Abstract
Fundo
A activação de vias de sinalização embrionárias quiescentes no pâncreas adulto é uma característica de câncer pancreático (PC). Estas descobertas conduziram ao desenvolvimento de novos inibidores de vias tais como Notch e sinalização Hedgehog que estão actualmente em ensaios clínicos de fase precoce no tratamento de vários tipos de cancro. sinalização retinóide também é essencial para o desenvolvimento do pâncreas, e terapia retinóide é usado com sucesso em outras doenças malignas, como leucemia, mas pouco se sabe a respeito de sinalização retinóide no PC.
Metodologia /Principais Achados
Nós investigamos o papel de retinóide sinalização
in vitro
e
in vivo
no pâncreas normal, lesão pancreática, regeneração e câncer. sinalização retinóide é activa em células ocasionais no pâncreas adulto, mas está marcadamente aumentada em todo o parênquima durante a lesão e da regeneração. Ambos os modelos quimicamente induzidas e geneticamente manipuladas de rato PC exibem uma falta de actividade de sinalização retinóide pâncreas em comparação com o normal. Como consequência, nós investigamos celular Retinóide Binding Protein 1 (CRBP1), um regulador chave da sinalização retinóide conhecida por desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro da mama, como um potencial alvo terapêutico. Perda, ou a regulação negativa significativa de CRBP1 estava presente em 70% de PC humana, e foi evidente nas lesões precursoras mais precoces (PanIN-1a). No entanto,
In vitro
ganho e perda de estudos de função e camundongos knockout CRBP1 sugeriu que a perda de expressão CRBP1 por si só não foi suficiente para induzir a carcinogênese ou para alterar a sensibilidade PC para retinóide terapias baseadas.
Conclusões /Significado
em conclusão, a sinalização retinóide parece desempenhar um papel na regeneração pancreática e carcinogênese, mas ao contrário do câncer de mama, não é mediada diretamente pelo CRBP1
Citation:. Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson A, Pinese M, et al. (2011) retinóide Sinalização na Cancro do pâncreas, Lesões e Regeneração. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10.1371 /journal.pone.0029075
editor: Hidayatullah G. Munshi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Outubro, 2011; Aceito: 20 de novembro de 2011; Publicação: 29 de dezembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Colvin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (CINSW), o Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália (# 427655), The Cancer Council de Nova Gales do Sul, Fundação Clínica do St. Vincent, o Royal Australian College of Surgeons, o australiano Fundação Cancer Research, The Avner Nahmani Fundação do cancro do pâncreas, ea RT Municipal Trust. AVB, CJS, DKC, EAM e EKC são apoiados por bolsas do CINSW (06 /RSA /1-05; 08 /RSA /1-15; 07 /CDF /1-28; 09 /CDF /2-40; 10 /CRF /1-01). RLS é um Fellow Diretor Sênior do NHMRC e ocupa a Cadeira Petre do cancro da mama Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a evidência crescente apoia um papel central para as vias de sinalização de desenvolvimento, como Notch [1] e Hedgehog [2], [3], [4], no cancro do pâncreas, com inibidores destas vias actualmente em ensaios clínicos de fase precoce . Notch e hedgehog estão também envolvidos na lesão pancreática, regeneração e reparação de [5], as condições que são conhecidas por predispor para o cancro. sinalização retinóide é vital para a formação de pâncreas embrionário [6], [7],
Os retinóides são naturais [8], mas pouco se sabe sobre seu potencial papel no câncer de pâncreas. ou análogos da vitamina A sintéticos, que têm foi usado com sucesso no tratamento de leucemia promielocítica aguda (APL) [9]. Apesar do sucesso do tratamento retinóide na APL, o tratamento de tumores sólidos tem tido êxito limitado [10], [11], e algumas evidências sugerem que esta resistência à terapia retinóide pode ser devido a aberrações na sinalização retinóide. Regulação negativa de receptores de retinóides tem sido relatada em muitos cancros, tais como cancro da mama, do pulmão, da próstata e cancro do esófago [11], e a regulação negativa dos componentes a montante envolvidos no metabolismo e armazenamento retinóide estão a emergir como possíveis reguladores chave da carcinogénese e contribuintes para a resistência ao retinóide terapias baseadas.
Cellular retinóide Binding Protein 1 (CRBP1) desempenha um papel importante na sinalização retinóide e regulação negativa da expressão CRBP1 ocorre na mama [12], próstata [13], gástrica [14] e do ovário [15] cancros. A perda da expressão CRBP1 em epitélio de mama leva à perda de diferenciação e a progressão do tumor por interferência com o armazenamento de retinóide e o seu metabolismo para o metabolito activo, o ácido retinóico, produzindo uma deficiência retinóide localizada [16], com a capacidade de resposta alterada retinóide [17] e a transformação celular .
o câncer de pâncreas (PC) é a quarta principal causa de morte por cancro nas sociedades ocidentais, com uma taxa de sobrevida em 5 anos total inferior a 5% [18]. Avanços em regimes de quimioterapia neoadjuvante e adjuvante resultaram em alguma melhoria nos resultados, mas pancreatectomy continua a ser a única modalidade de tratamento mais eficaz para o PC, e oferece a única possibilidade de cura. Apenas 20% dos pacientes apresentam com doença localizada, não metastático, que é adequado para ressecção [19]. Aqueles que passam por ressecção e receber terapia adjuvante tem uma sobrevida média de 12-22 meses e uma sobrevida de 20-25% [20] 5 anos. Existentes terapias sistémicas são apenas modestamente eficaz e a sobrevida média para pacientes com doença metastática permanece 6 meses. Consequentemente, há uma grande necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas para o câncer de pâncreas.
Aqui nós identificamos um potencial papel para a sinalização retinóide em câncer pancreático e regeneração de pâncreas e, como consequência, pode constituir um mecanismo targetable para o desenvolvimento de novos estratégias terapêuticas. Perda de CRBP1, um regulador chave da sinalização retinóide e importante no cancro da mama, embora frequente em PC, ao contrário de cancro da mama não era por si só suficiente para induzir a transformação.
Métodos
Ética Declaração
a aprovação ética para a experimentação animal foi obtido a partir Comitê de Ética em Garvan Institute animal (os números de homologação 09/53; 07/10). aprovação ética multicêntrico foi obtido a partir de Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de hospitais de ensino: Westmead Hospital, Hospital Concord, Royal Prince Alfred Hospital e Campus Hospital St. Vincent, em Sydney para a aquisição de tecido fresco e arquivamento e registo de dados clínico-patológicos de pacientes com a diagnóstico de câncer pancreático. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
ratos RARE-LacZ
ratos
RARE-LacZ contêm um transgene LacZ controlado por um elemento de resposta do ácido retinóico (raro). As células com coloração de sinalização RA ativa positivo para β-galactosidase (β-gal). animais não tratados (n = 8) foram sacrificados em 10-12 semanas de idade e seus pâncreas colhidos para a coloração de β-gal.
Murino Pancreatite Modelo
Um induzida ceruleina-modelo de pancreatite crônica foi usado, semelhante aos modelos anteriores [21]. Os ratinhos (n = 16) foram tratados com injecções repetidas intra-peritoneais de ceruleina (MP Biomedicals, Solon, OH) cinco vezes por dia, duas vezes por semana durante 10 semanas. Neste modelo a regeneração celular acinar completa é relatado para ocorrer até 6 semanas após a interrupção do tratamento ceruleina. Portanto, os ratinhos foram sacrificados às 0, 2, 4 e 6 semanas após a cessação das injecções Ceruleína e seus pâncreas colhidos, a fim de investigar a sinalização RA em vários pontos de tempo durante o período de recuperação.
modelos murinos do cancro do pâncreas
ratinhos RARO-LacZ (n = 10) 10 semanas de idade foram tratados com 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) como anteriormente descrito [22]. Os ratos foram sacrificados quando demonstraram sinais de doença ou 9 meses de tratamento e tecidos recolhidos para a coloração de β-gal pós-DMBA.
LSL-Kras
G12D /+, LSL-Trp
53R172H /+ ratos, e Pdx1-Cre foram obtidos a partir dos modelos do rato do Consórcio Humano do Câncer do Instituto Nacional do Câncer (Frederick, MD). Para gerar tumores pancreáticos em que a atividade de sinalização RA poderia ser avaliadas ratos RARE-LacZ foram cruzados com LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; ratos Pdx1-Cre para gerar LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; Pdx1-Cre; RARE-LacZ filhos (n = 8). camundongos transgênicos quádruplos foram deixados para a idade até tumores formados em que ponto eles foram eutanásia e tecidos foram coletadas para a coloração de β-gal.
coloração β-galactosidase
4 mm secções pancreáticas foram de-encerado e re-hidratadas antes de desmascarar foi conseguida utilizando uma solução de meta-recuperação (S2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) num banho de água a ferver durante 20 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi extinta com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol. As secções foram incubadas durante 1 hora com anti-01:50 β-galactosidase (AB616) anticorpo policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Um sistema de detecção anti-coelho marcado com peroxidase de rábano polímero foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante (Envision + anti-coelho; DAKO Corporation, CA). 3,3′-diaminobenzidina foi utilizado como um substrato. Contra-coloração foi realizada com hematoxilina de Mayer (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).
coorte de pacientes
Nós identificamos um grupo de 90 pacientes que foram submetidos a ressecção pancreática ou biópsia a partir desses hospitais. Esta coorte representa um subconjunto de um grupo descrito anteriormente de 348 pacientes [23], [24].
CRBP1 Imunohistoquímica
pâncreas do tecido micro-matrizes (4 mm seções) foram de-encerados e re-hidratadas antes de desmascarar foi conseguida utilizando uma solução de meta-recuperação (S1699, pH 6,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) numa panela de pressão durante 5 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi extinta com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol. As secções foram incubadas durante 1 hora com anti-CRBP1 01:50 (FL-135) anticorpo policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Um sistema de detecção anti-coelho marcado com peroxidase de rábano polímero foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante (Envision + anti-coelho; DAKO Corporation, Carpenteria, CA). 3,3′-diaminobenzidina foi utilizado como um substrato. Contra-coloração foi realizada com hematoxilina de Mayer (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).
até três amostras separadas de pâncreas foram examinados por paciente. A coloração foi avaliado por dois observadores independentes para cada caso (E.K.C. e S.A.O.). Normalização de pontuação foi alcançada através da comparação dos resultados entre os observadores e pela conferência, onde qualquer discrepância foram resolvidas por consenso. Pontuações foram dadas em percentagem de células com coloração citoplasmática positivo dentro da área representativa do tecido núcleo de micro-arranjo, e a intensidade absoluta da coloração citoplasmática numa escala de 0 a 3 (0 representando nenhuma coloração, uma representando a coloração citoplasmática heterogénea, 2 representando coloração citoplasmática homogênea, e 3 representa intensa coloração citoplasmática homogênea). Uma contagem positiva para CRBP1 foi determinado com base nos seguintes critérios:. 50% de células com coloração citoplasmática homogénea, com uma intensidade de 1 |
Análise de sobrevivência foi realizada utilizando análise de Kaplan-Meier, com diferenças na sobrevivência avaliada pelo teste de Log-Rank usando StatView 5.0 Software (Abacus Systems, Berkeley, CA):
linhas de célula pancreática
foram utilizados seis linhas celulares de cancro do pâncreas:. AsPC-1, BxPC -3, Capan-2, HPAC, MiaPaCa2 e PANC1 (ATCC, VA, EUA). Estas linhas celulares foram cultivadas de acordo com protocolos de ATCC. células pancreáticas humanas epiteliais ductal (HPDE e HPDE-EcoRI) foram utilizados como um controlo normal (gentilmente fornecida por Ming-som-Tsao, Ontario Cancer Institute) e cultivadas como descrito anteriormente [25].
Western blotting
os extractos de proteína foram visualizadas usando 4-12% Bis-Tris géis pré-moldados (Invitrogen, Victoria, Austrália) e transferidas para membranas de PVDF de acordo com o protocolo do fabricante. Os filtros foram bloqueados com 5% de leite desnatado em tampão TBST. O anticorpo anti-CRBP1 (FL-135) foi utilizado em 1:500 dia para o outro. As membranas foram então incubadas com imunoglobulina anti-coelho (IgG) conjugado com peroxidase de rábano (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Austrália) durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por reagente de quimioluminescência aumentada (Perkin Elmer, Waltham , MA).
extracção de ARN e a síntese de ADNc
ARN a partir de linhas de células pancreáticas foi extraído utilizando Trizol® Reagent (Invitrogen, Victoria, Austrália) de acordo com as instruções do fabricante. cDNA foi sintetizado usando ABgene® reverso-IT ™ RTase Blend (ABgene, Surrey, Reino Unido) com uma mistura de Oligo dT e aleatória hexâmeros usando o First Strand método de síntese. Seguindo a desnaturação do ARN a 70 ° C, transcrição reversa (RT) as reacções foram realizadas num ADN termociclador motor díade ™ (MJ Research, Waltham, MA) com o programa de passo a passo de 25 ° C durante 10 minutos, 35 ° C durante 30 minuto, 47 ° C durante 45 minutos, depois 75 ° C durante 10 minutos.
quantitativa PCR em tempo real (QPCR)
TaqMan ® ensaios de expressão de gene (Applied Biosystems, Victoria, Austrália) de CRBP1 (Hs00161252_m1) foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. GAPDH (4326317E, TaqMan ® controle endógeno) foi usado como um controle endógeno. reações TaqMan® qPCR foram realizadas em triplicata utilizando o Prism 7900HT Sistema ABI Sequence Detection (Applied Biosystems, Victoria, Austrália). As curvas padrão foram incluídos para assegurar que as reacções foram realizadas na gama linear e foram utilizadas para ajustar o rendimento da reacção. As condições dos ciclos incluiu passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 4 minutos, seguido de 95 ° C (30 segundos) e 72 ° C (30 segundos) para 60 ciclos.
knockdown de CRBP1 em células HPDE
dois curto de ARN gancho de cabelo (shRNA) As construções de direccionamento CRBP1, siCRBP1-a e siCRBP1-B, bem como um controlo scrambled, siCRBP1-mexidos, (amavelmente fornecida por Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, NY) foram usados para transfectar Phoenix células usando o reagente de transfecção FuGENE (Roche, NSW, Austrália). sobrenadantes retrovirais foram recolhidos e usados para infectar células HPDE-EcoR. Puromicina (1 jag /ml) foi usado para seleccionar as células infectadas com sucesso. knockdown bem sucedida de CRBP1 foi determinado por western blot.
3D cultura de células de HPDE
células de HPDE-EcoR infectados com shRNA foram crescidas em lâminas de câmara revestida com Matrigel factor de crescimento reduzida (BD Biosciences, San mangueira, CA) em meio isento de soro de queratinócitos (Invitrogen, Victoria, Austrália) suplementado com factor de crescimento epidérmico, extracto de pituitária de bovino, 10% de soro fetal de vitelo e 2% de matrigel, durante 20 dias. Media foi trocada a cada 4 dias. estruturas 3D foram recuperados a 3, 7, 10, 15 e 20 dias, utilizando a solução de recuperação de células BD (BD Biosciences, San mangueira, CA) e proteína extraída por western blot.
transfecção estável de células MiaPaCa2
Quatro clones diferentes de células MiaPaCa2 que expressam diferentes níveis de CRBP1 (MP2
CRBP1 células) e os seus respectivos controlos foram criadas para avaliar o efeito da expressão em células MiaPaCa2 CRBP1. As células foram criadas usando o pcDNA ™ 6.2 /plasmídeo GFP (Invitrogen, Victoria, Austrália) e o plasmídeo pQCXIP (Clontech Laboratories, Mountain, View, CA) contendo o gene CRBP1. Os vectores foram transfectados utilizando Amaxa Tecnologia Nucleofector® (Lonza AG Colónia, Colónia, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas com pcDNA ™ plasmídeo 6.2 /GFP foram ainda classificadas quanto à expressão de GFP por citometria de fluxo para enriquecer a população de células que expressam GFP /CRBP1. A expressão de CRBP1 em cada população foi confirmada por Western blot. As células foram tratadas com 2, 5 ou 10 mM de todos-
trans
-retinóico (ATRA; Sigma-Aldrich, St Louis, MA) no Dia 1. As células foram colhidas e contadas no dia 1, 2, 4 e 6 para medir a proliferação celular.
ADN extracção
1 milímetro núcleos de tecido foram removidos a partir de amostras de PC humanos embebidos em parafina e fixado em formalina e o ADN foi extraído utilizando o kit de tecido Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. ADN a partir de linhas de células foi extraído usando um kit de extracção de ADN (Stratagene, Santa Clara, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
tratamento com bissulfito
o tratamento com bissulfito foi efectuado utilizando os métodos anteriormente descritos [ ,,,0],26] com pequenas modificações. Em resumo, 1 ug de ADN foi desnaturado por tratamento com NaOH 0,3 M e modificada com bissulfito de sódio 3 M durante 6 horas. DNA modificado foi purificado utilizando o QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). tratamento com bissulfito foi terminada por adição de 5,5 ml de NaOH 3 M, precipitadas com etanol e ressuspensas em 50 ml de Solução de ADN hidratação (Tissue Kit Gentra Puregene, Qiagen, Valencia, CA).
A metilação específica de PCR (MSP )
padrões de metilação do DNA na ilha CpG de CRBP1 em linhas de células pancreáticas humanas e amostras humanas foram determinadas por MSP usando primers previamente publicados [26], [27]. As amplificações de PCR foram realizadas em 12,5 ul misturas reaccionais contendo 1 a 5 uL de ADN tratado com bisulfito, dNTPs (cada a 200 | iM), iniciadores (0,4 mM de cada um de reacção), MgCl 1,5 mM
2, 0,75 unidades de ADN AmpliTaq Gold® polimerase (Applied Biosystems, Victoria, Austrália), e 1 × tampão PCR II (Applied Biosystems, Victoria, Austrália). MSP foi realizada utilizando as seguintes condições: 95 ° C (30 segundos), 58 ° C (30 segundos), 72 ° C (30 segundos) para 40 ciclos. As condições dos ciclos incluiu um passo inicial de desnaturação a 95 ° C durante 10 minutos e alongamento final a 72 ° C durante 10 minutos. Todos os produtos de PCR foram visualizados utilizando 1,5% de gel de agarose. iniciadores MyoD [28] foram utilizados como um controlo para a qualidade do ADN tratado com bisulfito. Estes primers não contêm sequências CpG
5-AZA e TSA tratamento
células
MiaPaCa2 foram tratados como se segue:. (1) tratados no dia 1 com 300 mM de 5-aza-2’desoxicitidina (5-AZA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) e colhidas no dia 4; (2) tratados no dia 1 com 100 nM de Tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) e colhidas no dia 4; (3) tratados nos dias 1 e 3 com TSA e colhidas no dia 4; (4) tratados no Dia 1 com 5-AZA, dias 2 e 3 com TSA e colhidas no dia 4; (5) tratados no dia 1 com 5-Aza, Dias 2, 3 e 5 com TSA e colhidas no dia 6. As células não tratadas e de HPDE MiaPaCa2 foram usadas como controlos. Durante o tratamento, a mídia foi alterado diariamente, e as células foram lavadas duas vezes com PBS frio antes de ácido nucleico e /ou extração de proteínas.
Resultados
sinalização retinóide no pâncreas normal, lesão pancreática e regeneração
ácido retinóico elemento de resposta (RARE-LacZ) ratos repórter que marcam as células com retinóide activo de sinalização [29] mostrou que, em pâncreas normal, a sinalização retinóide activo é restrita às ilhotas de Langerhans e única rara, ou pequenos grupos das células exócrinas, com um acinar ou centro-acinar com base na localização e morfologia (Figura 1). Repetido a injecções intraperitoneais de ceruleina colecistoquinina análogo [30] induz a pancreatite crónica em ratinhos com alterações morfológicas, tais como a perda de massa de células acinares e um aumento de fibrose pancreática semelhante ao visto na condição humana. Para investigar sinalização retinóide na definição da lesão pancreática e regeneração, que induzida pancreatite em ratinhos RARO-LacZ. Os ratinhos foram tratados durante 10 semanas com injecções intraperitoneais de caeruleina, sacrificados após a cessação do tratamento, ou deixadas a recuperar durante 2, 4 ou 6 semanas. Os ratos sacrificados imediatamente após a última injecção de ceruleina (no momento da lesão aguda) tinham significativamente menor pâncreas devido a atrofia das células acinares e fibrose com a formação de “complexos tubulares”, uma manifestação de acinar para ductal metaplasia, as primeiras alterações morfológicas associadas com a carcinogênese pancreática (Figura 2A) [31], [32].
actividade de sinalização RA no pâncreas de ratos RARE-LacZ tratados com ceruleína (e), e posterior recuperação por 2 semanas (F) , 4 semanas (G) e 6 semanas (H). actividade de sinalização retinóide sido observado um aumento em uma proporção significativa de células acinares, imediatamente após a cessação do tratamento caeruleina (E), com actividade retinóide atingindo um máximo de 2 semanas (F), a diminuir a 4 semanas (G) e retornando aos níveis próximos normais após 6 semanas de recuperação (H).
em 2 semanas após a interrupção do tratamento ceruleina, a regeneração exócrina tinha começado com um aumento na massa das células acinar, mas com complexos tubulares residuais e um infiltrado inflamatório persistente (Figura 2B ). Aos 4 e 6 semanas, exócrina pancreata tinha perto totalmente, mas não completamente regenerada, com unidades acinares ocasionais ainda exibindo Lumena alargada e um discreto infiltrado inflamatório ao redor (Figuras 2C e 2D). coloração β-galactosidase de pâncreas de ratinhos tratados com ceruleína-LacZ-RARA revelou um aumento da actividade de sinalização retinóide em uma grande proporção de células acinares imediatamente após a cessação do tratamento caeruleina (Figura 2E). A actividade retinóide atingiu um máximo de 2 semanas e diminuiu em 4 semanas com níveis quase normais em 6 semanas (Figuras 2F, G, H).
sinalização retinóide em câncer pancreático
Para determinar se retinóide sinalização em o pâncreas foi alterada durante a carcinogênese investigamos actividade retinóide de sinalização na induzido quimicamente (DMBA) [22] e modelos de ratos geneticamente modificadas de câncer de pâncreas [33]. DMBA ratinhos tratados RARE-LacZ desenvolvidos pouco diferenciados, tumores sarcomatóides (Figura 3A) com uma ausência distinta de todas as células que exibiram sinalização retinóide ativa, apesar do exame das várias seções (Figura 3B). Pâncreas promotor específico conduzido Cre recombinase (Pdx1-Cre) indução da expressão de Kras activados e p53 mutante dentro do pâncreas são atualmente o modelo murino de engenharia genética mais adequado do câncer de pâncreas. Estes LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
R172H /+ /Pdx1-Cre ratinhos desenvolvem lesões precursoras pancreáticas (PanIN) que o progresso para adenocarcinoma ductal pancreático altamente invasivo e metastático em uma média de 5 meses [33 ]. Estes ratos foram cruzados com ratinhos repórter RARE-LacZ para gerar LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
camundongos R172H /+ /Pdx1-Cre /RARE-LacZ. tumores pancreáticos, que eram predominantemente moderadamente diferenciados e contidos estroma desmoplásico abundante formado em todos os ratos. Houve novamente uma ausência completa de atividade de sinalização retinóide nestes tumores e lesões precursoras apesar de corte múltipla e avaliação por 2 observadores independentes, um dos quais era um patologista pancreático especialista (Figura 3D, E, F).
em tumores de ratos tratados com DMBA RARO-LacZ, foi observada uma ausência distinta de todas as células que exibem sinalização retinóide activo (B). Em LSL-KrasG12D /+; LSL-Trp53R172H /+; Pdx1-Cre; tumores pancreáticos RARE-LacZ e lesões precursoras, também houve uma completa ausência de retinóide sinalização actividade (D e F, respectivamente)
Perda de expressão CRBP1 é um evento comum e precoce do câncer de pâncreas
Cellular retinóide Binding Protein 1 (CRBP1), um regulador chave da sinalização retinóide é pensado para desempenhar um papel significativo na carcinogênese mamária [16], [34]. observações preliminares também identificou a regulação baixa dos níveis de transcrição CRBP1 no PC [35] e PanIN [36]. Como consequência, nós investigamos perda de CRBP1 como uma causa potencial da sinalização retinóide diminuição no PC, e um papel na carcinogênese pancreática.
Em uma coorte de 90 pacientes, imuno-histoquímica mostrou regulação baixa significativa da expressão da proteína CRBP1 em 70 %, com a perda completa de expressão em 50% destas (35% do total; Figura 4A, B, C, D). Perda ou infra-regulação da expressão CRBP1 ocorreu no início do desenvolvimento PC e estava presente em 100% dos PanIN-1A e 1B lesões dos pacientes que tiveram expressão aberrante dentro de seu câncer (Figura 4E, F). A perda da expressão CRBP1 também foi encontrada em 50% das lesões precoces precursoras (PanIN1A e 1B) associados com pancreatite crónica, um factor de risco conhecido para o PC. Nem a perda, nem infra-regulação da expressão foi associada com o resultado do paciente (Log-Rank
P
= 0,3539; Figura S1). Além disso, quatro das linhas de células PC 6 demonstraram a perda ou a regulação negativa da expressão CRBP1 (Figura 5A e B).
(C) CRBP1 estado de metilação em linhas celulares PC e (D) recuperação da CRBP1 expressão com o tratamento combinado de células MiaPaCa2 com 5-Aza e TSA. (E) CRBP1 knockdown no estavelmente transfectadas células HPDE-EcoR. (F) células HPDE cultivadas em 3D demonstrar nenhuma mudança na morfologia entre as células siCRBP1 e mexidos controle.
Perda de expressão CRBP1 está associada com o promotor reversível hipermetilação
A metilação específicas de PCR (MSP ) e sequenciamento genômico bissulfito (BSG) identificou CRBP1 promotor hipermetilação em 27,3% das 33 amostras de PC humanos sem expressão CRBP1 em contraste com 5 de 5 amostras de pâncreas normais pareados que não foram metilados. CRBP1 hipermetilação do promotor foi detectada em células MiaPaCa2 (Figura 5C), e tratamento com o agente de desmetilação 5-aza sozinho, ou em combinação com o inibidor de HDAC TSA, a expressão induzida de ARNm CRBP1 (Figura 5D). A capacidade de reverter CRBP1 silenciar farmacologicamente apresentou a oportunidade potencial para usar retinóides e inibidores de HDAC como terapias combinadas para atingir terapeuticamente CRBP1.
regulação negativa da expressão CRBP1 em linhas celulares e modelos de rato
Para avaliar a papel de CRBP1 regulação negativa na carcinogénese do pâncreas, células imortalizadas ductal pancreático humano epiteliais que expressam o receptor de ratinho retroviral ecotrópica (HPDE-EcoRI) foram retroviralmente transduzidas com duas construções de direccionamento shRNA CRBP1, bem como um controlo scrambled. As células foram então cultivadas em cultura em 3D durante 20 dias. Western blot demonstrou 50% de knockdown expressão CRBP1 (Figura 5E), no entanto, não havia diferença discernível na morfologia em comparação com os controlos (Figura 5F). Além disso, os pâncreas de ratinhos knockout CRBP1 12 meses de idade [37] (gentilmente cedido pelo Prof. Pierre Chambon) não revelou diferenças morfológicas óbvias em comparação com ratinhos de controlo (dados não apresentados).
CRBP1 sobreexpressão em células MiaPaCa2
a fim de examinar os efeitos da restauração da expressão CRBP1, as células MiaPaCa2, que normalmente não expressam CRBP1 foram transfectadas de forma estável para gerar vários clones expressando diferentes níveis de CRBP1 (baixo, médio, alto e muito alto) com nenhum efeito sobre as taxas de proliferação em relação ao controle do vetor vazio (Figura S2A) e não alterou a sensibilidade à terapia do retinoid quando tratadas com o ácido trans-retinóico (ATRA) (Figuras S2B e S2C).
Discussão
o papel emergente de vias de sinalização embrionárias desregulados, tais como Notch e Hedgehog [4] está fornecendo oportunidades para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o câncer de pâncreas. sinalização retinóide é indispensável para o desenvolvimento embrionário normal, incluindo a formação do pâncreas nascentes [6], [7], [8]. Os nossos dados mostram que a actividade de sinalização de pâncreas normal restringe-se ilhéus pancreáticos e raras células no pâncreas exócrino, muitos dos quais se assemelhavam células acinares centrotemporais, as células estaminais putativas do pâncreas. Um estudo recente identificou que as células no pâncreas que expressam a enzima de síntese de AR, aldeído desidrogenase 1 (ALDH1), são células centroacinar que exibem características de células progenitoras [38]. Este padrão de actividade é semelhante ao da expressão do factor de transcrição Pdx1 que também é pensado para marcar exócrina progenitoras ou “stem” células. leituras funcionais de
in vivo
atividade de sinalização retinóide utilizando camundongos repórter em nosso estudo sugerem que a sinalização aumentada desempenha um papel na regeneração pancreática após a lesão. sinalização activa, normalmente restrito a tipos específicos de células torna-se difundido até diferenciação de novo ácinos exócrinos é completa. Tratamento de ratinhos com doses repetidas de resultados ceruleina em um aumento dramático nas células ALDH1-positiva, que é assumido para representar o aumento retinóide sinalização [38], apoiando ainda mais as nossas descobertas.
sinalização retinóide desregulada tem sido identificada em muitos tipos de câncer [11], e embora estudos anteriores identificaram expressão aberrante de componentes de retinóide de sinalização, bem como alvos a jusante no PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], pouco se sabia sobre a actividade de sinalização retinóide. Avaliação da actividade repórter sinalização retinóide, tanto o câncer de pâncreas induzido quimicamente, e em modelos geneticamente modificados em nosso estudo demonstrou uma falta de sinalização retinóide. Com base nestas observações, a hipótese de que a falta de sinalização do ácido retinóico pode impedir a diferenciação normal em resposta a estímulos cancerígenos e contribuir para a carcinogênese pancreática, e que a restauração da sinalização retinóide pode proporcionar uma nova opção terapêutica.
Como consequência, investigou-se a papel de CRBP1, um componente chave da sinalização retinóide, e pensados para desempenhar um papel importante na carcinogénese da mama [16], [34]. Identificamos a perda, ou a regulação negativa da expressão CRBP1 (que seria potencialmente conferir a perda de actividade de sinalização retinóide) em 70% dos espécimes de cancro do pâncreas, com uma proporção elevada devido à metilação do promotor. A perda ou a regulação negativa da expressão CRBP1 estava presente nas primeiras lesões precursoras de PC, ambos em associação com PC e na pancreatite crónica, um factor de risco para o desenvolvimento de PC. No entanto, knockdown de expressão CRBP1 em células epiteliais do ducto pancreático imortalizadas não induziu transformação. Da mesma forma, camundongos knockout CRBP1 não demonstraram um fenótipo pancreático em mais de 12 meses de idade. Além disso, a reintrodução de CRBP1 em células PC deficientes em CRBP1 não alterou a insensibilidade terapia retinóide. Importante, dados recentes sugerem que as células estreladas pancreáticos podem desempenhar um papel chave na sinalização do retinóide e resistência à terapia com retinóide
In vivo
[44]. Isso precisa ser levado em consideração, especialmente no que os dados aqui apresentados com foco no componente epitelial pancreática.
Em resumo, lesão pancreática induz actividade de sinalização retinóide no pâncreas, que é difundida durante a lesão e regeneração e potencialmente peças um papel importante neste processo.