Abstract

Protegido e entrega específica de ácidos nucleicos para células malignas continua a ser uma abordagem altamente desejável para a terapia do cancro. Aqui nós apresentamos dados sobre as características físicas e químicas, mecanismo de ação, e piloto de eficácia terapêutica de um tenfibgen (TBG), tecnologia nanocápsulas -shell para entrega dirigida-tumoral de ADN /ARN de cadeia oligômeros quiméricas individuais dirigidas CK2αα ‘para xenoenxerto tumores em camundongos . O sub-50 nm tamanho TBG nanocápsulas (s50-TBG) é um pouco carregado negativamente partículas e uniforme de 15-20 nm de tamanho, que confere protecção à carga de ácido nucleico. O ADN /ARN oligómero quimérico (RNAi-CK2) funciona para diminuir os níveis de expressão CK2αα ‘através de ambos os mecanismos anti-sentido e ARNsi. entrega sistémica de s50-TBG-RNAi-CK2 visa especificamente as células malignas, incluindo células tumorais no osso, e em doses baixas reduz o tamanho e sinais relacionados com a CK2 em tumores primários e metastáticos ortotópicos de cancro da próstata xenotransplante. Em conclusão, a tecnologia nanoencapsulação s50-TBG em conjunto com o oligômero quimérico segmentação oferta CK2αα ‘a promessa significativa para o tratamento sistémico de malignidade da próstata

Citation:. Trembley JH, Unger GM, Korman VL, Abedin MJ, Nacusi LP, Vogel RI, et ai. (2014) Tenfibgen Ligand nanoencapsulação entrega Bi-Funcional Anti-CK2 RNAi Olig�ero para locais chave para o cancro da próstata Segmentação Usando Humano heteróloga de tumores em ratos. PLoS ONE 9 (10): e109970. doi: 10.1371 /journal.pone.0109970

editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de agosto de 2014; Aceito: 02 de setembro de 2014; Publicação: 15 de outubro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de informação de apoio

Financiamento:. Fundos de avaliação de mérito de pesquisa (1IO1B001731) conferido pelo Departamento de Assuntos Veteranos www.va.gov (KA). Bolsa de Investigação CA150182 concedido pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health, Departamento de Saúde e Serviços Humanos www.nih.gov (KA). Bolsas de Investigação CA158730 e DK067436-05 adjudicados pelo Instituto Nacional do Câncer e do Instituto Nacional de Diabetes, Doenças Digestivas e Doenças Renais, Institutos Nacionais de Saúde, Departamento de Saúde e Serviços Humanos www.nih.gov (BTK). Pesquisa concede HHS-N261-2008-00027 /N42CM-2008-00027C, CA99366, e CA119556 concedido pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health, Departamento de Saúde e Serviços Humanos www.nih.gov (GMU). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Disclaimer: As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a posição ou a política dos Estados Unidos Departamento de Assuntos de Veteranos ou o governo dos Estados Unidos

interesses concorrentes:. GMU tem participação ( incluindo patentes) em GeneSegues, Inc. Não há potenciais conflitos de interesse foram divulgados por outros autores. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Em todo o espectro de doença maligna, terapia eficaz para restos avançados e /ou metastáticos de câncer um objetivo fundamental nos esforços para reduzir a mortalidade relacionada ao câncer. terapia do câncer à base de ácido nucleico continua a manter a promessa significativa para o tratamento da doença, eficaz, específica do gene e de baixa toxicidade que tem o potencial adicional de superar a resistência terapêutica frequentemente observada na doença agressiva. Ambos antisense e terapêutica à base de siRNA entraram em ensaios clínicos com sucesso muito moderado [1] – [4]. As principais considerações para o uso sistêmico de ácidos nucleicos lineares curtas como um grupo terapêutico incluem que eles são dirigidos especificamente para as células tumorais de uma forma protegida, membranas celulares efetivamente cruz e envolver a maquinaria celular. Inúmeras abordagens incorporem esses conceitos têm demonstrado utilidade em modelos de ratos, incluindo, por exemplo, PSMA-alvo quimeras aptamer-siRNA, Her2-alvo de cadeia única entrega siRNA mediada proteína de fusão anticorpo-protamina fragmentada e transferrina receptor-alvo polímero mediada entrega siRNA à base de ciclodextrina [1], [5], [6]. A nossa abordagem para entregar eficazmente terapêutica de ácido nucleico para tumores utiliza um sub-nanocápsulas de 50 nm de tamanho compreendendo o ligando tenfibgen (TBG), o domínio de fibrinogénio globo carboxi-terminal de tenascina-C. TBG forma o invólucro de proteína ligando da nanocápsulas e permite o direccionamento para células de cancro através de receptores de tenascina, que são elevados nestas células mediada pelo receptor [7] – [12]. nanocápsulas TBG são especificamente absorvidos pelas células tumorais e microvasos derivadas de tumor, mas não por células normais ou vasos [13] – [15].

CK2 (anteriormente caseína quinase II ou por CKII) é uma proteína ubíqua Ser /Thr quinase com uma estrutura heterotetramérica que consiste em duas subunidades catalíticas (42 kDa α e /ou 38 kDa α ‘) e duas subunidades reguladoras (28 kDa β) em α

2β

2, αα’β

2 ou α ‘

2β

2 configurações. CK2 fosforila um grande número de substratos com várias funções relacionadas com o crescimento e proliferação celular, é constitutivamente activa, e é essencial para a sobrevivência [16] – [22]. Além disso, CK2 foi encontrado para ser supra-regulada em todos os cancros examinados, onde uma das suas funções é a de suprimir a apoptose [18], [23] – [29]. Temos anteriormente estabelecido a eficácia da nossa sequência de ácido nucleico de 20-mer para direccionamento tanto CK2α e CK2α ‘. Temos usado essa seqüência como um oligonucleotídeo antisense entregues sistemicamente a ratinhos portadores de tumores CaP ortotópicos, como uma carga siRNA para nanocápsulas s50-TBG entregues ao câncer de próstata em cultura de células (PCA), e como uma cadeia única carga RNAi-CK2 para s50-TBG nanocápsulas entregues sistemicamente a ratinhos portadores de carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) xenotransplantes [15] cabeça e, [30] – [32]. Aqui nós expandir o mecanismo e tratamento de utilidade tanto da nanocápsulas s50-TBG eo oligômero RNAi-CK2 usando modelos de xenotransplante de cancro da próstata humanas iniciadas em ratos em locais terapeuticamente relevantes. Apresentamos dados que caracterizam a nanocápsulas s50-TBG ea sua entrega sistémica como prova-de-conceito para capacidade de direcionar

em locais de crescimento tumoral importantes vivo

CaP, bem como a eficácia do uso downregulation RNAi-mediada da CK2 como uma abordagem terapêutica.

resultados

projeto nanocápsulas Tenfibgen e estabilidade

Para cumprir nossa meta de diminuir a expressão CK2 especificamente nas células prostáticas malignas, um single-stranded DNA /RNA quimérico molécula (RNAi-CK2) visando transcrições de subunidades do CK2αα ‘foi condensado e encapsulados dentro de uma concha de proteína composta de TBG. nanocápsulas TBG são tipicamente de 15-20 nm de tamanho, e entrar nas células tumorais através de receptores de tenascina utilizando a via mediada por lípido jangada caveolar [13], [15]. Características e morfologia das nanocápsulas TBG-ARNi-CK2, bem como a estrutura e sequência de ARNi-CK2 estão resumidos na Tabela 1 e na Figura 1a, b. A análise de estabilidade de nu oligómero quimérico RNAi-CK2 e nanocápsulas S50-Tbg- RNAi-CK2 (Fig. 1C) demonstra que, após digestão com proteinase K de nu oligómero RNAi-CK2 (painel da esquerda) ou S50-Tbg- RNAi-CK2 nanocápsulas (direita painel), a carga oligómero permanece intacta. Além disso, o tratamento de nanocápsulas com ADNase antes da digestão com proteinase K mostra que a carga de ácido nucleico está totalmente protegida pelo processo de encapsulamento (Fig. 1C, painel direito).

(a) descrição dos desenhos animados de concepção nanocápsulas. (B) micrografia eletrônica de transmissão da S50-TBG-RNAi-CK2 nanocápsulas para

In vivo

estudos. Ampliação 230.000 ×. barra de escala de 100 nm. (C) Painel esquerdo: Nu RNAi-CK2 oligómero foi digerido com proteinase K, durante 24 a 96 h. Inp, não digerido oligômero de entrada. Painel direito: Naked e s50-TBG encapsulado oligômeros RNAi-CK2 foram digeridos com DNase seguido por proteinase K, como indicado acima do painel. As pistas 1 2, RNAi-CK2 nu; 3 4, nua RNAi-CK2 com nanocápsulas TBG-açúcar incluído na digestão; 5-7,

in vitro Use formulação de s50-TBG-RNAi-CK2; 8 – 10,

in vivo Use formulação de s50-TBG-RNAi-CK2

Os mecanismos potenciais de ação para o /RNA oligômero quimérico RNAi-CK2 DNA

a cadeia simples de DNA /RNA oligômero de carga RNAi-CK2 poderia funcionar para diminuir a expressão CK2 através de mecanismos antisense- e /ou à base de siRNA. Para resolver isso, nós primeiro investigou se nosso projeto oligômero RNAi-CK2 constituído por 14 resíduos de DNA fosfodiéster padrão no ‘fim, 6 2’ a 5

O

metil resíduos de ARN na extremidade 3 ‘, e um terminal propil vinculador (rotulado RNAi-CK2-6R na Fig. 2-a) poderia servir como um estímulo para a atividade RNase H1. Para comparação, incluiu-se a mesma sequência que consiste inteiramente de fosforotioato (PS) modificado resíduos de ADN (AS-CK2-PS), bem como uma concepção de oligómero com 8 resíduos de ADN convencional na extremidade 5 ‘, 12, 2’

O

-metil resíduos de ARN na extremidade 3 ‘, e um ligante propilo terminal (RNAi-CK2-12R). Os dados na figura 2A mostram que o oligómero RNAi-CK2 com 14 resíduos de ADN (RNAi-CK2-6R) serve como um estímulo eficaz para a actividade de ARNase H1. Durante o resto do manuscrito, RNAi-CK2-6R é referido como ARNi-CK2 e é o fármaco terapêutico encapsulado nas nanocápsulas TBG

.

(a) o teste do substrato ARNase H1 de diferentes formas de composição de ADN /ARN oligómeros de ARNi-CK2. 5 ‘sonda de ARN marcado na extremidade (*) foi recozido com RNAi-CK2-6R, ARNi ou CK2-12R-AS-CK2-PS oligómeros complementares, em seguida, incubadas durante vários períodos de tempo com ARNase H1. As letras no lado da mão esquerda do gel e inserir representam as escadas de sequências para substrato de ARN marcado na extremidade 5 ‘. escadas de dimensionamento são indicados como AL (lise alcalina), C (menos RNase T1) e T1 (RNase T1 clivagem). tempos de digestão de ARNase H1 são 0, 30, 60 e 120 s (pistas 1-4, respectivamente). A identidade do oligómero de teste é indicado por cima das pistas. A inserção mostra uma exposição mais leve dos produtos da reacção de RNAi-CK2-12R ARNase H1. Oligômeros complementada com a sonda de RNA marcado são mostrados com setas indicando os principais locais de clivagem. Para as sequências de oligómero RNAi-CK2-6R e RNAi-CK2-12R, minúsculas denota 2 ‘

O

metil resíduos de RNA e letras maiúsculas são resíduos de DNA fosfodiéster ligada convencionais. O AS-CK2-PS é um oligômero DNA fosforotioato ligado. (B) A detecção de produtos de clivagem ago2 /RISC produzidos por RNAi-CK2 transfecção em células PC3-LN4. 5 ‘RACE de RNA-ligase mediada foi realizada para o CK2α e CK2α’ transcritos como descrito em métodos on-line. As pistas 1 5, siControl células transfectadas; 2 6, siCK2 células transfectadas; 3 7, RNAi-CK2 células transfectadas; 4 8, não há controles de água cDNA; M, marcadores de tamanho de ADN. Os produtos RACE previstas (CK2α, 242 pb; CK2α ‘, 236 pb) são indicados à esquerda, e os primers específicos de genes utilizados são indicados acima das pistas. (C) Mapeamento do local de clivagem de RACE foi obtida por sequenciação dos produtos obtidos em (b). A sequência de ARNm é mostrado em letras minúsculas, o oligómero transfectadas está representada abaixo do ARNm, e sítios de clivagem são indicadas por uma seta.

Para examinar o envolvimento de mecanismos baseados ARNip, o ARN purificado a partir de TBG-ARNi -CK2-PC3 transfectadas LN4 [33] processamento baseada em RISC células cultivadas em tenascina-C /fibronectina (TnFn) foi analisada utilizando uma técnica de RACE mediada por ligase de ARN a 5 ‘modificada para mapear quaisquer potenciais locais de clivagem resultantes da ago2 /do ADN /ARN oligómero quimérico. ARN purificado a partir de células transfectadas com ARNsi de CK2 (alvo mesma sequência que RNAi-CK2) ou uma sequência de controlo não-direccionamento foram utilizados como controlos adicionais. Tal como mostrado na Figura 2b, os produtos de clivagem de CK2α e transcritos ‘alfa foram detectadas tanto em RNAi-CK2 e siCK2 células transfectadas. Mapeamento dos locais de clivagem por sequenciação dos produtos de RACE confirmado o local de clivagem em ambos os transcritos na previu 10

th nucleótido da extremidade 5 ‘do oligómero [34] (Fig. 2c). Juntos, estes resultados indicam que RNAi-CK2 pode regular negativamente transcrições CK2α e CK2α ‘por mecanismos de RNase H e ago2.

Efeitos da TBG-RNAi-CK2 em células cultivadas malignos e benignos

temos consistentemente observado que nanocápsulas s50-TBG entregar sua carga para a região perinuclear que precede a entrada nuclear, independentemente do tipo de célula cancerosa. Para as espécies de ácido não-nucleicos, tais como agentes de contraste, a carga é tipicamente exportados do núcleo para o citoplasma, onde se acumula em organelos citoplasmáticos e é subsequentemente exportados. Para melhor caracterizar o tráfico e liberação de cargas de nanocápsulas s50-TBG, as células PC3-LN4 malignos foram cultivados em TnFn revestido em 3 dimensões andaimes nanofibras (TnFn-3D) para facilitar a formação das jangadas lipídicas necessárias para estudos de nanocápsulas s50-TBG [15] . A Figura 3a ilustra o transporte para o núcleo, a libertação da carga, e exportação de FeO-dextrano ao longo de um período de 24 h de tempo após o tratamento das células com nanocápsulas S50-TBG-FeO-dextrano. Num estudo semelhante, uma comparação de S50-TBG-FeO-dextrano absorção de 8 h após a adição de nanocápsulas de células foi realizada em PC3-LN4 e hiperplasia benigna da próstata células (BPH-1). Os resultados demonstram a absorção ávido das nanocápsulas TBG-FeO por células malignas, mas não benignos (Fig. 3b).

(a) Captação de mais de 24 h de nanocápsulas s50-TBG com carga FeO-dextrano em PC3-LN4 células plaqueadas em TnFn-3D. As células foram coradas com azul da Prússia-DAB reforçada para ferro e contrastadas com Fast Red. A barra de escala 100? M. (B) a absorção específico da célula maligna de nanocápsulas s50-TBG. captação s50-TBG-FeO-dextrano foi determinada por coloração de ferro às 8 h no PC3-LN4 e células BPH-1 cultivadas em TnFn- ou andaimes de nanofibras revestido de laminina, respectivamente. A barra de escala 100? M. (C) efeitos de proliferação celular de tratamento S50-Tbg- RNAi-CK2 em células prostáticas benignas e malignas. PC3-LN4 C4-2 e cultivadas em TnFn-3D e as células BPH-1 cultivadas em 3D-laminina em placas de 96 poços foram tratados com S50-Tbg- RNAi-CK2 ou controlar nanocápsulas contendo TBG RNAi-RFP-6R de segmentação de fluorescência vermelha proteína tal como indicado.

3H-timidina foi adicionada depois de 48 h, e analisadas as células às 72 horas pós-adição nanocápsulas. Os resultados são expressos em relação ao tratamento com nanocápsulas S50-TBG-açúcar. As nanocápsulas de carga e de linhas celulares s50-TBG utilizados são indicados por baixo das barras. Médias ± SE são apresentados (n = 3 para todas as). * P 0,005 em relação ao s50-TBG-açúcar e -RFP; # P 0,01 em relação ao TBG-açúcar; $ P = 0,006 em relação ao TBG-RFP. tratamento (d) s50-TBG-RNAi-CK2 reduzida CK2α e CK2α ‘níveis de expressão de estado estacionário de mRNA em células PC3-LN4. mRNA isolado a partir de células PC3-LN4 cultivadas em TnFn 24 e 48 h após a S50-Tbg- RNAi-CK2 tratamento -produtos ou como indicado foi analisada por transcriptase reversa-PCR em tempo real quantitativo para a expressão e CK2α CK2α ‘. HPRT transcrição foi utilizado para normalizar os níveis de expressão. Significa, SE e p-valores são apresentados (24 h CK2α n = 5, CK2α ‘n = 6; 48 h CK2α n = 2, CK2α’ n = 2).

Foram examinados os efeitos de S50-Tbg- RNAi-CK2 sobre a proliferação de células da próstata em cultura utilizando linhas de PC3-LN4 e celulares C4-2 altamente tumorigénicas em comparação com células BPH-1. O tratamento de células PC3-LN4 C4-2 e cultivadas em 3D com TnFn-S50-Tbg- RNAi-CK2 durante 3 dias resultou numa perda significativa da proliferação celular medida por [

3H] -timidina, ao passo que a TBG-ARNi -CK2 tratamento de células BPH-1 cultivadas em uma matriz de laminina não reduziu a sua proliferação (Fig. 3c). Usando quantitativa da transcriptase reversa-PCR em tempo real, CK2α e os níveis de ARNm CK2α ‘foram encontradas diminuiu significativamente em células PC3-LN4 cultivadas TnFn 24 e 48 h após o tratamento com S50-Tbg- RNAi-CK2 (Fig. 3d), e a diminuição era equivalente ao seguinte tratamento observado com TBG-siCK2 [31].

Biodistribuição de nanocápsulas TBG

para demonstrar que nanocápsulas s50-TBG vincular células de tecidos malignos e não normal, e que eles não acumulam de forma não específica no sistema reticuloendotelial, secções congeladas de tumores PC3-LN4 xenoenxerto ortotópico, bem como não-tumor do fígado do rato rolamento, rim e baço foram submetidas a ensaios de ligação de nanocápsulas. Nestes ensaios, secções de tecido foram incubadas com nanocápsulas s50-TBG-RNAi-CK2 contendo hamster sírio IgG incluído no shell proteína. Após os passos de lavagem, as secções foram processadas para imunodetecção indirecta da IgG de hamster. Os dados na Figura 4A e Figura S1 demonstrar a ligação de nanocápsulas S50-Tbg- RNAi-CK2 para tecido de tumor, mas não para o fígado, rim ou baço. Outra prova de especificidade do tecido nanocápsulas induzida pelo ligando é mostrado na Figura 4b e Figura S2 em que asialoorosomucóide (ASOR), nanocápsulas com IgG hamster sírio incluído na casca foram utilizados para realizar os ensaios de ligação de nanocápsulas. ASOR é o ligando para o receptor asialoglycoportein expresso em hepatócitos, e os dados demonstram que o nanocápsulas ASOR se liga especificamente ao fígado e não tecido tumoral.

(a) ligação do S50-Tbg- RNAi-CK2 de tumor, mas não fígado, baço e rim. As secções de tecido foram submetidas a análise de imunofluorescência para a IgG de hamster sírio após incubação com S50-Tbg- RNAi-CK2. A barra de escala 100? M. (B) Ligação de ASOR-DyDOTA para o fígado, mas não de tumor, baço e rim. Os tecidos foram submetidos a uma análise de imunofluorescência para a IgG de hamster sírio após incubação com ASOR-DyDOTA. A barra de escala 100? M. (C) Análise do osso da tíbia para a presença de tumor e absorção de TBG-DyDOTA nanocápsulas 24 h após a administração i.p. injecção. painéis superiores, tumor contendo tíbia: H E mancha, B = osso, GP = placa de crescimento, M-S = medula sinusite, T = tumor; detecção de imunofluorescência de hamster sírio IgG (verde); detecção directa de Dy (vermelho); fusão de verde e vermelho. painéis centrais, tumor contendo tíbia: detecção de imunofluorescência de controlo de isotipo para CK8 (verde); detecção de imunofluorescência de CK8 (verde); detecção directa de Dy (vermelho); fusão de verde e vermelho. painéis inferiores, zomba tíbia injetado: detecção de imunofluorescência de controlo de isotipo para CK8 (verde); detecção de imunofluorescência de CK8 (verde); detecção directa de Dy (vermelho); fusão de verde e vermelho. contracoloração ADN é mostrado em azul. Escala das barras 100 um. (D) Análise do fígado, do baço e de sangue para a resposta inflamatória. ratos imuno-competentes foram injectados i.v. com 10 mg /kg de S50-Tbg- RNAi-CK2 ou S50-Tbg- açúcar ou com volume igual de veículo e os tecidos foram recolhidos após 24 h. Fígado, baço e timo de massa são apresentadas em relação ao peso do corpo do rato (eixo esquerda). Interferon-γ foi medido no soro sanguíneo (eixo direito).

Para fornecer validação para s50-TBG nanocápsulas homing para células malignas em ratos, iniciamos xenoenxertos de cancro da próstata nos ossos por injecção directa de PC3- células LN4 na tíbia. A tíbia contralateral em cada rato foi simulada injetado. Uma vez que o crescimento do tumor era evidente, os ratinhos foram injectados com nanocápsulas S50-TBG contendo disprósio-DOTA-dextrano como a carga (S50-Tbg- DyDOTA) e recolhidas após 24 horas para o processamento. presença de tumor no osso foi verificado por: H E mancha. A localização das nanocápsulas s50-TBG-DyDOTA para células tumorais foi verificada pela visualização direta do Dy, um elemento de lantanídeos fluorescente e detecção indireta de IgG hamster sírio. Os anticorpos para CK8 foram usadas para detectar células tumorais epiteliais. Os dados na Figura 4c mostram a presença do sinal de Dy, representando a carga de nanocápsulas, nas células tumorais que especificamente se co-localiza com qualquer um hamster sírio IgG incluído na casca de nanocápsulas (Fig. 4c, linha superior) ou com CK8 representando a próstata humana câncer de células (Fig. 4c, linha central). sinais mínimos Dy e Ck8 foram detectados no osso não tumoral pseudo-injectados a partir da mesma ratinhos (Fig. 4c, linha inferior) que pode ser devido a migração de células do tumor de xenoenxerto em tíbias contralateral.

s50-TBG ácidos nucleicos entregues em nanocápsulas não induzir resposta inflamatória precoce

Como um interferão ou resposta inflamatória precoce é um problema sério para a administração de suspensões de partículas que contêm ácidos nucleicos, medimos a concentração de interferon-γ no soro e as proporções em peso dos tecidos para o baço, fígado e timo em uma coorte de não portadores de tumor, os ratinhos imunocompetentes não consanguíneas. Estes tecidos são considerados locais de drenagem primários para formulações intravenosas [35]. Os resultados indicaram não haver diferenças notáveis ​​no baço, fígado, ou pesos do timo para os animais tratados com nanocápsulas s50-TBG contendo RNAi-CK2 ou trealose em relação ao controlo do veículo (Fig. 4d). Nós também não encontraram nenhuma evidência de elevação interferon-γ, que normalmente é observada em respostas inflamatórias primeiros mediada por partículas (Fig. 4d) [36].

A prova de conceito para a eficácia terapêutica e mecanismo de RNAi de s50 -TBG-RNAi-CK2

in vivo

piloto experiências de dose-resposta agudas foram realizados utilizando s50-TBG-RNAi-CK2 para tratar tumores da próstata ortotópico PC3-LN4 em camundongos nus. Após 10 a 14 dias, os tumores eram palpáveis ​​ortotopicamente iniciadas, e os ratinhos foram divididos em grupos de tratamento. Os ratinhos receberam duas i.p. injecções de qualquer S50-Tbg- RNAi-CK2 (4 ratinhos por grupo) ou veículo (5 ratos), dado com um intervalo de 24 h. Treze dias após o primeiro tratamento, o tecido tumoral foi colhido para análise. Ambos os níveis de dose 33 e 330 ng /kg resultou em massa de tumor maior do que 50% mais baixa em comparação com o veículo (p = 0,011 e p = 0,029, respectivamente; a Fig. 5a). Além disso, os tratamentos resultaram em volume reduzido do maior tumor linfonodo recolhido retro-peritoneal por ratinho em comparação com veículo, bem como diminuiu o comprimento de todos os tumores de linfonodos retroperitoneais recolhidos para níveis de dose 33 e 330 ng /kg (2,0 ± 0,7 ea média 1,5 ± 0,3, respectivamente) em comparação com controlo de veículo (3,6 ± 0,7). Finalmente, havia uma diferença significativa na presença ou ausência de metástases distantes quando comparando S50-Tbg- RNAi-CK2 a ratinhos tratados com veículo (p = 0,046; A Fig. 5b). A localização ortotópico dos tumores primários impedidos medição precisa do volume inicial do tumor, assim, a incapacidade de determinar com precisão a partir tamanhos tumorais pode explicar porque a resposta do tumor primário observada a 33 ng /kg, foi maior do que 330 ng /kg.

(a) volumes massa do tumor primário e linfonodo tumorais são mostrados a seguir tratamentos s50-TBG-RNAi-CK2 a 33 e 330 ng /kg em comparação com veículo. Médias ± SE são apresentados (TBG-ARNi-CK2 n = 4; Veículo n = 5). * P 0,05. (B) A percentagem de ratinhos com tumores metastáticos distantes seguintes tratamentos s50-TBG-RNAi-CK2 em 33 e 330 ng /kg em comparação com veículo. Comparação pelo teste exato de Fisher p = 0,046. (C) A análise de imunotransferência para resposta CK2α e CK2α ‘em tumores primários. Os painéis superiores representam 10 ug de lisado matriz nuclear com normalização para lamin B1. Os painéis inferiores representam 20 ug de lisado citosólica com normalização de lactato desidrogenase (LDH). (D) Análise da expressão de proteínas e resposta a sinalização em tumores representativos dos nódulos linfáticos. secções congeladas dos nódulos linfáticos do tumor foram analisados ​​por co-coloração por imunofluorescência indirecta para AKT-1 fosfo-S129 (verde) e NF-kB p65 (vermelho). counterstain DNA é mostrado (azul). barra de escala 100? M produtos (e) clivagem CK2α RISC estão presentes em S50-Tbg- RNAi-CK2 tumores tratados. O ARN total foi isolado a partir de tecido tumoral e utilizado para ligação 5’-RACE mediada RISC para determinar se a clivagem mediada do transcrito CK2α ocorreu. As pistas 1 2, day-10 tumores do flanco tratados com o veículo; Pista 3, dia-5 s50-TBG-RNAi-CK2 tumor flanco tratada; Pista 4, dia-6 s50-TBG-RNAi-CK2 tumor flanco tratada; Pista 5, dia-10 s50-TBG-RNAi-CK2 tumor flanco tratada; Pista 6, dia-10 s50-TBG-siCK2 tumor flanco tratada; Pista 7, dia-6 s50-TBG-RNAi-CK2 tratados tumor ortotópico; Pista 8, sem controle de água cDNA; M, marcadores de tamanho de ADN. O produto RACE 242 bp previsto é indicado à esquerda, o tamanho em bp dos padrões de ADN mostradas à direita eo tratamento administrado indicado acima das pistas.

Para avaliar a resposta alvo CK2, bens quantitativa -tempo de transcriptase inversa foi realizada a análise por PCR em ARN de tumor. Os dados apresentados ARNm CK2α níveis de estado estacionário foram reduzidos em 11 a 14% e CK2α ‘de 3 a 6% em relação aos controlos de veículo. A redução limitada nos níveis de ARNm CK2 é provavelmente devido ao tempo de recolha da amostra, isto é, 11 dias após o segundo tratamento. O tecido tumoral foi lisadas e fraccionadas em matriz nuclear e citosol para análises de imunotransf erência. Os resultados representativos para os tumores de cada grupo são apresentados na Figura 5c. A densidade das bandas para CK2α e CK2α ‘proteínas foram calculados para todos os tumores e nos níveis de proteína CK2α médios fracção matriz nuclear de 1,06 ± 0,19 para 33 ng /kg e 0,68 ± 0,06 para 330 ng /kg, e CK2α média “proteína níveis de 0,83 ± 0,17 e 0,43 ± 0,03 para 33 e 330 ng /kg, respectivamente, foram observadas em relação aos controlos (Fig. 5C, painéis superiores). Na dose mais elevada, tanto CK2α e CK2α ‘níveis de expressão de proteína foram igualmente diminuiu (CK2α 0,51 ± 0,12; CK2α’ 0,39 ± 0,11). No compartimento citosólico, bem como (Fig. 5c, painéis inferiores)

tumores dos nódulos linfáticos foram analisados ​​por imunodetecção indirecta para uma resposta de sinalização relacionados com CK2 na AKT e vias de NF-kB. Grandemente reduzida fosforilação da S129 local específico CK2-AKT-1 [37] foi observada após tratamento com 33 ng /kg ou de 330 ng /kg S50-Tbg- ARN-CK2 (Fig. 5D, painéis superiores). De igual modo, uma perda dramática de NF-kB p65 proteína total também foi detectado, especialmente a 330 ng /kg a TBG-ARNi-CK2 (Fig. 5D, painéis centrais).

ARN a partir de S50-Tbg- RNAi- CK2 tumores tratados nos dias 5, 6 e 10 a partir de uma experiência independente foi analisada utilizando a técnica de 5 ‘RACE modificado para mapear potenciais locais de clivagem. ARN a partir de um tumor tratado S50-Tbg- siCK2, bem como a partir de tumores de controlo foram incluídas como comparadores. Dia 5 e 6 tumores representam 2 tratamentos de s50-TBG-RNAi-CK2 dadas nos dias 1 e 4. Dia 10 tumores representam 3 tratamentos de ambos os s50-TBG-RNAi-CK2 ou -siCK2 nos dias 1, 4 e 7. A dados indicam que os produtos de clivagem CK2α RISC são detectados nos dias 6 e 10 (Fig. 5e). Em contraste com as células em cultura, o produto de clivagem CK2α ‘não foi detectada. produtos de RACE foram sequenciados para ambos S50-Tbg- RNAi-CK2 e -siCK2 tumores tratados, e o local de clivagem detectada foi a mesma, como mostrado na Fig. 2c. Reduzida expressão de mRNA CK2α de 10 a 20% no dia-6 e dia-10 tumores foi verificada.

Discussão

Nós já sugeriu a promessa e adaptabilidade deste ácido nucleico dirigida ao tumor com base terapia alvo CK2, tanto o câncer de próstata e na cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço [14], [15], [30], [38], [39]. Aqui nós fornecemos dados sobre a protecção de uma carga oligômero pela TBG nanoencapsulação, a ligação de células malignas ou captação de nanocápsulas de TBG em células em cultura e em locais de câncer de próstata relevantes em ratos, possível e observado mecanismos de ação para uma única cadeia de ADN /ARN quimérico RNAi oligômero, e os dados de terapia xenotransplante rato piloto de prova de conceito.

no estudo piloto terapia, observou-se eficácia usando s50-TBG-RNAi-CK2 em um

in vivo

modelo CaP a relativamente baixa dosagem de 330 ng /kg, o que representa apenas dois tratamentos. A este nível de dose, os efeitos sobre o peso do tumor primário e a formação de tumor metastático e o volume aparente e foram concordantes com expressão diminuída CK2 e sinalização. Os nossos resultados de dose-2 comparam-se favoravelmente com outro relatório de uma dose baixa de

In vivo gene

silenciamento no qual a entrega de siRNA não específico à base de lípidos a diminuição da expressão da proteína alvo após uma única dose de 3 ug /kg de [40] . Em comparação com outros sistemas de entrega de siRNA-tumorais alvo, o nosso estudo tratamento agudo alcançado reduzida a expressão da proteína alvo e o peso do tumor em níveis muito mais baixos de dose [5], [6]. Foi utilizado um veículo de controlo neste estudo particular, para fornecer prova-de-conceito que TBG-RNAi-CK2 poderia produzir uma resposta terapêutica adequada em tumores de câncer de próstata xenotransplante. Posteriormente, foi realizado um estudo separado concebido para identificar um oligômero encapsulado em TBG que poderia servir um controle para o RNAi terapêutico encapsulado. Este estudo foi realizado utilizando tumores do flanco para facilitar a medição direta do volume do tumor. Comparação de oligómeros de ARNi em relação ao veículo de controlo levou à identificação de um controlo apropriado, em APC, e os resultados comparativos demonstraram que ambos os controlos de veículo e de ARNi deu resultados análogos (ou seja, as alterações de volume do tumor se sobrepõem totalmente). Assim, os resultados mostrados na Fig. 5c fornecer a prova-de-conceito que TBG-RNAi-CK2 é capaz de induzir a morte de células tumorais

in vivo

que é atribuível ao alvo CK2. Além disso, as células PC3-LN4 utilizados nestes estudos são um modelo para PTEN-nulo, o receptor de androgénio (AR), que não expressam, e independente de androgénios metastático CaP. Enquanto sinalização AR é considerado importante para a sobrevivência das células APC, independentemente do fenótipo resistente à castração [41], [42], os tumores de xenoenxertos PC3-LN4 utilizados para estes estudos servido para fornecer dados de prova de conceito.

a utilização de oligómeros de cadeia simples para a actividade de ARNi em células em cultura e em ratinhos foi anteriormente documentada [43], [44]. Além disso, demonstrou-se que a substituição de resíduos de ADN na extremidade 5 ‘da cadeia guia (isto é, as posições da região de sementes 2-8) produz uma molécula de ARNi com actividade de silenciamento do gene e o mínimo de efeitos fora do alvo; ao passo que os resíduos de ARN na extremidade 3 ‘da cadeia de guia são essencial [45]. Uso do nosso ADN /ARN quimérico oligómero RNAi-CK2 de cadeia simples combina a eficiência de entrega de apenas o fio de guia com o potencial de redução de efeitos fora do alvo, devido à ausência de um fio de passageiros. Nós demonstramos pela

in vitro

experimentos que ambos os mecanismos de silenciamento antisense- e siRNA foram induzidas por RNAi-CK2; Além disso, depois da utilização do S50-Tbg- RNAi-CK2 para tratar tumores de xenoenxerto, que mostrou que RISC clivado CK2α mARN foi recuperado 2 a 3 dias pós-tratamento. Não detectamos ‘produto de clivagem em tumores tratados, embora CK2α’ CK2α níveis de proteína diminuiu. Isto sugere que os oligômeros RNAi-CK2 que contêm uma incompatibilidade para CK2α humana “mRNA e 2 descasamentos a célula do rato estromal CK2α ‘mRNA pode ser prioritariamente induzir RNase H em vez de clivagem RISC mediada desta transcrição

in vivo

. Esta noção é apoiada pela abundância substancialmente reduzida do produto de clivagem a CK2α ‘observado com qualquer um siRNA-CK2 ou ARNi-CK2 nos estudos de cultura de células. Como alternativa, RNAi-CK2 pode estar bloqueando a tradução de transcritos CK2α ou CK2α ‘em proteína.