

P

0,05) em 8 h (Fig. 4). Enquanto isso, a perda potencial de membrana mitocondrial foi mais proeminente em 2-HSC células tratadas com 5 a 0,1? M. Aproximadamente 21% (

P

0,05) da população de células foi afectada na primeira hora e a percentagem aumentou drasticamente a 34% em 8 horas. Para as células de controlo não tratadas, a população de células despolarizadas em 8 horas manteve-se em cerca de 8%. Enquanto isso, as células tratadas com 5 uM de CCCP, durante 5 min resultou em perda de potencial de membrana em 70% (

P

0,05) da população de células. CCCP é um agente de desacoplamento de fosforilação oxidativa, que actua como um controlo positivo para a experiência.

Representante evento de perda potencial transmembranar mitocondrial em 2-HSC células tratadas com 2 e 5 a 0,1 uM. Após 8 h de tratamento com 2 e 5, a percentagem de população de células com o potencial transmembranar mitocondrial perda aumentada para 19% e 34%, respectivamente. A célula despolarizada percentagem de controlo não tratado em 8 horas mantém-se em 8%, enquanto que para controlo positivo, as células tratadas com 5 uM de cianeto de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP) durante 5 min resultados em população de células despolarizada 70%. * Diferença com

P

-valor. 0,05 em relação ao controle em 0 h

Para entender melhor a inibição mitocôndrias caracterizado pelas rosamines, o seu efeito sobre a via de fosforilação oxidativa foi investigada . Usando o ensaio de imunocaptura de microplacas de ELISA, a cinética de enzimas de redox transportadoras complexo mitocondrial I, II Complexo, complexo IV e ATP-sintase foram monitorizados após tratamento com 2 ou 5. A actividade do complexo II (Fig. 5B) foi parcialmente inibida por 5 com IC

50 valor de 9,6 ± 0,1 mM enquanto que para 2, a inibição foi observada, mas não chegou a 50% até concentrações máximas estudadas. Enquanto isso, ambos 2 e 5 apresentada a inibição da actividade da sintase ATP (Fig. 5D) com IC

50 valores de 3,9 ± 0,3 uM e 3,0 ± 0,8 uM respectivamente. A actividade do complexo I e IV complexo (Fig. 5A e 5C) não foram influenciados pelos rosamines em concentrações até ao máximo usado, 10 uM. Estes dados sugerem que rosamines 2 ou 5 bioenergética compromisso mitocondriais principalmente por inibição da ATP sintase, uma enzima-driven protão que produz ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico. Semelhante interacção bioquímica foi observada em rodamina-123 e este efeito é esperado que o composto tem uma semelhança estrutural próxima com as rosamines [26].

A inibição de dose-resposta de fosforilação oxidativa mitocondrial Complexo 1 (A), Complexo