Sumário

Os microRNAs (miRNAs), cerca de 22 nucleótidos não codificantes moléculas de RNA, regular uma variedade de processos fisiológicos ou patológicos cruciais, incluindo o desenvolvimento embrionário e tumorigênese. Para obter perfis de expressão abrangentes de miRNAs em embriões humanos, caracterizado expressão miRNA em semanas 4-6 do desenvolvimento embrionário humano, utilizando microarrays miRNA e identificou miRNAs específicos-humana-embrião 50 (HES-miRNAs). Além disso, foram selecionados três miARNs não conservadas ou primata-específicos, HSA-miR-638, -720, e -1280, e analisou seus níveis de expressão em vários tecidos normais e tumorais. Os resultados mostram que a expressão da maior parte das miARNs é extremamente baixo durante o desenvolvimento embrionário precoce humano. Além disso, a expressão de alguns miARNs não conservados ou específico de primatas é significativamente diferente entre o tumor e as amostras de tecidos normais correspondentes, o que sugere que os miARNs estão intimamente relacionados com os processos patológicos de diversos tumores. Este estudo apresenta a primeira visão abrangente de expressão miRNA durante o desenvolvimento embrionário humano e oferece evidência imediata da relação entre o desenvolvimento embrionário inicial humana e tumorigênese

Citation:. Lin Y, Zeng Y, Zhang F, Xue L, Huang Z, W Li, et ai. (2013) Caracterização dos perfis de expressão de microRNA ea descoberta dos microRNAs Novos envolvidos no câncer durante o desenvolvimento embrionário humano. PLoS ONE 8 (8): e69230. doi: 10.1371 /journal.pone.0069230

editor: Wei Yan, University of Nevada School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Março, 2013; Aceito: 06 de junho de 2013; Publicação: 02 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de alta Tecnologia Nacional da China (Programa 863) Grant 2006AA02A306, National Natural Science Foundation da China Grant 30871245 e 31271511. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são ~ 22 nucleotídeos (nt) não codificação de moléculas de ARN que regulam a expressão de genes ao nível do ARN mensageiro degradação ou tradução, exercem funções essenciais em processos biológicos diferentes que variam de regulação do ciclo celular, a diferenciação e o metabolismo, para o desenvolvimento do tecido e embrião normal, e até mesmo a tumorigénese [1-4] . Alterações na expressão de miARN estão envolvidos na iniciação, progressão, metástase e de tumores humanos [5]. Aumentando gradualmente a evidência sugere uma relação directa entre miRNAs e muitas doenças, especialmente câncer.

Usando diversos métodos experimentais, estudos anteriores em animais embriogênese descobriram que certos miRNAs foram continuamente relatados, e mais desempenham um papel crucial na diferenciação ou a manutenção de identidade de tecido [6-10]. desenvolvimento humano nas primeiras 8 semanas de embriogênese é potencialmente uma das áreas mais excitantes da pesquisa biológica. Especificamente, alguns tecidos e órgãos importantes, incluindo a neurogénese e o desenvolvimento do fígado, começou a formar-se durante 4-6 semanas (Carnegie Fases 10-17) da embriogênese humana [11]. Recentemente, nosso grupo de pesquisa e outros têm caracterizado os perfis de transcrição de expressão de mRNA do genoma durante a embriogênese humana usando microarray [12,13]. No entanto, a expressão de miARN humana neste período continua a ser elucidados.

Muitos estudos têm demonstrado que miARNs estão implicados em vários aspectos da embriogénese tumorigénese e animais (revisto em 4,5,14-21). Em 1892, os biólogos franceses Lobstein e Recamier especulado o conceito de origem embrionária de tumores pela primeira vez. Na década de 1970, o Dr. Pierce propôs o ‘câncer, a biologia do desenvolvimento “teoria e apontou que tumorigênese estava intimamente envolvido com a biologia do desenvolvimento, em grande medida [22-27]. Atualmente, no entanto, provas relevantes da relação entre o desenvolvimento do embrião humano precoce e tumorigênese é ainda limitada [28-32]. Para preencher esta importante lacuna no conhecimento, portanto, mais estudos são necessários.

Neste estudo, os perfis de expressão de miRNA durante o desenvolvimento embrionário humano foram identificados e caracterizados utilizando miRNAs microarrays. Os resultados mostram que quase todos os miARNs de função conhecida que são altamente expressos ou exibem alterações de expressão durante o desenvolvimento embrionário humano têm sido implicados em várias doenças malignas. Além disso, tecido investigações de vários miARNs de função desconhecida, que são altamente expressos ou sofrem alterações de expressão durante o desenvolvimento embrionário humano de expressão indicar que a expressão destes miARNs foi significativamente diferente entre as amostras de cancro e os correspondentes tecidos normais, sugerindo, assim, que estas miARNs podem também desempenhar importantes papéis na tumorigênese. Estes resultados fornecem evidências sobre a relação estreita entre a embriogênese humana e carcinogênese, e mais revelam que miRNAs relacionadas com o desenvolvimento embrionário com funções desconhecidas podem estar envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer.

Materiais e Métodos

colheita de embriões e linha de células

de colheita de embriões humanos foi realizada como descrito anteriormente [13]. consentimento por escrito adequado foi obtido dos pacientes e aprovação adquirida a partir de Comissão de Ética Médica do Hospital Zhongnan na Universidade de Wuhan, seguindo as diretrizes nacionais.

Microarray e Bioinformática Análises

O ensaio microRNAs microarray foi realizada utilizando um provedor de serviços (Ciências LC). O ensaio começou com 2 a 5? G de RNA total da amostra, que foi fraccionado por tamanhos utilizando um filtro Microcon YM-100 centrífuga (Millipore). Os pequenos RNAs isoladas ( 300 nt) foram 3′-expandido com uma cauda poli (A) utilizando poli (A) polimerase. Uma marcação de oligonucleótido foi ligada à cauda poli (A) para a coloração corante fluorescente mais tarde; duas etiquetas diferentes foram utilizadas para as duas amostras de RNA em experiências de dupla amostragem. A hibridação foi realizada durante a noite em um

μ

Paraflo ™ chip microfluídico usando uma bomba microcirculação (atácticoa Technologies) [33,34]. No chip de microfluidos, cada sonda de detecção consistiu de um segmento de codificação de nucleótidos complementar quimicamente modificado para segmentar microARN (a partir de miRBase, https://www.mirbase.org/) ou outro ARN (de controlo ou sequências definidas pelo cliente), bem como um segmento espaçador de polietilenoglicol para estender o segmento de codificação a partir do substrato. As sondas de detecção foram gerados a partir de

na síntese situ

usando PGR química (reagente fotogerada). As temperaturas de fusão foram de hibridação em relação a modificações químicas das sondas de detecção. A hibridação usadas 100 ul de tampão 6x SSPE (0,90 M de NaCl, 60 mM de Na

2HPO

4, EDTA 6 mM, pH 6,8) contendo 25% de formamida a 34 ° C. Após hibridação, detecção de fluorescência com rotulagem utilizado específica-tag Cy3 e Cy5 corantes. imagens de hibridação foram coletados por meio de um scanner a laser (GenePix 4000B, dispositivos Molecular) e digitalizados usando software de análise de imagem Disposição-Pro (Media Cybernetics). Os dados foram analisados ​​subtraindo primeiro o fundo e normalização dos sinais utilizando um filtro LOWESS (localmente ponderada Regressão) [35]. Para as experiências de duas cores, a relação entre os dois conjuntos de sinais detectados (log

2 transformado, equilibrada) e p-valores dos testes t foram calculados; sinais diferencialmente detectadas foram aqueles com valores de p inferior a 0,01. A intensidade normalizada sinal a partir de 8 amostras (Semana 4 do desenvolvimento embrionário humano: ZN18, ZN46 /47, ZN75; Week 5: ZN38, ZN43, ZN63-1; Semana 6: ZN61, ZN70) foi utilizada a análise de agrupamento usando um um- a análise de variância (ANOVA) por um prestador de serviços (Ciências LC). dados normalizados para todas as matrizes tenham sido depositados na expressão gênica Omnibus (GEO) do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), acessível através do número de adesão GEO Series GSE46795 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).

de alta densidade múltiplos tumores de órgãos e microarrays normais de tecido (catálogo MC5003), contendo 18 tipos de tumor (20 casos por tipo) e os controles correspondentes normais (5 casos por tipo), foram adquiridos a partir de US Biomax. Os oligonucleótidos de miARN e mexidos para

in situ

hibridação foram adquiridos como o ácido nucleico (LNA) sondas marcadas com digoxigenina bloqueado de Exiqon (Dinamarca). A sequência das sondas de detecção foram LNA: LNA-638: 5′-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 ‘; LNA-720: 5’-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 ‘; e LNA-1280: 5’-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 ‘. LNA-U6: 5’-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 ‘e LNA-precipitação: 5′-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3’ foram utilizados como sondas de controlo positivo e negativo, respectivamente. O

in situ

hibridação da matriz de tecido para miRNAs experssion foi realizada utilizando um provedor de serviços (Shaanxi Chaoying Biotecnologia CO, LTD, Shaanxi China), e as lâminas foram lidos por dois pesquisadores independentes. A intensidade da coloração foi classificada como negativa (- /0)., Fraca (+ /1), moderada (++ /2), ou forte (+++ /3) como previamente descrito [36,37]

miARN em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (PCR)

miARN ensaio de RT-PCR foi realizada utilizando um prestador de serviços (Ciências LC). Resumidamente, quantificações de miRNA foram examinadas utilizando TaqMan

® microRNA Ensaios e TaqMan® Universal PCR Master Mix e analisadas por ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. RNU24 foi usada como um controlo interno para determinar a expressão de miARN relativa. Cada amostra foi realizada em triplicado.

Análise estatística

one-way análise de variância (ANOVA) foi realizada utilizando os dados normalizados para a semana 4-6 para identificar miRNAs cuja expressão alterada. Para comparar a expressão miRNAs em tecidos normais e cancerosas humanas, bicaudal

t

testes foram realizados utilizando os escores acima de amostras.

Resultados e Discussão

Caracterização de miRNA de Student perfis de expressão durante o desenvolvimento embrionário humano

Para identificar os perfis de expressão de miRNA de embriões humanos, miRNA ensaios microarrays foram realizados em amostras de embriões humanos (semanas 4, 5 e 6 após a fecundação) usando a tecnologia μParaflo®, e os microarrays os dados brutos foram analisados. A matriz abrange todas as transcrições de miRNA disponíveis no banco de dados Sanger miRBase (liberar 10.1). Para mais detalhes, consulte os procedimentos experimentais e Suplementar Dados (Tabela S1 disponível on-line). Consequentemente, as intensidades do sinal miARNs exibindo superior a 32 foram considerados como expressão detectado. Após a normalização, um limiar de detecção de sinal forte miARN foi definida como 500 (Figura 1). Designamos estes 50 miARNs (~ 6%), em que o sinal de expressão foi maior do que 500 de qualquer fase nas semanas 4, 5 ou 6 durante o desenvolvimento embrionário humano, como miARNs específica de embriões humanos (HES-miARNs) (Tabela 1 ).

Mirna níveis de expressão durante o desenvolvimento embrionário humano (semanas 4, 5, e 6 após a fertilização), com intensidade de sinal maior de 32 foram considerados como expressão detectado. Um sinal forte de limiar de detecção de miARN foi definida como 500 após normalização. MiRNAs com um sinal de fluorescência superior a 500 em qualquer fase nas semanas 4, 5 e 6 foram definidos como HES-miRNAs.

MiRNA

Semana 4

Semana 5

Semana 6

hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Lista de humano-específicas do embrião-miRNAs.

Após a normalização, um limiar de detecção de sinal forte miARN foi definida como 500 (Figura 1), e 50 miARNs (~ 6%, 50/835), em que o sinal de expressão foi maior do que 500 de qualquer fase nas semanas 4 , 5, 6 ou durante o desenvolvimento embrionário humano, foram designados como miARNs humana específica de embriões (HES-miARNs). CSV Transferir CSV

A expressão perfis mostram que a expressão da maior parte das miARNs é baixa durante o desenvolvimento embrionário humano no início, em que aproximadamente 80% de miARN (666 de 835 miARNs) que exibem a potência do sinal foram considerados como expressão não detectado (Figura 1 e Tabela S1). Esses dados são semelhantes aos resultados que a maioria dos miRNAs não foram detectados durante o desenvolvimento do peixe-zebra precoce [10]. ensaios de agrupamento hierárquico de expressão HES-miRNA (Figura 2A) e 169 miRNAs exibem intensidade do sinal ao longo de 32 (Figura S1) durante o desenvolvimento embrionário humano são mostradas. Na Figura 2A, foram identificados os seguintes três grupos de expressões HES-miRNAs: Conjunto A, regulada na semana 6; b Cluster, reprimidos na semana 6; e Cluster c, regulada na semana 4. Na Figura S1, foram identificados quatro grupos de 169 miRNAs: clusters 1, 2, 3 e 4. Cluster um miRNAs na Figura 2A aumentou durante as três fases embrionárias humanas (Semana 6 semana 5 semana 4), e incluídas algumas espécies de miRNA relatados para ser enriquecido em vários processos de desenvolvimento e de doenças (por exemplo, hsa-miR-122, -206, -214, -181 família, e -125 familiares) [38]. Cluster c miRNAs que diminuíram durante as três fases embrionárias humanas (semana 4 semana 5 semana 6) incluiu alguns miRNAs que também foram enriquecidos em vários processos de desenvolvimento e de doenças (por exemplo, hsa-miR-451, -106, -16 , e -17) (Figura 2A) [38]. No entanto, a expressão de muitos membros do cluster B, que aumentou de semana de 4 a 5 semanas, mas diminuiu de semana de 5 a 6 semanas, têm funções desconhecidas em processos de desenvolvimento e de doença.

(A) Cinquenta HES-miRNAs foram divididos em 3 grupos: conjuntos a, b, e c. A seta mostra a miARNs que foram seleccionados para validar ainda mais os dados de microarray utilizando microARN qRT-PCR (Figura 3). O asterisco mostra o não conservada ou específico de primata HES-miARNs (Figura S4). O triângulo vazio indica miRNAs harborring a mesma sequência da região semente entre aglomerado c. (B) A figura 2B mostra a sequência madura de seis miRNAs (miR-17, -106a, -106b, -20, -20b, -93) com a região de sementes idênticos marcados com sombra vermelho claro. gráfico (C) Pie mostra a análise padrão funcional (Gene Ontology) dos alvos conservados (1245 transcrições), previstos por TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_60/), um dos seis miRNAs.

Entre os HES-miARNs (Tabela 1 e Figura 2A), alguns têm sido confirmada experimentalmente para jogar um papel central na diferenciação e na doença. Por exemplo, o mamífero miARN específico do fígado, o miR-122, que tinha o nível mais elevado de expressão na semana 6 do desenvolvimento embrionário humano, é frequentemente suprimida em carcinomas hepatocelulares primários [39,40], e também é essencial para a hepatite C ARN do vírus acumulação nas células do fígado cultivadas [10,41-47]. HSA-miR-214 está relacionado com o desenvolvimento muscular e a formação óssea, e está envolvido no cancro gástrico e cancro do ovário [48-53]. HSA-miR-92a /b, como os membros da família de miR-17 ~ 92, está envolvida em muitos tumores sólidos e leucemia [54-57]. HSA-miR-106a está envolvido na regulação da geração induzida pluripotent stem celular, regulação pós-transcricional de interleucina-10 expressão, câncer gástrico, e astrocitoma [58-61]. Por conseguinte, os nossos resultados suportam fortemente a noção de que não é surpreendente de similaridade entre o desenvolvimento embrionário precoce e tumorigénese [22].

Além disso, estes miARNs altamente expressos, bem como aqueles que têm baixa expressão, podem desempenhar diferentes papéis reguladores em diferentes fases do desenvolvimento embrionário humano. Em alternativa, estes miRNAs com níveis elevados de expressão têm uma forte especificidade de tecido, como HSA-miR-122.

Entre aglomerado c, é incrível que tenha percebido 6 miRNAs (HSA-miR-17, -106a, -106b , -20, -93 e -20b), que contêm a mesma região da semente sequcence AAAGUG (Figura 2B), foram regulados negativamente na semana 6 do desenvolvimento embrionário humano, e pode desempenhar as funções biológicas semelhantes na embriogénese humana. Os laboratórios Hannon e Hammond forneceram resultados experimentais diretos que esses microRNAs, codificados pelo cluster miR-17-92 e seus paralogs (o miR-106a-363 ​​cluster e-miR-106b 25 aglomerados), têm actividade oncogénica no tumor sólido [62 ]. Ventura e seus colegas documentaram fortes evidências de que a eliminação do cluster miR-17-92 resultou em pulmões gravemente hipoplasia e redução no número de células pré-B em camundongos, finalmente levando a embriões menores até mesmo a morte pós-natal imediato [63]. Considerando o papel vital dos miRNAs no desenvolvimento e na tumorigênese, previmos todos os alvos destes 6 miRNAs por TargetScan, e depois as metas conservada (1245) transcrições foram posteriormente analisadas. Durante a fase inicial de desenvolvimento embrionário humano, um evento importante associado com a transição do desenvolvimento a partir da fase de proliferação celular precoce para a organogénese e histogénese é que o número de células estaminais ou células indiferenciadas é reduzida porque mais células começam a diferenciar-se em diferentes órgãos /tecido- tipos de células específicos. Durante a fase inicial de desenvolvimento embrionário humano, um evento importante associado com a transição do desenvolvimento a partir da fase de proliferação celular precoce para a organogénese e histogénese é apresentada. análise do padrão funcional (Gene Ontology) do alvo conservado (1245 transcrições) de 6 miRNAs mostra que a grande maioria desses genes nas categorias GO relacionadas com a regulação biológica, a regulação do processo biológico, processo metabilic, processo celular, processo do organismo multicelular e processo de desenvolvimento (Figura 2C). Informou recentemente alguns alvos de miR de 17 ~ 92 da família, tais como CDKN1A (p21) [64], o BIM [65], RUNX1 [66], ambos estão incluídos nessas categorias GO, o que sugere que esses genes são a posição insubstituível no controlo do ciclo celular, apoptose celular, e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas. E esses resultados poderiam ajudar a entender melhor o papel de HES-miRNAs na embriogênese humana e tumorigênese.

Além disso, para validar a qualidade dos dados de microarrays miRNA, quatro miRNAs (HSA-miR-125b, -720 , -1280, e -20b, Figura 3 e Figura S2) cuja expressão níveis significativamente alterada durante o desenvolvimento foram validados utilizando TaqMan ® em tempo real Os ensaios de RT-PCR de miARN. As tendências de expressão miRNA foram consistentes com o observado nos dados de microarrays miRNA (Figura 3B, C, D, e E)

Quatro miRNAs [HSA-miR-125b (B), HSA-miR-720. (C), HSA-miR-1280 (D), e HSA-miR-20b (e)], que foram diferencialmente expressos (p 0,05, Figura 3A) e (p 0,10, Figura S2) durante as semanas 4, 5 e 6 do desenvolvimento embrionário humano, foram escolhidos. qRT-PCR foi realizado e U6 snRNA foi usada como um controlo interno para determinar a expressão miRNA relativa.

Human-Rato análises comparativas de miRNA Expressão Durante Embryonic Development

Para comparar a miRNA perfis de expressão entre o ser humano e do rato desenvolvimento embrionário, foi realizada uma análise comparativa em relação aos perfis de expressão de microRNA previamente publicados em embriões de camundongos que abrangem o desenvolvimento pré-natal (E9.5, E10.5 e E11.5) [8], que correspondem com semanas 4, 5, 6 e do desenvolvimento embrionário humano [67,68]. Tendo em conta os miRNAs idênticos em humanos e camundongos, construímos uma análise intersecção entre 835 miRNAs humanos neste estudo e 390 miRNAs rato, e identificou 195 miRNAs homólogos (Tabela S2). Os ensaios de classificação hierárquica de miARNs homologia de ratinho-humano são apresentados na Figura S3A e diagramas de Venn B. (Figuras S3C e S3D) mostrou que 38 ou 32 de ratinho-humano miARNs de homologia foram regulados positivamente ou regulados negativamente, respectivamente, durante o desenvolvimento embrionário humano e de ratinho. Entre estes miRNAs, deixe-7 membros da família, miR-34a, miR-221/222, miR-145, miR-125b, miR-15a e miR-223 ter sido provada a desempenhar funções múltiplas durante o desenvolvimento e patogênese em vários mamíferos órgãos [38]. Estes resultados sugerem ainda que alguns miRNAs homólogas de ratinho-humano são importantes para o desenvolvimento e patogênese, enquanto que aqueles que não são homólogas provavelmente estão envolvidos em diferentes processos de desenvolvimento que reflectem a divergência de desenvolvimento entre o ser humano e do rato.

propriedades conservadores de HES-miRNAs

um estudo anterior mostrou que muitos genes miRNA conhecidos têm um padrão de conservação típica, persistente ao longo dos aglomerados, sugerindo implicações evolucionárias e funcionais [69]. No entanto, uma parte substancial do microARNs são confirmadas como miARNs não conservadas ou primata-específicos, porque muitas novas miARNs humanos têm sido continuamente identificados [70]. Para definir a conservação de HES-miARNs, utilizou-se o miRviewer [71], que mostra a conservação dos genes de miARN agrupadas por nome. Como mostrado na Figura S4, a maioria dos HES-miARNs são altamente conservadas, e as suas funções são bem conhecidas. Notavelmente, entre HES-miRNAs, oito miRNAs, HSA-miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, e -1280, são extremamente não-conservada, embora a maioria são primate- específica (Figura S4) [70,72]. Notavelmente, os valores de 5 destes miARNs expressão de pico, o miR-638, -663, -936, -1246, -1275 e, estão a 5 semanas de desenvolvimento embrionário humano. Em outras palavras, esses miRNAs pode funcionar somente em um estágio de desenvolvimento embrionário humano específico. Além disso, sabemos muito pouco sobre as funções biológicas destes miRNAs em organogênese mamíferos e patogênese. No entanto, porque a expressão destes miARNs não conservadas ou primata-específicos é elevada durante o desenvolvimento embrionário humano, estes miARNs provavelmente desempenham papéis cruciais na organogénese e /ou patogénese de mamífero. De facto, alguns estudos indicam que estes não conservada ou específica primata HES-miARN pode ser associado a todos os tipos de doença [73-82]. A função destes não conservada ou específica primata HES-miARNs permanece a ser determinada.

Análise comparativa da expressão de HSA-miR-638, -720, e -1.280 em tecidos normais e malignos

Muitos estudos têm indicado que miRNAs estão envolvidos em diversos aspectos dos processos de desenvolvimento de animais e doenças [4,16-21,38,83-89]. Para validar ainda mais a relação entre o HES-miRNAs e vários tumores sólidos malignos, nos concentramos em três não-conservada ou específicos de primata HES-miRNAs, hsa-miR-638, -720 e -1280 (Tabela 1), de altamente expressa ou exibem mudanças de expressão durante a semana de 4-6 do desenvolvimento embrionário humano de um exame funcional. Examinamos se a expressão dos três HES-miRNAs difere significativamente entre vários tumores humanos eo tecido normal correspondente.

Usando o MC5003 microsséries de tecido e sondas altamente específicos e sensíveis oligonucleotídeos modificados por LNA, os perfis da expressão 3 miRNAs em tecidos normais e cancerosos foram detectadas utilizando

in situ

hibridização. sondas U6 snoRNA e precipitação-miR foram utilizados como sondas de controlo positivo e negativo, respectivamente. Os resultados estatísticos mostram que a expressão de HSA-miR-638 é significativamente regulada positivamente em tecidos de cancro do fígado hepatocelular (n = 20) versus tecidos hepáticos normais (n = 5) (p = 0,0092), e no colo do útero tecidos de carcinoma de células escamosas ( n = 18) versus tecidos normais do colo do útero (n = 7) (p = 0,0003). Em contraste, a expressão de HSA-miR-638 foi significativamente regulada negativamente em tecidos de adenocarcinoma do estômago (n = 19) versus tecidos normais do estômago (n = 6) (p = 0,0095) (Figura 4A). Esses dados concordam com os resultados de Tsukamoto et al. mostrando regulação negativa deste miRNA no câncer gástrico [90]. HSA-miR-720 de expressão é significativamente regulada positivamente no colo do útero tecidos de carcinoma de células escamosas (n = 18) versus tecidos normais do colo do útero (n = 6) (p = 0,0086), no pulmão tecidos de carcinoma de células escamosas /adenocarcinoma (n = 17) contra tecidos normais do pulmão (n = 6) (p = 0,0386), em tecidos cistadenocarcinoma /adenocarcinoma de ovário (n = 18) versus tecido normal do ovário (n = 6) (p = 0,04045), e nos tecidos de carcinoma urotelial (n = 17 ) versus tecidos normais bexiga urinaria (n = 5) (p = 0,03504) (Figura 4B). Além disso, a expressão de HSA-miR-720 é significativamente regulada negativamente na mucosa intestinal tecidos malignos (n = 19) versus os tecidos normais da pele (n = 9) (p = 0,0017) (Figura 4B). A expressão de HSA-miR-1280 é significativamente regulada negativamente em tecidos de carcinoma de células escamosas da pele da cabeça e pescoço (n = 20) versus tecidos normais da pele (n = 9) (p 0,0001), em tecidos malignos da mucosa intestinal (n = 20 ) versus os tecidos normais da pele (n = 9) (p = 0,0009), e nos tecidos de adenocarcinoma do pâncreas (n = 17) versus tecidos normais do pâncreas (n = 6) (p = 0,0270) (Figura 4C). Em contraste, a expressão de HSA-miR-1280 é significativamente regulada positivamente em tecidos de carcinoma de células escamosas do colo do útero (n = 17) versus tecidos normais do colo do útero (n = 7) (p = 0,01076) (Figura 4C). Exemplos representativos de três miARNs que foram diferencialmente expressos em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais, são mostradas nas Figuras 5, S5, S6, S7 e. Os resultados sugerem que estes HES-miRNAs estão intimamente relacionados com os processos patológicos dos vários tumores.

de alta densidade múltipla tumor órgão e microarrays normais de tecido contendo 500 Tissue-pontos com 18 tipos de tumores e tecidos de controle correspondentes normais . ácido nucleico (LNA) sondas bloqueadas com digoxigenina marcados (LNA-638, LNA-720, e o LNA-1280) foram usadas para detectar especificamente a expressão de miARN no chip tecido. (A) expressão aberrante de hsa-miR-638 em tissue microarray. Significativo a sobre-regulação de miR-638 pode ser observada em cancro do fígado hepatocelular e carcinoma de células escamosas do colo do útero. miR-638 a infra-regulação for encontrado no adenocarcinoma do estômago contra os tecidos normais correspondentes (p = 0,0092, p = 0,0003 e p = 0,0095, respectivamente) (B) a expressão aberrante de HSA-miR-720 em microarrays de tecido. HSA-miR-720 é significativamente regulada positivamente em carcinoma de colo do útero de células escamosas, adenocarcinoma de células escamosas do pulmão, adenocarcinoma do ovário, e carcinoma urotelial contra os tecidos normais correspondentes (P = 0,0086, P = 0,0386, P = 0,0404 e p = 0,035, respectivamente ). HSA-miR-720 é significativamente regulada negativamente em tecidos malignos da mucosa intestinal, em comparação com os tecidos normais da pele (p = 0,0017). (C) expressão aberrante de hsa-miR-1280 em tissue microarray. HSA-miR-1280 é regulada negativamente em carcinoma de células escamosas, tecidos malignos da mucosa intestinal, e adenocarcinoma pancreático contra os tecidos normais correspondentes (p 0,0001, p = 0,0009 e p = 0,0270, respectivamente). HSA-miR-1280 é regulada de forma significativa em tecidos de carcinoma de células escamosas do colo do útero em comparação com tecidos colo do útero normais (p = 0,01076). Os níveis de expressão de miARN (eixo dos y) com uma pontuação = 0, 1, 2, ou 3, indicam negativa, fraca, média ou forte intensidade de coloração, respectivamente. n indica os números dos espécimes estudados. NT indica amostras de tecidos normais; TC indica amostras de tecido de carcinoma. estudante bicaudal

t

testes foram realizados para comparar a expressão miRNA em tecidos normais e cancerosos.

Painéis um tecido do estômago normal, através de amostras de adenocarcinoma show de estômago t e painéis u através z mostra . O sinal de coloração azul indica a expressão de HSA-miR-638. A coloração com vermelho mostra o núcleo da célula (200 um escala que a Figura 5a). j2 mostra maior ampliação (5x) da área indicada na figura 5j, e Z2 mostra maior ampliação (5x) da área indicada na figura 5Z.

Em resumo, os nossos estudos aqui revelam que a expressão níveis da maioria dos miRNAs durante a embriogênese humana são muito baixos. Nós designado 50 (~ 6%) dos 835 miARNs regulados nas semanas 4 a 6 do desenvolvimento embrionário humano como HES-miARNs, e demonstraram que alguns não conservada ou específica primata HES-miARNs estão envolvidos na tumorigénese, apoiando assim a hipótese que compartilha desenvolvimento embrionário inicial muitas semelhanças com o desenvolvimento de câncer no comportamento biológico, bem como molecularmente [22]. No entanto, as funções do HES-miRNAs não-conservada ou específica primata continuam a ser experimentalmente estabelecido, o que nos ajudará a compreender ainda mais a rede de modulação molecular complicada, que ocorre durante o desenvolvimento embrionário humano.

Informações de Apoio

Figura S1.

agrupamento hierárquico análises da expressão de 169 miRNAs exibindo forças de sinal superior a 32 miRNAs (n = 169) foram divididos em 4 grupos: clusters 1, 2, 3 e 4. A seta mostra os miRNAs que foram selecionados ser validado microARN por qRT-PCR (Figura 3). O asterisco mostra o não-conservada ou específicos de primata HES-miRNAs (Figura S4)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s001

(TIF)

Figura S2.

Clustering análises de expressão miRNA (

p Art 0,10) durante o desenvolvimento embrionário humano vermelho e verde indicam os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s002

(TIF)

Figura S3.

Conservada miRNA expressão padrões e características biológicas de homólogos de ratinho-humano durante o desenvolvimento embrionário. agrupamento hierárquico não supervisionado análises de miRNA expressão pro fi les em humanos (semanas 4, 5 e 6, a Figura S3A) e as amostras de embrião de ratinho (E9.5, E10.5 e E11.5, Figura S3B). Os dados de microarranjos de embrião de ratinho foram publicadas em 2006 por Mineno e colegas. A cor em cada estrutura reflete o nível de expressão do miRNA na amostra correspondente. As intensidades crescentes de vermelho indicam que um especi fi c miARN tem uma expressão mais elevada na amostra dada. As intensidades crescentes de verde indicam que este miRNA tem menor expressão. diagramas de Venn retratam os miRNAs de intersecção entre humanos (semanas 4, 5 e 6) e as amostras de embrião de ratinho (E9.5, E10.5 e E11.5) e mostram que 38 e 32 de ratinho-humano miRNAs de homologia foram upregulated (C .) e reprimidos (D), respectivamente, durante o desenvolvimento embrionário humano e rato

doi: 10.1371 /journal.pone.0069230.s003

(TIF)

Figura S4.

Conservação análises do HES-miRNAs. O miRviewer mostra conservação dos genes HES-miRNA, agrupadas pelo nome. Os miRNAs que só podem ser descobertas em primatas humanos ou outros, incluindo miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, e -1280, foram separadas abaixo. As intensidades crescentes de verde indicam que um fi cações c miRNA (ou família miRNA) tem maior conservação da espécie em questão. Os números entre parênteses indicam os números dos miRNAs em uma determinada família miRNA. A maioria compartilhar resultados de conservação semelhantes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s004

(TIF)

Figura S5.

HSA-miR-638 de adenocarcinoma expressão no colo do útero e tecidos normais correspondentes. Painéis um meio t mostram amostras de adenocarcinoma de Colo do Útero e painéis de U através z mostrar tecidos colo do útero normais. O sinal de coloração azul indica a expressão de HSA-miR-638. A coloração vermelha mostra o núcleo da célula (200 um escala que figura S5a)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s005

(TIF)

Figura S6.

HSA-miR-720 de adenocarcinoma expressão no colo do útero e tecidos normais correspondentes.