Sumário

desidrogenases 11β-Hidroxiesteróide (11beta-HSD) modular a transativação do receptor mineralocorticóide por glucocorticóides e regular o acesso ao receptor glicocorticóide. A isozima 11beta-HSD2 é expresso selectivamente em tecidos alvo mineralocorticóides e a sua actividade é reduzida em vários estados de doença com retenção de sódio e anormal hipertensão, incluindo o excesso aparente de mineralocorticóide. Como 50% dos pacientes com hipertensão essencial são resistentes à insulina e hiperinsulinemia, temos a hipótese de que a insulina regula negativamente a atividade 11beta-HSD2. No presente estudo mostram que a insulina reduzida a actividade de 11beta-HSD2 em linhas celulares de cancro do cólon (HCT116, SW620 e HT-29) ao nível da transcrição, num momento e de modo dependente da dose. A regulação negativa foi reversível e exigiu nova síntese protéica. Pathway Analysis utilizando ARNm de perfis revelou que o tratamento com insulina modificado a expressão do factor de transcrição C /EBP família (CCAAT /enhancer proteínas de ligação), mas também de enzimas relacionadas glicólise. Western blot e PCR em tempo real confirmou uma regulação positiva de C /EBP isoformas beta (LAP e LIP) com um aumento mais acentuado no LIP isoforma inibitório. EMSA e ensaios de gene repórter demonstrado o papel da C /EBP beta isoformas em HSD11B2 regulação da expressão gênica. Além disso, a secreção de lactato, um subproduto da glicólise, foi mostrado que medeiam a regulação negativa HSD11B2 insulino-dependente. Em resumo, demonstramos que a insulina regula negativamente HSD11B2 através do aumento da expressão LIP e secreção de lactato aumentada. Tais mecanismos são de interesse e importância potencial para a reabsorção de sódio no cólon

Citation:. Andrieu T, Fustier P, Alikhani-Koupaei R, Ignatova ID, Guettinger A, Frey FJ, et al. (2014) insulina, CCAAT /Proteínas de Ligação Enhancer e lactato Regular a 11β-Hidroxiesteróide desidrogenase tipo humano Expressão 2 Gene em linhas celulares de cancro do cólon. PLoS ONE 9 (8): e105354. doi: 10.1371 /journal.pone.0105354

editor: Jaap A. Joles, University Medical Center Utrecht, Holanda

Recebido: 24 de maio de 2013; Aceito: 23 de julho de 2014; Publicação: 18 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Andrieu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Swiss National Fundação para a Pesquisa Científica Nr. 3100-122135, 3100-61.505,00, 3100A0-102153 /1 e 3100A0-138670 (BMF FJF). Centros Nacionais de Competência em Pesquisa (NCCR), TransCure (FJF). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O receptor mineralocorticóide (MR) é essencial para o manuseio renal de sódio em tecidos epiteliais como cólon e rim e para o controle da pressão arterial em humanos. O ligando fisiológico do MR é aldosterona [1]. Outra esteróide adrenal, o cortisol, exibe uma afinidade e potencial de transactivação semelhante para o MR como aldosterona. As concentrações séricas de cortisol são 100 a 1000 vezes mais elevada do que a aldosterona. O mecanismo que permite a aldosterona a ser o ligante preferido para o MR

In vivo

, apesar das altas concentrações de cortisol é uma enzima que inactiva o cortisol, especificamente em culas que expressam MR [2]. Esta enzima, 11β-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 (11beta-HSD2) é codificada pelo gene HSD11B2 e converte o cortisol biologicamente activo em cortisona, um esteróide com afinidade insignificante e potencial de activação para o MR [3]. Assim, uma reduzida actividade de 11beta-HSD2 provoca a activação mediada MR-cortisol, levando à retenção de sódio renal, supressão de renina e um aumento sensível ao sal na pressão sanguínea [4], [5].

Muitos pacientes com diabetes tipo 2 têm uma baixa actividade da renina no plasma e são sensíveis ao sal [6] – [8]. Além disso, observou-se recentemente uma associação de sal-sensibilidade e atividade reduzida da 11beta-HSD2 em filhos de pacientes diabéticos tipo 2 [9]. Assim, é razoável especular que a insulina regula negativamente HSD11B2, e por este mecanismo, provoca a retenção de sódio renal ou do cólon mediadas por cortisol com supressão de renina consequente.

Tem sido demonstrado que a insulina e hiperinsulinemia que regulam a família de factores de transcrição CCAAT /enhancer proteínas de ligação (C /EBP) [10], [11], e que os membros desta família de controlo da transcrição de HSD11B1 [12] – [14]. A análise do promotor do gene HSD11B2 pelo factor de transcrição de banco de dados de programa (TRANSFAC) revelou vários locais de ligação putativos para C /EBP nas posições -4362 pb, -1985 pb, -177 pb e a -198 bp do sítio de partida da transcrição do gene HSD11B2 humano. Portanto, temos a hipótese de que a insulina down-regula HSD11B2 através do C /EBP.

Material e Métodos

Os reagentes e suprimentos

material de cultura celular foi a partir de Becton Dickinson médico laboratorial (Basileia, Suíça) e Corning (Bodenheim, Alemanha). Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e de Mc Coy foram adquiridos a Sigma Chemicals (Buchs, Suíça). de soro bovino fetal (FBS) foi de Biochrom AG (Berlim, Alemanha). A insulina, ciclo-heximida (CHX), PD098059, dicloroacetato de sódio (DCA), de sódio e lactato L-5,6-diclorobenzimidazole 1β-D-ribofuranósido (DRB) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Fluka AG, Buchs, Suíça). As seguintes linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas, VA): linha celular do carcinoma do cólon humano HT-29 (número de acesso: HTB-38), SW-620 (CLL-227), HCT116 (CCL-247) e células JEG-3 (HTB-36). Akt Inhibitor VIII era de Calbiochem (Merck, Zug, Suiça). Adenosina 5′-trifosfato [gama-

32 P] ([gamma

32 P] ATP) foi da Perkin Elmer (Maanstraat, Holanda).

Cell Cultures

HCT116, SW-620 e HT-29 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mmol /L glutamato, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C em ar humidif içado a 5% CO2-95%. Todas as linhas celulares foram semeadas em placas de cultura de célula e cultivadas em DMEM FBS a 10% até à confluência. As células foram incubadas em DMEM suplementado com FBS a 0,3% durante o tratamento de insulina e DCA. As células foram tratadas 48 h com DCA e 24 h com insulina. As células foram incubadas com FBS a 10% durante o tratamento de lactato depois de 24 h a sincronização em DMEM 0,3% de FBS.

preparação de ARN e o nível de expressão

O ARN total foi isolado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen AG, Basileia , Suíça) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total (1 ug) foi utilizado para a síntese da primeira cadeia de ADNc utilizando o IMPROM II-transcriptase reversa (RT) em tampão de RT (Promega Catalys AG, Wallisellen, Suíça) de acordo com o protocolo do fabricante. Expressão de ARNm específica foi determinada por quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR) num Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Multiplex PCR foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ensaios-on-Demand (Gene Expression Assay Mix) foram eucarióticas 18S rRNA controle endógeno (4310893E), HSD11B2 (Hs00388669_m1), CCAAT /ligação potenciador de proteínas (C /EBP) alfa (Hs00269972_s1), C /EBP beta (Hs00270923_s1) e C /EBP delta (Hs00270931_s1). a expressão do gene relativa foi determinada usando o método comparativo CT (ciclo limite), que consiste em a normalização do número de cópias do gene alvo a um gene de referência endógena (ARNr 18S), designadas como calibrador. O nível de HSD11B2, alfa C /EBP, beta C /EBP e C /EBP expressão de ARNm de Delta de cada uma das células tratadas foi normalizada para o resultado obtido a partir de células não tratadas. A quantidade de alvo normalizado para a referência endógena 18S rRNA é dada pela fórmula: 2

-ΔΔCT. Para confirmar a reprodutibilidade da determinação de ARNm, foram realizados um mínimo de 3 extracções de ARN total independentes. Cada reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa de ensaio (RT-PCR) foi analisada em triplicado e expressas como média +/- DP.

Medição da actividade de 11beta-HSD2

As células foram cultivadas em 6- bem placas a uma densidade de 0,5 x 10

6 células /poço. Após o tratamento, o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas durante 45 min em 1 ml de meio contendo 2 uCi de [1,2,6,7-

3H] O cortisol (60-80Ci /mmol, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) em placas de 6 poços. Após a incubação, a reacção foi parada e os esteróides foram extraídos por adição de três volumes de acetato de etilo. Após centrifugação, a fase orgânica foi removida e evaporada à temperatura ambiente. O resíduo foi reconstituído em 30 ul de solução de paragem (cortisol 2 mM e 2 mM de cortisona em metanol). Dez microlitros foram aplicadas a placas revestidas com sílica (TLC G-25, 254nm, Macherey-Nagel, Oensingen, Suíça) e resolvidos utilizando clorofórmio: etanol (09:01). Os esteróides foram visualizadas sob luz ultravioleta e foram raspadas para fluido de cintilação. A radioactividade foi medida utilizando um Packard 2000CA Tri-Carb Analisador de Cintilação Líquida (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL). As experiências foram efectuadas sob condições não-limitantes de substrato, onde o metabolismo foi sempre inferior a 40%. A actividade específica foi expressa como picomoles (pmoles) por microgramas de proteína por hora. Os resultados experimentais foram calculada expressando as taxas de conversão de cortisol em cortisona na presença de insulina, como uma percentagem do que no controlo correspondente na ausência de insulina [15].

análise de Western blot

extração de proteínas e Western blot foram realizados conforme relatado anteriormente [16]. Resumidamente, os extractos nucleares foram isolados com o protocolo CelLytic nuclear de extracção (Sigma Chemicals, Buchs, Suíça). Para a análise de transferência de Western, a proteína total (100 ug) e extractos nucleares (60 ug) foram carregadas num gel de poliacrilamida desnaturante a 10%. A membrana foi bloqueada durante a noite e incubadas com anticorpo policlonal de coelho para 11beta-HSD2 (H-145,1:500), alfa C /EBP (SC-61X, 1:5000), C /EBP beta (SC-150X, 1: 5000), β-actina (SC-1616R, 1:500) ou HDAC1 (SC-7872, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). membranas de nitrocelulose lavadas foram incubadas com um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado de IgG peroxidase de rábano (sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e desenvolvido usando quimioluminescência aumentada (ECL) reagente (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). A densitometria de películas expostas foi realizada e o nível de proteína expressa em unidades arbitrárias.

Para a detecção de células de insulina e IGF1 receptores foram ou não tratados ou tratados com 100 nM de insulina durante 24 horas e lisaram-se em tampão RIPA contendo 1 mM ortovanadato de sódio, 2 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de leupeptina, 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo. Os lisados ​​foram incubados com anticorpos da insulina aos receptores (3027, 3025, Cell Signaling) IGFR ou a 4 ° C durante a noite. De manhã, as amostras foram incubadas com proteína A /G Plus Agarose (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a 40 ° C. As esferas foram lavadas, fervidas em tampão de carga de SDS e as proteínas foram separadas por SDS-PAGE.

De Novo

síntese de proteínas

células HT-29 foram cultivadas como descrito acima e pré-tratados com o inibidor da síntese de proteína (ou alongamento de translação), CHX (10 uM) durante 1 h antes da adição de insulina (10

-7 M). No final das 24 h de tratamento, as células foram recolhidas para isolamento de ARN e análise de qRT-PCR.

HSD11B2 ARNm estabilidade

células HT-29 foram cultivadas como descrito acima e tratadas com insulina ( 10

-7 M) durante 12 h. A transcrição foi parada com DRB (25 pM) e as células foram recolhidas em momentos discretos (0-12 h) para o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR.

pequeno ARN interferente (siRNA) experimentos

as células HT-29 foram transf ectadas transitoriamente utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as recomendações do fabricante. A mistura de transfecção foi removido após 24 h de incubação. As células foram ainda incubadas sob condições normais de crescimento durante mais 24 h antes da extracção de ARNm. Os ARNic em cadeia dupla para C alfa /beta EBP ou C /EBP (Qiagen AG, Basileia, Suíça) e um controlo negativo de siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram usadas para transfecção com uma concentração final de 50 nM.

eletroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA) e preparação de extracto nuclear

Cerca de cinco milhões de células aderentes foram destacadas com 3 ml de PBS em gelo e foram peletizadas por 5 min a 900 g. Os sedimentos foram armazenados a -80 ° C até à extracção de proteínas. preparação de extracto nuclear e EMSA foram realizados como previamente descrito [17], [18]. O rendimento de proteína foi determinada pelo método de Bradford. EMSA sondas foram geradas por emparelhamento oligonucleótidos de cadeia simples complementares e marcadas com [gama

32P] ATP e quinase de polinucleótido T4. A ligação específica foi competiu com os oligonucleótidos não marcados cuja sequência está reconhecidos pelos fatores C /EBP em um excesso de 100X-molar (5′-tgcagattgcgcaatctgca-3 ‘; os motivos de nucleótidos de interesse estão em negrito). As reacções de ligação foram realizadas em 10 ul de tampão [20 mM de HEPES, pH 7,5; NaCl 35 mM; KCl 60 mM; 0,01% de NP 40; 2 mM de DTT; 0,1 mg /ml de BSA; 4% de Ficoll] contendo 1,75 pmol de sonda marcada, 4 ug de proteínas nucleares e 1? G de poli (dI-dC). As misturas foram incubadas a 4 ° C durante 20 minutos na presença ou ausência de competidor não marcado. complexos DNA-proteína foram separados num gel de poliacrilamida a 5% em 0,5 × tampão de Tris-borato-EDTA durante 90 min a 140 V. Os geles foram secos 2 h a 80 ° C e analisadas num Phosphoimager ciclone (Packard).

Cromatina imunoprecipitação

ensaios ChIP foram realizadas de acordo com as instruções da Upstate Biotechnology Inc conforme relatado anteriormente [18]. Os fragmentos de ADN purificados foram amplificadas com os iniciadores de PCR para detectar um fragmento de 210 pb contendo a -177C /EBP, locais de -198C /EBP no promotor HSD11B2 (para a frente: 5′-GCAACTTTGGGACTTTGTTCCGGC-3 ‘; reverso: 5′-AGAGGGACACTCGCTTTCTCTGCT-3’ ).

qRT-PCR análise utilizando diabetes humana RT

2 Profiler PCR Arrays

O RT

2 Profiler Arrays PCR HAP-30C (SA Biosciences, MD, EUA) foi concebido para analisar 84 genes relacionados com a via de sinalização da insulina humana. A RT-PCR foi realizada utilizando um sistema ABI Prism 7000 Sequence Detection (Applied Biosystems, Foster City, CA). Células HT-29 foram tratadas durante 24 h com insulina (10

-7 M). O ARN total (1 ug) foi utilizada como molde para sintetizar ADNc com a RT

2 First Strand kit (SABiosciences). A condição ciclo de PCR foi como se segue: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 60 s. No final das etapas dos ciclos de PCR, os dados para cada amostra foram apresentados como uma curva de fusão. O software ABI SDS (Applied Biosystems) foi utilizado para determinar um limiar crítico (Ct), o qual foi o número do ciclo em que a fase linear para cada amostra atravessado o nível de limiar. Beta-2-microglobulina foi usado como gene de manutenção. A expressão de HSD11B2 para os 3 experimentos em questão foi monitorada em paralelo por PCR em tempo real, que confirma a regulação baixa significativa pela insulina. Os registros foram depostos na base de dados GEO com o número de acesso GSE51677.

transfecção transitória e gene repórter ensaio

As transfecções foram realizadas com FuGENE HD reagente de transfecção (Roche, Rotkreuz, Suíça) com 3 ml de solução de 1 mg de plasmídeo. O vector pCMV-HRL (

Renilla reniformis luciferase

) (Promega Catalys AG, Wallisellen, Suíça) foi utilizado para a normalização da eficiência de transfecção. A construção P4.5 kb-HSD11B2 foi uma oferta generosa da de. K. Yang [19]. A construção de plasmídeo p0.2 KB-HSD11B2 foi descrito anteriormente [18]. Para a expressão de factores de transcrição, diversas quantidades dos vectores pCMV-LIP e pCMV-LAP, uma oferta generosa do U. Schibler [20], foram adicionados à mistura de DNA. Após 6 h o meio de transfecção foi substituído por meio normal de crescimento durante 18 h. Em seguida as células foram lisadas e as actividades da luciferase foram detectados com o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega Catalys AG, Wallisellen, Suíça) e MediatorsPhL Luminómetro (Diagnostic Systems mediadores, Viena, Áustria). a actividade da luciferase de pirilampo foi expressa em relação à luciferase de Renilla para explicar as diferenças na eficiência de transfecção. Quando um controlo de vector de CMV-LacZ foi transfectado, de dupla luz sistema (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado para determinar a actividade da luciferase. As transfecções foram confirmadas por múltiplas experiências independentes.

mutagénese dirigida ao local

promotoras mutantes HSD11B2 foram gerados no P4.5 KB-HSD11B2 p0.2 e KB-HSD11B2 construções usando local QuikChange II XL kit de mutagénese -directed (Stratagene, Basileia, Suíça). Foram utilizados os seguintes iniciadores: 5′-GTGGAACTTGAGAGCTCGAGCAGTTCCCTTCACCTCTGG-3 ‘e 5′-CCAGAGGTGAAGGGAACTGCTCGAGCTCTCAAGTTCCAC-3′ para a -4362 C /EBP e 5’-CTCGAGCGCAGCCGCTCCAGGACTTTGTTCCGGCTTTTTC-3 ‘e 5′-GAAAAAGCCGGAACAAAGTCCTGGAGCGGCTGCGCTCGAG- 3’ para -198 C /EBP. Sublinhado e letras em negrito representam bases mutado.

Bioinformatics e estatísticas

Os dados são expressos como média +/- desvio padrão de amostras em triplicado de uma experiência representativa repetido pelo menos três vezes. A análise estatística foi realizada utilizando

t

teste de Student ou análise de variância e foi seguido por um teste de contraste com proteção de erro de Tukey. foram consideradas significativas diferenças em

p Art 0,05, *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p

0,001. Transcrição fator de locais de ligação foram analisados ​​com o programa Match.

Resultados

tratamento com insulina sustentado diminui 11beta-HSD2 atividade e expressão gênica HSD11B2 em linhas celulares de cancro do cólon

Regulamento de enzima actividade pela insulina foi examinada em HSD11B2 que expressa [16] – [18], [21] linhas de células do cólon humano (HCT116, SW620 e HT-29) (Fig. 1A). As células foram incubadas durante 24 h com insulina (10

-11 H-10

-7 M) em meio de cultura celular contendo 0,3% de FBS. A insulina provocou um decréscimo de resposta à dose da actividade da 11beta-HSD2 em todas as linhas de células do cólon testados com uma redução significativa em 10

-9 M em linha celular HCT116 (

P

0,05). Este efeito não foi restringida às linhas de células do cólon desde que foram obtidos resultados semelhantes com HSD11B2 que expressa [19] células JEG-3 (Fig. S1). Devido à forte resposta (redução ≈30%), caracterizamos os mecanismos moleculares em células HT-29.

(

A

) atividade 11beta-HSD2 foi medida por

3H -cortisol /ensaio de conversão de cortisona em linhas de células do cólon de 24 h após a incubação com insulina (10

-11-10

-7 M). A actividade medida para HCT116 na ausência de insulina foi definido como 100%. (

B

) efeito dose-resposta de insulina (10

-9-10

-5 M) em mRNA HSD11B2 (barras cinza) e atividade (curva) em células HT-29 tratados por 24 h. (

C

) efeito dependente do tempo de insulina (10

-7 M) em mRNA HSD11B2 (barras cinza) e atividade (curva) em células HT-29. (

D

) efeito dependente do tempo de insulina (10

-7 M) em nível de proteína 11beta-HSD2.

tratamento sustentado de insulina diminui gene HSD11B2 expressão, atividade e proteína em células HT-29 em uma dose e dependente do tempo maneira

próxima confirmado se a actividade de 11beta-HSD2 reduzida de insulina coincide com o seu gene e a expressão de proteína (Fig. 1A). O aumento das concentrações de insulina que varia de 10

-9 a 10

-5 M causou uma diminuição dependente da concentração nos níveis de ARNm HSD11B2 24 h após o tratamento (Fig. 1B). Observou-se um efeito máximo na concentração de 10

-7 M, em que o ARNm HSD11B2 foi reduzido em 50% (

P

0,05) (Figura 1B.); e a actividade em 35% (

P

0,05) (Figura 1B.). Em seguida, investigámos o efeito regulador em função do tempo de insulina sobre a expressão do gene HSD11B2, actividade, e o nível de proteína. Como mostrado na Figura 1C, uma diminuição dependente do tempo da actividade da 11beta-HSD2 foi observada com uma redução significativa de 12 h após o tratamento (

P

0,05). Curiosamente o mRNA HSD11B2 aumentou durante os primeiros 10 h e diminuiu em seguida. Após 16 h, o ARNm atingiu níveis mínimos e manteve-se baixa até 48 h (

P

0,05) (Fig. 1C). Em acordo, a proteína HSD11B2 foi reduzida por 18 h e 24 h de tratamento com insulina (Fig. 1D).

A regulação negativa da HSD11B2 foi reversível pela remoção de insulina a partir do meio 24 horas após a incubação. Com efeito, 48 horas após a remoção, os níveis de ARNm em HSD11B2 controlo e tratados com insulina condições foram semelhantes (Fig. 2A). Em seguida, células HT-29 foram tratados 24 h com insulina na ausência e presença do inibidor da síntese de proteína, ciclo-heximida (CHX). O efeito da insulina na redução ARNm HSD11B2 foi abolida na presença de CHX, indicando que

de novo a síntese da proteína foi necessária (Fig. 2B). Para determinar se a insulina reduz a estabilidade do mRNA HSD11B2, avaliou-se a meia-vida do ARNm HSD11B2 por um ensaio de ARNm de decaimento padrão usando 25 uM FAD, um inibidor de síntese de ARNm. Tal como mostrado na Figura 2C, a insulina não altera a meia-vida do ARNm HSD11B2.

(

Um

) a actividade de 11beta-HSD2 foi medida em células HT-29 na presença (barras negras) e na ausência (barras brancas) de insulina 10

@ 7 M durante 24 h. O efeito da insulina foi reversível com a lavagem com PBS 24 h ou 48 h de follow-up (barras tracejadas). (

B

) HSD11B2 expressão foi avaliada por qRT-PCR em HT-29 pré-tratada com o inibidor de síntese de proteínas CHX (10 uM) durante 1 h e tratou-se com insulina (10

-7 M) durante 24 h. Cada ponto de dados é expressa como uma percentagem do valor de controlo. (

C

) células HT-29 foram pré-tratados com (círculos a cheio) ou sem (losango preenchido), insulina (10

-7 M) durante 12 h. As células foram então tratadas com 25 uM do inibidor de síntese de ARNm DRB, sem ou com insulina (10

@ 7 M) (definido como tempo zero). Nos pontos de tempo indicados seguidamente, o ARN total foi isolado, e o nível de estado estacionário de ARNm HSD11B2 avaliada. Cada ponto de dados é expressa como uma percentagem do máximo determinado no tempo zero.

A insulina via análise

A fim de compreender o mecanismo molecular pelo qual a insulina regula negativamente HSD11B2 que visa para caracterizar a via de insulina em HT-29. experiências de Western blot demonstrou a expressão e activação de IGF-1 (IGFI-R) e receptores de insulina (RI) de um modo dependente do tempo e da dose (Fig. 3 A, B). Ambos os receptores são fosforilados dentro dos primeiros 10 minutos após o tratamento com insulina, enquanto IR foi mais sensível do que IGFI-R para baixas doses de insulina (Fig. 3 A, B). O papel das cinases a jusante na repressão HSD11B2 dependente de insulina foi avaliada utilizando inibidores PD098059 e AKT VIII. A Figura 3C mostra que ambas as vias, a MAPK /ERK e a via PI3K, mediado o efeito da insulina.

(

Um

) Expressão e fosforilação do receptor da insulina pela insulina em um tempo (0 a 60 min) e da dose (0 a 1000 nM) forma dependente. (

B

) Expressão e fosforilação do receptor de IGF-1 por insulina em um momento e de modo dependente da dose. (

C

) HSD11B2 expressão de mRNA monitorado por qRT-PCR em presença de insulina, inibidor de AKT (AKTVIII, 0,1 mM e 10 mM) ou inibidor MEK (PD098059, 1 M).

ARNm total de células HT-29 tratados com insulina, foi extraído e submetido a RT

2 perfilar para quantificar a expressão de componentes da via de insulina. A Insulina Humana via de sinalização RT

2 Profiler PCR matriz perfis da expressão de 84 genes relacionados com genes de insulina-responsivo. Vinte e dois genes regulados diferencialmente em células HT-29 após tratamento com insulina são apresentados na Tabela S1 e as vias envolvidas são representadas no esquema da Figura 4. A RT

2 Profiler revelaram um padrão característico de insensibilidade à insulina, com uma expressão reduzida de insulina componentes da via: IR, IGFI-R, do substrato do receptor da insulina (IRS2) e insulina regulado de transportadores de glicose (GLUT-4). tratamento com insulina sustentada também promoveu a glicólise em células HT-29. Enquanto insulina regulado transportador de glucose GLUT-4 expressão foi regulada negativamente, GLUT-1 que codifica mensageiro foi aumentada, facilitando a importação de glicose nas células, independentemente da estimulação do factor de crescimento. 2 hexoquinase, a enzima que fosforila a glicose em glicose-6-P, um passo limitante da taxa de glicólise, foi regulado para cima, juntamente com piruvato-quinase 2 (PKM2), que converte piruvato em PEP. Em contraste, o enzima que desfosforilado frutose 1, 6-bifosfato em frutose-6-fosfato e contribuiu para antagonizar a glicólise foi regulada negativamente.

mRNAs foram quantificados 24 h após o tratamento com insulina (10

-7 M) usando RT

2 Profiler Arrays PCR HAP-30C. -Regulada transcrições são mostrados em vermelho e transcrições regulada para baixo são mostrados em verde.

Efeito da insulina na alfa C /EBP, beta C /EBP, e os níveis de C /EBP delta mRNA

apresentamos provas na Figura 5B, que o tratamento de células HT-29 com várias concentrações de insulina (10

-9-10

@ 5 M) durante 24 horas provocou um aumento dependente da concentração em C /EBP expressão de ARNm de beta. Em contraste, a insulina suprimiu a expressão de C /EBP alfa expressão de ARNm de uma forma dependente da dose. A uma concentração de 10

-7 M, insulina diminuiu o ARNm de alfa C /EBP em 51% (

P

0,01), ao passo que C /EBP expressão de ARNm de delta foi inalterada. Estes resultados mostram que a redução dependente de insulina de ARNm HSD11B2, correlaciona-se com o padrão de 2 fora de 3 investigados os membros da família C /EBP de factores de transcrição em células HT-29 de expressão.

(

A

) efeitos dependentes da concentração de insulina no 11beta-HSD2, alfa C /EBP, e os níveis de proteína beta C /EBP. Células HT-29 foram cultivadas durante 24 h, sem e com concentrações crescentes de insulina (10

-9-10

-5 M), em seguida, colhidas para transferência de Western para avaliar a expressão de 11beta-HSD2, alfa C /EBP , C /EBP beta. (

B

) efeitos dependentes da concentração de insulina no alfa C /EBP, beta C /EBP, e a expressão de ARNm de delta C /EBP. Células HT-29 foram tratadas como em (A). O nível de alfa C /EBP (círculos abertos), beta C /EBP (quadrados abertos), e C da EBP delta /(triângulos a cheio) ARNm foi medido utilizando qRT-PCR com S18 como controlo interno. Os níveis de expressão em células tratadas foram normalizados com os controlos não tratados (100%). Os dados representativos de pelo menos três experiências independentes. A intensidade relativa foi determinada por varrimento de densitometria. A razão entre as densidades relativas de 11beta-HSD2 de beta-actina em células cultivadas na abscence de hormona foi considerada como 100% (controlo). A relação das densidades relativas das proteínas de extracto nuclear de HDAC em células cultivadas sem a hormona foi considerada como 100% (controlo). * LIP não foi detectada em amostras de controlo, de modo que a relação de LAP /LIP não foi calculado. (

C, D

) Silenciamento de alfa C /EBP (

C

) e beta C /EBP (

D)

foi realizada utilizando siRNA. A expressão de alfa C /EBP, beta C /EBP (painel da esquerda) e HSD11B2 (painel da direita) ARNm foi medido utilizando qRT-PCR.

A insulina-regulação de alfa C /EBP e C /proteínas EBP beta

Para investigar se a C /EBP alfa ou beta C /EBP desempenhar um papel na repressão insulino-dependente da expressão do gene HSD11B2, a expressão de alfa C /EBP e C beta /EBP em HT- 29 As células foram analisados ​​por manchas de Western (Fig. 5a). mRNA de C /EBP alfa pode levar a dois polipéptidos com um tamanho de 42 kDa e 30 kDa [22], [23] enquanto a C /EBP beta pode evoluir para uma activação ou uma isoforma de inibidor (LAP, 38 kD ou LIP, 21 kDa , respectivamente) [20], [24]. O tratamento de células HT-29 com insulina durante 24 h aumentou os níveis nucleares de C alpha /EBP (isoforma 42 kDa), de ambos C beta /EBP isoformas LAP e LIP, e diminuiu os níveis nucleares de C alpha /EBP (isoforma 30 kDa) de uma forma dependente da dose. Em paralelo, a expressão de HSD11B2 decresceu concomitantemente com um efeito máximo obtido a 10

-6 M de insulina (Fig. 5A). No entanto, em resposta à mesma dose de insulina, o aumento da LIP (≈130 dobra em 10

-6 M de insulina) foi maior do que no colo (≈3 dobra em 10

-6 M de insulina), resultando em uma razão de LAP /LIP decrescente (Fig. 5A). Expressão de C /EBP alfa (isoforma de 42 kDa) foi ligeiramente aumentada, enquanto a expressão de alfa C /EBP (isoforma de 30 kDa) foi reduzida em 50% (Fig. 5A).

expressão do gene é para cima HSD11B2 regulamentado pela C /EBP alpha /beta silenciar

O efeito do C /EBP alpha /beta knockdown em HSD11B2 foi avaliada em células HT-29. Existem evidências a partir desta experiência de transfecção siRNA que C alfa /EBP e ARNm /EBP beta C foi significativamente regulada negativamente (Fig. 5C, D, painel esquerdo). É importante ressaltar que os níveis de mRNA de HSD11B2 aumentou após transfecção com siRNA contra ambas as isoformas (Fig. 5C, D, painel da direita).

regulação da insulina de complexos /EBP-DNA C

O

in silico

análise da sequência do promotor do gene humano revelou HSD11B2 4 sítios de ligação putativos para C /EBP localizados nas posições -4361, -1985, -198 e -177 pb do local de início da transcrição (Tabela 1). O local -4361 tem a correspondência maior com a sequência de consenso (Tabela 1). Diferentes sondas foram marcadas e incubaram-se na presença de extractos nucleares a partir de isolados tratados com insulina células HT-29. EMSA realizada com a sonda contendo o consenso C /EBP local de ligação revelou três complexos específicos (Fig. 6A, pista 1, observou C1-3). Os sinais foram revertidos pela competição com a sonda não marcada abrigar o site /EBP consenso C (Fig. 6A, pista 6), enquanto afetado quando a sonda abrigava os locais C /EBP mutantes (Fig. 6A, pista 7). Portanto, os sinais C1-3 pode corresponder a complexos /EBP /DNA C. A C /EBP ligação com a sonda de consenso foi elevado com o aumento da duração do tratamento com insulina (Fig. 6A, pistas 1-5) que reflecte o aumento do nível de beta C /EBP encontrado por Western blot (Fig. 5A). Curiosamente, a intensidade de C2 aumentou mais do que C1, C2 sendo mais abundante relativamente a C1 24 h após o tratamento com insulina do que nos controlos (pistas 1, 5).

(A) As proteínas nucleares isolados de HT -29 células ligam-se a C /EBP locais alpha /beta identificados.

4 ug de extractos nucleares isoladas de insulina tratados (para o período de tempo indicado, 10

-7 M) ou HT-29 células não tratadas foram incubadas com a sonda marcada radioactivamente que engloba o local de consenso C /EBP alfa /beta na presença ou ausência de sonda de não-marcado radioactivamente concorrente (100 ×) (contras C /EBP alfa /beta ou mut C /EBP alfa /beta) (lanes1-7) . As setas indicam a C /EBP alfa /beta /turnos de ADN (C1, C2, C3) separadas da sonda livre por electroforese em gel.