Abstract

Objectivo

monócitos e macrófagos podem se infiltrar em microambiente do tumor e regular a progressão de tumores. Este estudo teve como objetivo determinar a frequência dos diferentes subgrupos de monócitos e macrófagos infiltrantes tumorais (TIMS) em pacientes que circula com câncer colorretal (CRC).

Métodos

A frequência de diferentes subconjuntos de monócitos circulantes foi caracterizado em 46 pacientes de CRC e 22 controlos saudáveis ​​(HC) por citometria de fluxo. A frequência de diferentes subconjuntos de macrófagos foi analisada em TIMs de 30 tecidos tumorais e em células mononucleares da lâmina própria (LPMCs) a partir de 12 tecidos não-tumorais. Determinaram-se as concentrações de citoquinas no plasma e antigénio carcinoembrionário (CEA). Foi analisada a associação potencial destas medidas com os valores dos parâmetros clínicos.

Resultados

Em comparação com os do HC, as percentagens de circulantes CD14

+ CD169

+ , CD14

+ CD169

+ CD163

+ e CD14

+ CD169

+ CD206

+ monócitos e TIMs CD14

+ CD169

+, bem como IL 10

+ CD14

+ CD169

+, mas não IL-12

+ CD14

+ CD169

+ macrófagos foram significativamente aumentada, acompanhada de níveis mais altos de IL-10 plasma em os pacientes de CRC. As percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e macrófagos TIM foram associados com o estágio da doença e positivamente correlacionada com os níveis de IL-10 plasma e CEA em pacientes com CCR.

Conclusão

os nossos dados sugerem que o aumento na frequência de células CD14

+ CD169

+ células podem estar associados com o desenvolvimento e progressão de CRC e é subida concomitante de ambos, pró-tumoral (M2-like , a produção de IL-10) e anti-tumoral (M1 semelhante, IL-12 produzindo) monócitos e macrófagos infiltrantes. A frequência de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e macrófagos infiltrantes pode servir como um biomarcador para avaliar os graus patogênicos da CRC

Citation:. Li C, Luo X, Y Lin, Tang X , Ling L, Wang L, et ai. (2015) uma maior frequência de CD14

+ CD169

+ monócitos /macrófagos em pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 10 (10): e0141817. doi: 10.1371 /journal.pone.0141817

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 22 de maio de 2015; Aceito: 13 de outubro de 2015; Publicação: 28 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos tumores malignos mais comuns com uma elevada mortalidade. Sua incidência está a aumentar em muitos países e CRC afeta 1,2 milhões de pessoas anualmente em todo o mundo [1]. Estudos anteriores demonstraram que o desenvolvimento e progressão de CRC estão associados com a inflamação local [2-5]. Com efeito, diferentes tipos de infiltrados inflamatórios, particularmente para os macrófagos, estão presentes nos tecidos de CRC e o equilíbrio de protumor e antitumorais infiltrados inflamatórios é pensado para ser crítica para o desenvolvimento, progressão e invasão de CRC [3-4, 6]. Assim, a ilustração de diferentes tipos de infiltrados inflamatórios e suas funções potenciais será de grande importância na compreensão da patogenia da CRC.

macrófagos, células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs) no sistema imune inato, são o a maioria da população celular imunológica abundante no microambiente tumoral [7, 8], e desempenham um papel crucial na regulação da homeostase do tecido e estado imunitário. Os macrófagos nos tecidos do intestino pode ser desde a sua auto-renovação [9] e pode também resultar da migração de monócitos para a lâmina própria do intestino, manter a homeostase intestinal [10, 11]. Os macrófagos podem ser classicamente activado em células M1 que expressam indutível oxidase nítrico (iNOS), IL-12 e níveis elevados de moléculas co-estimuladoras, enquanto macrófagos teciduais residentes e macrófagos associados a tumores são susceptíveis de expressar CD163, 206, arginase e IL-10 , um fenótipo M2 [12-17]. Além disso, macrófagos, monócitos como os seus parentais, expressam CD14, um co-receptor de RST4, o qual tem sido vulgarmente utilizada para identificar macrófagos e monócitos a partir de mucosa intestinal e no sangue periférico [18, 19]. Os monócitos e macrófagos infiltrantes tumorais (TIM) também expressam CD169, sialoadesina, uma molécula de adesão celular [20] e MAC387, um marcador de macrófagos imaturos [21]. CD169

+ macrófagos são jogadores importantes na iniciação e progressão de doenças inflamatórias e auto-imunes [22]. Além disso, CD169

macrófagos e monócitos + ter sido pensado para dominar a imunidade pro-inflamação [22-25]. Estudos anteriores demonstraram que as células M2 no ambiente tumoral estão associados com a progressão e metástase de câncer [15, 26-27]. Além disso, CD169

+ macrófagos nos gânglios linfáticos regionais estão associados com um prognóstico em pacientes de CRC [28]. No entanto, o tipo de macrófagos no ambiente do tumor está associada com a progressão da CRC permanece controverso. Foi confirmado que a CD169

+ macrófagos saída na própria lâmina do cólon, principalmente circundante das criptas e o seu desenvolvimento é suportada por vitamina A em murganhos [29]. A frequência de circulação de CD169

monócitos + e macrófagos infiltrantes tumorais no CRC e sua potencial associação com a progressão da CRC não foram esclarecidos.

No estudo atual, nós caracterizamos a frequência de diferentes subconjuntos de CD14

+ CD169

+ células em monócitos circulantes e em TIMs por citometria de fluxo e detectados os níveis de IL-10 no plasma e IL-12, bem como o antigénio carcinoembrionário (CEA), em pacientes de CRC. Além disso, analisamos o potencial associação das percentagens de CD14 circulando

+ CD169

+ monócitos e TIMs com os níveis de citocinas e CEA, bem como os parâmetros clínicos em pacientes com CCR. Encontramos aumentou significativamente percentagens de CD14

+ CD169

+ em ambos os monócitos circulantes e TIMs de pacientes com CCR. Além disso, as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e TIMs foram associados positivamente com os estágios patogênicos da CRC e correlacionados com os níveis de IL-10 plasma e CEA em pacientes com CCR. Assim, os nossos dados apoiam a noção de que um aumento na frequência de células CD14

+ CD169

+ células podem estar associados com o desenvolvimento e progressão de CRC e é subida concomitante de ambos pró-tumoral (M2-like, IL -10 produzindo), bem como anti-tumoral (M1 semelhante, IL-12 produzindo) monócitos e macrófagos infiltrantes do tumor.

Materiais e Métodos

sujeitos e amostras

o consentimento informado foi obtido de participantes individuais. O protocolo experimental foi estabelecida, de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana da Universidade de Jilin (Jilin University, Changchun, China). Um total de 46 pacientes com CRC foram recrutados no serviço de internamento do Departamento de Colorectal Cirurgia Anal, o Primeiro Hospital, Universidade de Jilin a partir de fevereiro de 2013 a dezembro de 2014. pacientes individuais foram diagnosticados pelo teste positivo fecal de sangue oculto, exame histológico em tecidos tumorais de biopsia obtido durante a colonoscopia, e uma tomografia computadorizada (CT). amostras de tumores individuais foram avaliadas quanto à sua classificação do tumor, grau histológico, e linfa estado de metástase por patologistas de forma cega e encenado, de acordo com o tumor-nódulo-metástase (TNM) sistema de classificação da União Internacional contra o Câncer (Edição 7) [ ,,,0],30]. Para a análise de estratificação, os pacientes com a fase I /II de CRC foram consideradas na fase inicial, enquanto aqueles com estágio III /IV da CRC foram considerados em estágio avançado. pacientes individuais foram excluídos se ela /ele recebeu radioterapia, quimioterapia ou imunoterapia. Além disso, os pacientes também foram excluídos se ela /ele teve má condição física. Outros 22 indivíduos saudáveis ​​pareados gênero da idade e e 12 indivíduos não-tumorais foram recrutados no Exame Físico Center e outro departamento do mesmo hospital. Todos os participantes não tinham história de cancro, doenças auto-imunes, doenças infecciosas recentes, doenças inflamatórias do intestino e polipose familiar. As amostras de sangue foram obtidas de 46 pacientes novos CRC início, e 22 controlos saudáveis ​​(HC). amostras de tecido de ressecção colorretal cirúrgicos foram obtidos de 30 pacientes com CCR e 12 controles não-tumorais, que foram submetidos à ressecção cirúrgica de hemorróidas mistas. A inflamação pode ser associada com o desenvolvimento de hemorróidas. No entanto, um estudo prévio que identificou hemorróidas não parece estar associada com um risco aumentado de cancro anal [31] e a natureza de inflamação entre os ambientes de CRC e hemorróidas é diferente. É razoável utilizar estes tecidos como os controlos não-tumorais no nosso estudo. Os dados demográficos e clínicos dos participantes individuais foram coletados de registros hospitalares e revisado por cirurgiões experientes. As características demográficas e clínicos são apresentados na Tabela 1.

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

Jejum amostras de sangue venoso foram colhidas a partir de participantes individuais, e uma porção de sangue foi utilizado para a preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por centrifugação em gradiente de densidade utilizando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). As restantes amostras de sangue foram centrifugadas para a preparação de amostras de plasma.

Isolamento de células mononucleares da lâmina própria (LPMCs) e MTE

O mononucleares da lâmina própria (LPMCs células) foram isolados a partir 12 daqueles não-tumoral pacientes e MTE foram isolados a partir de 30 amostras de tumores ressecados cirúrgicos recentemente, tal como descrito anteriormente com pequenas modificações [29, 32]. Resumidamente, a mucosa recém ressecado ou tecidos CRC foram processados ​​dentro de 30 minutos após a sua recolha e incubou-se em cálcio e contendo 2,5% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor isento de magnésio solução salina equilibrada de Hanks (HBSS, Sigma-Aldrich) (FBS) e 1 ditiotreitol mM (Sigma-Aldrich) em gelo. Os tecidos foram incubados em tampão de cálcio e sem magnésio HBSS contendo EDTA 5 mM, ditiotreitol 1 mM, 2,5% de FBS, 0,1% v /v β-mercaptoetanol inactivado pelo calor (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) a 37 ° C durante 25 min, sob agitação constante para remover o muco e de células epiteliais. Subsequentemente, os segmentos restantes foram cortadas em pequenos pedaços e digerido com 250 ug /ml de ADNase (Roche) e 125 ug /ml liberaseTM (Roche) em HBSS a 37 ° durante 30 min, sob agitação constante. Após centrifugação, as células foram re-suspensas com RPMI-1640 e filtrada através de um filtro celular de 40 uM, seguida de carga na superfície de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Após centrifugação a 800 g durante 20 minutos, os LPMCs e TIMs foram recuperados a partir da interface e lavadas com PBS duas vezes por citometria de fluxo.

A citometria de fluxo análise

Para determinar a frequência dos diferentes subconjuntos de CD14

+ células, PBMC ou LPMCs (10

6 células /tubo) foram coradas com Alexa Fluor 647 anti-CD169 (BioLegend), APC-H7-anti-CD14 (BD PharMingen), BV421-anti- CD163 (BD ​​PharMingen) e PerCP-Cy5.5-anti-CD206 (BioLegend) a 4 ° C durante 30 min, respectivamente. Subsequentemente, as células foram fixadas, permeabilizadas e utilizando a solução de permeabilização (BD Biosciences), seguido por coloração intracelular com FITC-conjugado anti-MAC387 (Abcam).

O lipopolissacárido (LPS) pode activar monócitos ou macrófagos, interagindo com RST4 e CD14 e induzir a produção de citoquinas, tais como IL-6, IL-10 e IL-12 [33-34]. Para detectar a função, PBMC ou LPMCs (10

6 células /cavidade) foram estimuladas em duplicado com 50 ng /ml de lipopolissacárido (LPS) e acetato de forbol miristato (PMA) e 1,0 ug /ml de ionomicina (Sigma-Aldrich ) em 10% de FBS meio RPMI-1640 a 37 ° C durante 2 horas em 5% de CO

2 e expostas a Brefeldina a (GolgiPlug; BD Biosciences) durante mais 4 horas, tal como descrito anteriormente no nosso laboratório (21). Depois de ser lavado, foram coradas com Alexa Fluor 647-anti-CD169, a APC-H7-anti-CD14, fixo, e permeabilizadas utilizando a solução de permeabilização, seguido por coloração intracelular com PE-CF594 com anti-IL-10 (JES3-9D7 , BD Biosciences) ou PE-anti-IL-12 (BD Pharmingen). Os controles do mouse isotipo de APC-H7-IgG1, FITC-IgG1, PE-Ig2a, PerCP-Cy5.5-IgG1, PE-CF594-IgG1 e AlexaFluor-IgG1 serviram como controles. As células mononucleares foram fechado de acordo com o tamanho da célula e estrutura interna. Para distinguir melhor positivo de população negativa, foi realizada fluorescência Minus One (FMO), pelo que, as células foram incubadas com todos os fluorocromos, excepto para o que estava a ser medido (CD14, CD169, CD163). A frequência de diferentes subconjuntos de CD14

+ células mononucleares foi determinada por citometria de fluxo em um BD FACSCalibur (Becton Dickinson) e os dados foram analisados ​​utilizando FlowJo 7.6.2.

ensaio imunoenzimático (ELISA)

as concentrações de IL-10 plasma e IL-12p70 em participantes individuais foram determinados por ELISA utilizando IL-10 e IL-12p70 kits ELISA humanos, de acordo com instruções do fabricante (R D Systems ). Resumidamente, o plasma humano foram testadas em triplicado e as concentrações de IL-10 e IL-12p70 em amostras individuais foram calculados, de acordo com as curvas padrão estabelecidos utilizando citocinas recombinantes fornecida.

antigénio carcinoembrionário ensaio (CEA)

As concentrações de CEA plasma em amostras individuais foram determinados utilizando um sistema de imunoensaio ADVIA Centaur XP (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, EUA).

a análise estatística

Todos os dados são expressos como valores individuais, mediana e âmbito de cada grupo de sujeitos. A diferença entre os grupos foi analisada pelo teste de Mann-Whitney. A diferença entre os tecidos de tumor e não de tumor foi analisada utilizando o teste de Wilcoxon. A correlação potencial entre variáveis ​​foi analisada pelo teste de correlação de Spearman. Todos os testes estatísticos foram realizados com o programa SPSS 19.0. Um valor de P nos dois lados da . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Caracterização de circulação de CD14

+ CD169

monócitos + no CRC pacientes

Para determinar os potenciais papéis de CD14 circulando

+ CD169

+ monócitos no desenvolvimento de CRC, um grupo de pacientes com CCR e idade e sexo-correspondida HC foram recrutados. Como mostrado na Tabela 1, não houve diferença significativa na distribuição da idade e sexo, os números de leucócitos e monócitos entre os pacientes e HC. Além disso, não houve diferença significativa na localização do tumor e os respectivos graus diferenciais entre pacientes com precoce e avançado CRC. Como esperado, os pacientes apresentaram níveis significativamente mais elevados de CEA no plasma do que o HC (P 0,05).

estudo anterior mostraram que CD14

+ monócitos representam 80-90% do total de monócitos circulantes [35] . O CD14

+, CD169

+ e CD163

+ células foram fechado de acordo com controles isotípicos e controles FMO (S1 FIG) correspondente. Analisamos a freqüência de diferentes subconjuntos de CD14 circulando

+ CD169

+ monócitos de pacientes com CCR e HC por citometria de fluxo (Fig 1A e 1B). A análise quantitativa revelou que as percentagens de CD14 circulante

+ CD169

+ monócitos dos pacientes foram significativamente superiores às de HC (18,21% vs 1,42%, P 0,0001; Fig 1C). Portanto, o aumento significativamente percentagens de circulantes CD14

+ CD169

+ monócitos existia em pacientes de CRC.

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas de sujeitos individuais e coradas com anti-CD14 e anti- CD169. A frequência de CD14 circulando

+ CD169

+ monócitos foi caracterizado por citometria de fluxo. As células foram fechado inicialmente em células mononucleares e, em seguida, CD14

+ células. Posteriormente, as percentagens de CD14

+ CD169 foram determinados

+ monócitos. Para caracterizar os diferentes subconjuntos de CD14

+ CD169

+ monócitos, PBMC foram coradas com anticorpos fluorescentes contra CD14, CD169 e CD163, CD206 ou MAC387. As células foram fechado em CD14

+ CD169

+ monócitos e as percentagens de CD14

+ CD169

+ CD163

+, CD14

+ CD169

+ CD206

+ e CD14

+ CD169

+ MAC387 foram determinados

+ macrófagos. Os dados são gráficos representativos de citometria de fluxo e expressos como os valores de sujeitos individuais. As linhas horizontais indicam a mediana para os grupos individuais. (A) A citometria de fluxo análise do CD14

+ CD169

+ monócitos /macrófagos. (B) A citometria de fluxo análise de diferentes subconjuntos de CD14 circulando

+ CD169

+ monócitos /macrófagos. (C) As percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos. (D) A frequência de CD14

+ CD169

+ CD163

+ macrófagos. (E) A frequência de CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos. (F) A frequência de CD14

+ CD169

+ MAC387

+ macrófagos.

A caracterização indicaram que a percentagem de CD14

+ CD169

+ CD163

+ células circulantes CD14 no total

+ CD169

+ monócitos de pacientes com CCR foram significativamente maiores do que em HC (74,27% vs 60,14%, P 0,0001, figura 1D). Além disso, a frequência de circulação de CD14

+ CD169

+ CD206

+ monócitos no total circulando CD14

+ CD169

+ monócitos de pacientes com CCR também foi significativamente maior do que no HC (3,35% vs 0,82%, P 0,0001; Fig 1E). Em contraste, as percentagens de circulantes CD14

+ CD169

+ MAC387

monócitos + no total circulando CD14

+ CD169

+ monócitos nos pacientes com CCR foram menores do que no HC (76,31% vs 80,15%, P = 0,0041, Figura 1F). Coletivamente, os pacientes CRC exibido um desequilíbrio de diferentes subconjuntos de circulantes CD14

+ CD169

+ monócitos.

Análise de CD14

+ CD169

+ macrófagos em neoplasias colorretais

monócitos periféricos migram para órgãos e tecidos para regular a inflamação. Para entender a importância de diferentes subconjuntos de CD14

+ CD169

+ macrófagos no desenvolvimento de CRC, as percentagens de diferentes subconjuntos de CD14

+ CD169

+ macrófagos em LPMCs de 12 pacientes não-tumorais e em TIMs de 30 pacientes com CCR foram analisadas por citometria de fluxo (Fig 2A). Embora os estudos anteriores mostraram que os macrófagos na propria intestinal lâmina pode expressar diferentes níveis de CD14 [18, 36], uma fracção de CD14

+ macrófagos foram apresentados na lâmina própria (S1 Fig A) e focada sobre esta população de macrófagos intestinais. O CD14

+, CD169

+ e CD163

+ células em LPMCs ou TIMs foram fechado de acordo com a FMO controla em S1 Fig. As percentagens de CD14

+ CD169

+ macrófagos em TIMs foram significativamente maiores do que em pacientes de LPMCs não tumorais (25,36% vs 1,83%, P 0,0001; Fig 2B). Além disso, foram analisadas as percentagens de CD14

+ CD169

+ CD163

+ ou CD14

+ CD169

+ CD206

+ células em LPMCs ou TIMs por citometria de fluxo (Fig 2C) . As percentagens de CD14

+ CD169

+ CD163

+ ou CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos em TIMs foram significativamente maiores do que em LPMCs (78,05% vs. 64,21 %, P 0,0001; 3,85% vs 1,63%, P 0,0001; Fig 2D e 2E). Curiosamente, também detectada percentagens significativamente mais elevados de CD14

+ CD169

+ CD163

+ ou CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos em TIMs do que em monócitos de pacientes com CCR circulantes (dados não apresentados), sugerindo que o sangue periférico CD14

+ CD169

+ monócitos pode migrar para a lâmina própria e tornou-se células-M2 como.

Um total de 30 tecidos de tumor frescas foram CRC cirúrgicos digerido para a caracterização de macrófagos infiltrantes tumorais (TIMS). Além disso, os tecidos 12 lamina propria de doentes não tumorais foram digeridos para a caracterização de macrófagos em células totais da lâmina própria mononucleares (LPMCs). Subsequentemente, as células foram coradas com anti-CD14, CD169 e CD163 ou CD206. A frequência de CD14

+ CD169

+, CD14

+ CD169

+ CD163

+ e CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos em LPMCs e TIMs foi determinada por citometria de fluxo. Os dados são gráficos representativos ou expressos como os valores de sujeitos individuais. As linhas horizontais indicam a mediana para os grupos individuais. (A) A citometria de fluxo análise do CD14

+ CD169

+ em LPMCs e TIMs. (B) As percentagens de CD14

+ CD169

+ macrófagos em LPMCs e TIMs. (C) citometria de fluxo de CD14

+ CD169

+ CD163

+ e CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos no total CD14

+ CD169

+ LPMCs e TIMS macrófagos. (D) A frequência de CD14

+ CD169

+ CD163

+ macrófagos em LPMCs e TIMs. (E) A frequência de CD14

+ CD169

+ CD206

+ macrófagos em LPMCs e TIMs.

A maior frequência de IL-10

+ CD14

+ CD169

+ e macrófagos em pacientes de CRC

estudos anteriores demonstraram que a IL-10

+ M2 estão associados com o desenvolvimento de CRC [26, 37-38]. Para determinar a função de circular CD14

+ CD169

monócitos + e TIMs, as células isoladas foram estimuladas in vitro e os percentuais de IL-10

+ ou IL-12

+ CD14

CD169 +

+ monócitos circulantes e MTE foram determinados por citometria de fluxo (Figura 3A). As percentagens de IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monócitos e MTE circulante no total CD14

+ CD169

+ células de pacientes com CCR foram significativamente maiores do que o do não-tumoral indivíduos (3,79% vs. 0,76%, P 0,0001 para monócitos circulantes; 7,12% vs. 1,23%, P . 0,0001 para TIMs Fig 3B). Em contraste, não houve diferença significativa na freqüência de IL-12

+ CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs entre os pacientes com CCR e indivíduos não-tumorais (0,24% vs. 0,22% em circulação, P = 0,2854 para monócitos circulantes; 0,37% vs 0,36%, P = 0,4729 para TIMs Fig 3C).. Uma análise mais aprofundada de CD14

+ CD169

– células revelou que não há diferença significativa na freqüência de IL-10

+ ou IL-12

+ CD14

+ CD169

– Células no total CD14

+ CD169

– células entre os pacientes com CCR e indivíduos não-tumorais nesta população (IL-10: 0,017% vs. 0,024%, P = 0,6428 para monócitos circulantes; 0,018% vs. 0,014% , P = 0,8125 para TIMs; IL-12: 0,019% vs 0,013%, P = 0,1628 para monócitos circulantes; 0,015% vs 0,013%, P = 0,8678 para TIMs Fig S2).. Mais importante ainda as percentagens de CD14

+ CD169

+ IL-10

+ células foram correlacionados positivamente com as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs nos pacientes com CCR circulante (R = 0,5375, P = 0,0001 para monócitos circulantes; R = 0,5637, P = 0,0009 para TIMs, Fig 3D e 3E). Assim, os doentes CRC exibido uma maior frequência de IL-10

+ CD14

+ CD169

+ macrófagos.

PBMC e TIMs foram isoladas de sujeitos individuais e estimuladas com LPS e PMA /ionomicina . As células foram coradas com anticorpos anti-CD169 e anti-CD14 durante 30 minutos, fixado, e permeabilizadas, seguido por coloração intracelular com anti-IL-10 ou anti-IL-12. As células foram fechado pela primeira vez em CD14

+ CD169

+ células e as percentagens de CD14

+ CD169

+ IL-12

+ M1 e CD14

+ CD169

+ IL-10 de células

+ M2 em PBMC ou as MTE de sujeitos individuais foram determinados por citometria de fluxo. Os níveis de IL-10 no plasma e IL-12 em sujeitos individuais foram determinados por ELISA. Os dados são gráficos representativos ou expressos como os valores de pacientes individuais. As linhas horizontais indicam a mediana para os grupos individuais. (A) análise de citometria de fluxo. (B) As percentagens de CD14

+ CD169

+ IL-10

+ células M2. (C) As percentagens de CD14

+ CD169

+ IL-12

+ células M1. As linhas horizontais indicam os valores medianos. (D) A associação potencial entre as percentagens de CD14 circulando

+ CD169

+ IL-10

+ células CD14 e

+ CD169

+ células em pacientes com CCR. (E) A associação potencial entre as percentagens de TIMs CD14

+ CD169

+ IL-10

+ células e CD14

+ CD169

+ células nos tecidos CRC. (F) Os níveis de IL-10 no plasma. (L) Os níveis de IL-12 no plasma. (H) A correlação de plasma de IL-10 níveis com as percentagens de CD14

+ CD169

+ IL-10

+ monócitos em PBMC de pacientes com CCR. (I) A correlação entre os níveis de IL-10 plasma e CEA em pacientes com CCR.

Nós medimos as concentrações de IL-10 plasma e IL-12 em sujeitos individuais por ELISA. Como se mostra na Fig 3F e 3G, as concentrações de IL-10 no plasma, mas não de IL-12, nos pacientes com CCR foram significativamente maiores do que em HC (P 0,0001). As concentrações de IL-10 no plasma foram correlacionados positivamente com as percentagens de circulando IL-10

+ CD14

+ CD169

+ monócitos (R = 0,6018, P 0,0001; Fig 3H) e os níveis de plasma CEA nos pacientes com CCR (R = 0,413, P = 0,0043; Fig 3I).

analisa Estratificação da frequência de CD14

+ CD169

+ monócitos e macrófagos em pacientes com CCR

em seguida, estratificamos os pacientes, de acordo com as suas tumorais estágios TNM patológica e descobrimos que as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes foram significativamente menores nos pacientes com estágio inicial de CRC do que aqueles com avançada fase de CRC (11,81% vs 15,91%, P = 00003, figura 4A). Da mesma forma, as percentagens de CD14

+ CD169

+ macrófagos em TIMs dos pacientes com estágio inicial de CRC foram significativamente menores do que naquelas com estágio avançado de CRC (22,45% vs. 26,93%, P 0,0001, Figura 4A). Além disso, as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes de pacientes com qualquer fase inicial ou fase avançada de CRC foram significativamente menores do que no TIMs a partir do mesmo grupo de pacientes (P 0,00001, P 0,0001 , respectivamente; Figura 4A). As percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes foram positivamente correlacionados com as percentagens de CD14

+ CD169

+ macrófagos em TIMs dos pacientes com início (R = 0,4361, P = 0,0073 Fig. 4B) ou estágio avançado (R = 0,8191, P = 0.0001.Fig 4C) de CRC.

Os pacientes com CCR foram estratificados tão cedo (I /II, n = 21) ou estágio avançado (III /IV, n = 25) e as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs em pacientes individuais em circulação foram analisados. Além disso, a associação potencial entre as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos ou TIMs e os níveis de CEA plasma em grupos individuais de pacientes em circulação foram analisados. Os dados são a média dos sujeitos individuais. (A) As percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos em PBMC (n = 21 para a fase inicial, n = 25 para o estágio avançado de pacientes CRC) e as percentagens de CD14

+ CD169

+ macrófagos em TIMs de fase de pacientes de CRC início (n = 14) ou avançada (16 N =). As linhas horizontais indicam a mediana para os grupos individuais. (B) A correlação entre as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs circulando em fase inicial de pacientes com CCR. (C) A correlação entre as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs circulando em estágio avançado de pacientes com CCR. (D) A correlação entre os níveis de CEA plasma e as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos nos pacientes com CCR circulantes. (E) A correlação entre os níveis de CEA plasma e as percentagens de CD14

+ CD169

+ TIMs nos pacientes com CCR.

Os níveis de plasma CEA continuará a ser um biomarcador valioso para avaliar a progressão CRC [39]. Assim, examinámos o potencial associação entre as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs circulando com os níveis de CEA plasma nos pacientes com CCR. Descobrimos que os níveis de CEA plasma foram correlacionados positivamente com as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes (R = 0,7655, P 0,0001; Fig 4D) e CD14

+ CD169

+ macrófagos em MTE (R = 0,5768, P = 0,0009; Fig 4E) nos pacientes de CRC. Juntas, as percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e TIMs foram associados positivamente com os estágios patológicos da CRC nesta população de pacientes.

Discussão

Para avaliar a potencial marcador de CD14

+ CD169

+ células na progressão patogênico da CRC, examinamos o fenótipo e relevância clínica de circulação de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs em pacientes com CCR. Os dados indicaram que os monócitos CD14 e MTE circulante

+ CD169

+ M2-like acumulado nos neoplasmas e correlacionado com os níveis de IL-10 e CEA em pacientes de CRC de plasma. Claramente, a frequência de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e TIMs foram associados com os estágios patogênicos da CRC. Para o melhor de nosso conhecimento, este foi o primeiro relatório que percentagens significativamente mais elevados de circulantes CD14

+ CD169

+ M2-como monócitos ou TIMs foram associados com a progressão patogênico da CRC em seres humanos.

infiltrado inflamatório no microambiente do tumor são cruciais para a progressão e metástase de tumores [7, 8]. Estudos anteriores demonstraram que os macrófagos alternativamente activados M2 pode participar no processo patogénico de diferentes tipos de tumores sólidos, através da promoção da angiogénese e metástases e inibir a actividade antitumoral [16, 40-41]. Neste estudo, nós detectamos uma frequência significativamente maior de circular e tumor infiltrando CD14

+ CD169

+ CD163

+ e CD14

+ CD163

+ CD206

+ macrófagos M2-like em pacientes com CCR. Estes resultados sugerem que os monócitos periféricos podem migrar para os tecidos de tumor e de regular o crescimento do tumor e imunidade. As percentagens de CD14

+ CD169

+ monócitos e TIMs circulantes em pacientes com estágio avançado da CRC foram significativamente maiores do que aqueles com estágio inicial de CRC. Estes dados indicam ainda que a frequência de CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes e TIMs foram associados com os graus patogênicos da CRC. Nossos dados estendida observações anteriores sobre a doença inflamatória e sugerem que CD169

+ pode ser expressa por macrófagos em tecidos tumorais [23-25, 42]. Com efeito, CD169

+ macrófagos foram detectados na lâmina própria do cólon normais [29]. Dado que CD169 é uma molécula de adesão que é possível que CD14

+ CD169

+ monócitos circulantes podem migrar e ser activado no ambiente tumoral para regular a progressão e metástase de CRC. Os nossos resultados foram diferentes a partir de uma observação anterior que CD169

+ macrófagos em linfonodos regionais foram associados com um prognóstico favorável em pacientes de CRC [28].