Abstract

A ativação de sinais de desvio, como MET e AXL, foi identificado como um possível mecanismo de EGFR-TKI de resistência. Porque várias oncoproteínas depender de HSP90 para a maturação e estabilidade, foram investigados os efeitos da AUY922, um não-geldanamycin inibidor da classe HSP90 recém-desenvolvido, em células de câncer de pulmão com Met e resistência AXL-mediada. Nós estabelecemos linhas de células resistentes com HCC827 células abrigando um exão mutação 19-exclusão no do

gene EGFR

via exposição a longo prazo a concentrações crescentes de gefitinib e erlotinib (HCC827 /GR e HCC827 /ER, respectivamente). resistência HCC827 /GR foi mediada pela ativação MET, enquanto a ativação AXL causado resistência em células /ER HCC827. AUY922 tratamento eficaz suprimiu a proliferação e a morte celular induzida em ambas as linhas de células resistentes. Por conseguinte, a regulação negativa do EGFR, Met, e Axl levou à diminuição da activação de Akt. Os efeitos inibidores de AUY922 sobre cada receptor foram confirmados em células transfectadas com o gene LK2. AUY922 também controlada eficazmente o crescimento tumoral em modelos de ratos de xenotransplante contendo HCC827 /GR e células /ER HCC827. Além disso, AUY922 reduzida invasão e migração por ambos os tipos de células resistentes. Nossos resultados do estudo mostram, assim, que AUY922 é uma opção terapêutica promissora para a resistência Met e AXL-mediada ao EGFR-TKI no cancro do pulmão

Citation:. Choi YJ, Kim SY, So KS, Baek IJ, Kim WS , SH Choi, et al. (2015) AUY922 Efetivamente Supera Met e Resistência AXL-Mediated de EGFR-TKI em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 10 (3): e0119832. doi: 10.1371 /journal.pone.0119832

Editor do Academic: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 26 de agosto de 2014; Aceito: 16 de janeiro de 2015; Publicação: 17 de março de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: J. K. Rho tinha sido atribuído um subsídio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF, 2013R1A1A2005112) e S. H. Choi tinha sido atribuído um subsídio do Instituto Asan para as Ciências da Vida (2014-597). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

do receptor de tirosina-quinase inibidor (EGFR-TKI) é um dos agentes mais bem sucedidos de segmentação usado para tratar o cancro do factor de crescimento epidérmico. No entanto, o desenvolvimento de resistência, apesar das boas respostas iniciais, em pacientes com cancro do pulmão EGFR mutante é inevitável [1,2]. Embora quase metade de toda a resistência TKI é causada por uma mutação T790M secundário [3,4], a ativação de sinais de desvio, como TEM ou AXL também poderia contribuir para a aquisição de resistência [5,6].

amplificação do gene MET provoca HCC827 células que albergam a mutação do EGFR sensibilizante a tornar-se resistentes a gefitinib, através da activação dependente de ErbB3 da via fosfoinositida 3-quinase /Akt (PI3K) [5]. Estudos iniciais relataram que aproximadamente 20% dos pacientes com resistência adquirida ao EGFR-TKI mostrou

MET

amplificação do gene com ou sem T790M [5,7], enquanto um estudo recente sobre a frequência dos mecanismos de resistência revelaram que

amplificação MET desenvolvido em aproximadamente 5% dos pacientes após a resistência [8]. Tratamentos combinados com inibidores de MET e EGFR poderia revogar a ativação de sinais a jusante, superando assim a resistência adquirida aos inibidores do EGFR [5,9]. Vários inibidores de tirosina quinase de MET e MET-bloqueio de anticorpos monoclonais, incluindo SU11274, ARQ197 e onartuzumab, estão em ensaios clínicos [10].

Recentemente, três grupos de estudo independentes relatado que Axl, que está incluído na TAM ( Tyro-Axl-mero) receptor tirosina-quinase (RTK) da família, poderia ser uma causa de resistência EGFR-TKI em modelos pré-clínicos [6]. Apesar de aproximadamente 20% dos pacientes demonstraram AXL sobre-expressão após o desenvolvimento de resistência, em que o estudo, a proporção exacta entre os pacientes com resistência adquirida e os tratamentos que podem ser utilizados para ultrapassar os efeitos do direccionamento AXL em contextos clínicos continuam a ser determinado [11] .

proteína de choque térmico 90 (HSP90) desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase proteína celular por acção sobre a maturação de proteínas e a estabilidade [12]. Uma vez que várias oncoproteínas depender o seu correcto funcionamento, a HSP90 tem sido reconhecido como um alvo terapêutico atractivo [13]. Os ensaios clínicos de segmentação de EGFR mutante, incluindo o mutante T790M com inibidores de HSP90, estão em progresso. Alguns estudos pré-clínicos têm relatado resultados promissores [14-16]. No entanto, não existem dados suficientes sobre como Met ou AXL mediada resistência ao EGFR-TKI no cancro do pulmão poderia ser superados através da inibição da HSP90. Em nosso estudo, nós investigamos a eficácia de AUY922, um não-geldanamycin inibidor da classe HSP90 do Met e AXL mediada por linhas de células resistentes e modelos animais.

cultura celular Materiais e Métodos

e reagentes

HCC827 células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). linhas celulares Gefitinib- e erlotinib-resistentes (HCC827 /GR e HCC827 /ER, respectivamente) foram estabelecidos como parte de um estudo anterior [17]. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS), 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2. AUY922 foi comprado de Selleck Chemicals (Houston, TX).

ensaios de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio MTT. Resumidamente, as células na fase de crescimento logarítmico foram colhidas, semeadas em placas de 96 poços, e cultivadas durante a noite. As células foram expostas a várias doses de AUY922 em meio contendo 1% de FBS. Após 72 horas, o ensaio de MTT foi realizado como descrito por Carmichael et ai. [18]. Para validar os efeitos anticancerígenos de AUY922, as células foram tratadas com as doses indicadas de AUY922 durante 72 horas e as células fixadas foram coradas com uma solução de azul de tripano a 0,2% contendo 50% de metanol. A viabilidade celular foi determinada utilizando um contador de células automático ADAM-MC (NanoEnTek, Seul, Coreia) na accordiance com as instruções do fabricante. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes e as barras de erro indicam o desvio padrão (DP).

análise Western blot

Para transferência western, as proteínas foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida e electrotransferidas para membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA). Os anticorpos específicos para a p-EGFR (Tyr1173), EGFR, AXL, Met, Akt, p-Erk, Erk, Myc, e β-actina foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e os anticorpos para a P-MET ( Tyr1234 /1235), p-AXL (Tyr702), P-Akt, PARP e caspase-3were obtido a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). As proteínas foram detectadas usando uma reforçada quimiluminescência kit western blot (Amersham Biosciences, NJ) de acordo com as instruções do fabricante.

transfecção transitória

pcDNA3 /EGFR (WT) e pcDNA3 /EGFR (delE746- A750) foram fornecidos pelo Dr. TY Kim (Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Seul, Seul, Coreia do Sul). pCMV6-entrada /MET foi comprado de OriGene (Rockville, MD). pcDNA3.1 /AXL (WT) foi construído como parte de um estudo anterior [6]. As transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

ciclo celular análise

As células foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas durante os tempos indicados com 1 umol /L AUY922. Ambos células aderentes e flutuantes foram recolhidas para análise. As células foram fixadas em etanol a 70% arrefecido com gelo durante 1 hora e incubada em 50 ug /ml de ARNase A e 25? G de iodeto de propídio /ml (PI) durante 30 minutos a 37 ° C. A análise quantitativa da distribuição do ciclo celular foi realizada utilizando citometria de fluxo FASCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

In vivo

estudo

Fêmea imunodeficiência combinada severa (SCID ) ratinhos (18-20 g; de 5 semanas de idade, 5 ratinhos /grupo) foram adquiridos a Charles River Laboratories. Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use of Instituto Asan para as Ciências da Vida (2013-01-066). Os tumores foram crescidos por células implantando (1 × 10

6 HCC827 células /g ou 5 × 10

6 células HCC827 /ER) em Matrigel (BD Biosciences) e, subsequentemente, nos flancos do rato. O tratamento com o controlo de veículo iniciado quando os tumores atingiram um volume de 50-100 mm

3 (20 mg /kg AUY922 através de injecção intra-peritoneal, 5 dias /semana). O tratamento foi interrompido no dia indicado, e os ratos receberam exames de acompanhamento para documentar recorrência do tumor. Para medir o tamanho do tumor, o comprimento (

G

) e a largura (

W

) de cada tumor foi medida utilizando compassos de calibre, e o volume do tumor (TV) foi calculada como a TV = (

L

×

W

2) /2. a coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando um anticorpo primário específico (Ki-67; DakoCytomation, Los Angeles, CA), o kit de coloração EnVision Plus (DakoCytomation), e o APO-directo desoxinucleotidilo terminal de mediadas-transferase marcação terminal dUTP nick (TUNEL) Kit de ensaio de (Millipore) como indicado nas instruções do fornecedor. A análise quantitativa de cada secção corada foi realizada pela contagem de todas as células imunopositivas em 5 campos arbitrariamente seleccionados (400 × ampliação).

ensaios

invasão e migração

Todos os ensaios de migração celular e invasão foram realizados de acordo com a um método anteriormente descrito [19]. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes e as barras de erro indicam SDs.

resultados

AUY922 efetivamente inibe a proliferação de células gefitinib /erlotinib resistente

Gefitinib /sublinhas resistentes erlotinib derivadas da linhagem celular HCC827 parental, sensível foram estabelecidos como parte de um estudo anterior [17]. As células foram tratadas com AUY922 de uma forma dependente da dose para determinar se ele inibe o crescimento celular nas células a gefitinib /erlotinib-resistente. Como mostrado na Fig. 1, ambas as linhas de células resistentes demonstraram resistência cruzada a gefitinib ou erlotinib, respectivamente, e também eram resistentes a afatinib. No entanto, o tratamento AUY922 eficazmente suprimida a proliferação da linha parental e ambas as linhas de células resistentes (Fig. 1D). Foram observados os efeitos inibidores do crescimento de AUY922 mesmo quando a concentração de droga era baixa (Fig. 2A).

As células foram tratadas com as doses indicadas de gefitinib, erlotinib, afatinib, ou AUY922 durante 72 horas em meio contendo 1% de FBS. A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT.

A, As células foram tratadas com as doses indicadas de AUY922 durante 72 horas em meio contendo 1% de FBS. células anexas foram coradas com solução de azul tripano (superior). A viabilidade celular baseado na contagem de células é também mostrada (parte inferior). Barras representam a média ± desvio padrão de três poços. B, as células tratadas com AUY922, semelhante ao painel A. Após 48 horas, as células foram colhidas e as moléculas de sinalização relacionados com o EGFR foram avaliados utilizando Western blotting. C, as células foram tratadas com LK2 contendo vector do tipo selvagem EGFR, del E746-E750, MET, ou AXL e as doses indicadas de AUY922 para 12 horas.

Temos demonstrado anteriormente que a resistência de HCC827 /GR e células HCC827 /ER é mediada pelo MET ou ativação AXL, respectivamente [6,17]. Relatos anteriores indicaram também que um grande número de proteínas clientes de HSP90 tem um papel crucial na progressão do cancro, e que a inibição de HSP90 degrada proteínas clientes [13,20,21]. Assim, investigamos se AUY922 afeta a estabilidade do TEM ou AXL. A inibição de HSP90 por AUY922 foi encontrada para levar à degradação significativa do EGFR, Met, e Axl em uma dose (Fig. 2B) e forma dependente do tempo (S1 Fig.). Coerente com isso, o tratamento AUY922 também diminuiu o nível de proteínas induzidas artificialmente em células LK2 que foram transfectadas com genes tais como

EGFR

(WT),

EGFR

(Del E746-E750),

MET

, e

AXL

(Fig. 2C).

Muitos inibidores de HSP90 induzir a paragem do ciclo celular e apoptose em várias células cancerosas [22-26]. Para confirmar ainda mais os efeitos de AUY922, examinámos as alterações do ciclo celular em células coradas com PI, utilizando análise de FACS. Como mostrado na Fig. 3A, o tratamento AUY922 aumentou o número de células na fase G2 /M e induzida sub-G1 (i.e., morte celular), após 48 horas. Consistente com estes resultados, a PARP dependente do tempo e a clivagem de caspase-3 foi também observado (Fig. 3C). Estes dados indicam que os efeitos antitumorais do AUY922 em células parentais resistentes e pode resultar da induo da paragem do ciclo celular e morte celular.

A e B, as células foram tratadas com 0,1 mmol /L durante 24-72 AUY922 horas. Para analisar a distribuição do ciclo celular, as células colhidas foram analisadas por citometria de fluxo. C, os lisados ​​celulares foram analisados ​​através de Western blotting. Os anticorpos indicados foram utilizados para avaliar a morte celular por apoptose.

AUY922 supera a resistência adquirida a gefitinib /erlotinib em modelos de xenoenxerto

HCC827GRand HCC827 /xenoenxertos de tumores ER foram estabelecidos em ratinhos SCID para mais avaliar a eficácia antitumor de AUY922. A taxa de crescimento do tumor de células HCC827 /ER foi menor do que a de células HCC827 /GR. AUY922 tratamento resultou na inibição significativa do crescimento em ambas as células (Fig. 4A). o crescimento do tumor suprimido foi mantida em HCC827 xenotransplantes /ER através de 2 semanas após a suspensão da droga, enquanto que tumores na HCC827 /GR xenotransplante lentamente voltou a crescer após a retirada da droga. As análises de imuno-histoquímica de tecidos tumorais revelou que a proliferação celular tinha diminuído e a apoptose foi induzida em ambos os tumores por tratamento AUY922 (Fig. 4B-C).

A, ratinhos SCID com HCC827 estabelecida /GR e de células de tumor HCC827 /ER xenoenxertos foram tratados com AUY922. O tamanho do tumor foi medido nos dias indicados, e o volume do tumor foi calculado. Setas significam último dia do tratamento medicamentoso (seta vermelha, HCC827 /GR; seta roxa, HCC827 /ER). As barras representam o volume tumoral médio ± DP. B e C, coloração imuno-histoquímica para o Ki-67 e TUNEL seguido por análise quantitativa da proliferação e apoptose em (B) Ki-67

+ células e TUNEL

+ células (C).

* p Art 0,01 e

** p Art 0,001 em comparação com o controle.

AUY922 diminui a mobilidade celular

A indução de AXL ou MET está associada com aumento da mobilidade celular em cancros [6,10,27-29]. Por isso, investigou alterações na mobilidade celular em ambas as células parentais e gefitinib /erlotinib-resistente. Como esperado, as capacidades migratórias e invasivos em ambos os tipos de células resistentes aumentaram dramaticamente em comparação com as células parentais (Fig. 5). tratamento AUY922 resultou em redução de capacidades migratórias e invasivos em ambas as células resistentes e parentais.

As células foram semeadas em ambos os filtros de policarbonato revestido com matrigel colágeno ou para determinar os seus potenciais migratórios e invasivos, respectivamente. As células foram incubadas em câmaras de Boyden modificada, com ou sem as doses indicadas de AUY922 por 24 horas, e as células que penetraram no filtro foram coradas e contadas utilizando um microscópio de luz. Barras representam a média ± desvio padrão de três poços.

* p Art 0,01 e

** p Art 0,001 em comparação com HCC827 células.

Discussão

Uma vez que as variantes de EGFR mutantes, incluindo T790M, foram mostrados primeiro a ser associado a proteínas HSP90 chaperones [16], várias linhas semelhantes de provas ter acumulado. células que expressam T790M que são resistentes mesmo a EGFR-TKI irreversíveis são sensíveis à inibição da HSP90. HSP90 inibição conduz à regressão do EGFR

L858R

-driven adenocarcinoma de pulmão de murino, independentemente da presença de T790M [15]. Bao et ai. também relataram que a segmentação de HSP90 com CUDC-305, um inibidor de HSP90, erlotinib pode superar a resistência no cancro do pulmão de células não pequenas [30]. Além disso, 17-DMAG reduz o crescimento de células de cancro do pulmão com o EGFR mutante, independentemente da presença de uma mutação T790M em modelos de xenotransplante de ratinhos [14]. Actualmente, mais de uma dúzia de inibidores de HSP90 sejam envolvidos em ensaios clínicos, alguns dos quais estão a investigar a resistência mediada pelo EGFR T790M para-TKI [20].

Vários estudos anteriores revelaram que MET é uma proteína cliente HSP90 e é sujeito à degradação da inibição da HSP90. SNX-2112, um novo inibidor de molécula pequena de HSP90, reduz EGF conversa cruzada e activação do receptor de c-Met através de degradação de c-Met em células de cancro do pulmão [31]. Ueno et ai. demonstraram que AUY922 é eficaz contra a maioria das linhas celulares de NSCLC, independentemente de alterações moleculares conhecidos. AUY922 tratamento foi encontrada para induzir a depleção significativa de proteínas clientes, tais como EGFR, Met e Akt, aumentando assim a apoptose [32]. Embora esses estudos têm demonstrado a capacidade de inibidores de HSP90 para regular o TEM, não avaliaram a resistência MET-mediada ao EGFR-TKI no câncer de pulmão. Por conseguinte, Koizumi et al. demonstraram pela primeira vez a eficácia de inibidores de HSP90 para superar a resistência causada por TEM de sinalização [33]. Neste estudo, o HGF-gene transfectado células Ma-1 com o EGFR

L858R

(Ma-1 /HGF) não respondeu ao erlotinib, enquanto 17-DMAG inibiu a proliferação celular e a apoptose induzida por diminuição da expressão de EGFR e MET, mesmo sob estímulos HGF. modelos clinicamente relevantes adicionais foram estudados por Xu et al. [34]. Estes autores gerado modelos de camundongos transgênicos expressando mutante Del19-T790M ou L858R-T790M EGFR (cada um com concomitante MET sobre-expressão). EGFR combinação e inibição MET com WZ4002 (a terceira geração EGFR-TKI) e Crizotinibe demonstraram controle altamente eficaz nestes modelos de cancro, mas nenhum dos sozinho essas drogas poderiam induzir uma resposta supressiva. Estes autores verificaram ainda que os efeitos de 17-DMAG são comparáveis ​​aos Crizotinibe quando combinado com WZ4002, sugerindo, assim, que a inibição MET é possível através de HSP90. Além disso, foi observado um efeito semelhante no modelo de ratinho outro rolamento resistentes a gefitinib Met-amplificado HCC827 xenoenxertos. Estes resultados são quase de acordo com os nossos resultados atuais em um modelo HCC827 /GR. No entanto, nossos resultados apresentam melhor representar um ambiente clínico, porque nossas células HCC827 /GR foram estabelecidas por exposição à droga contínuo a longo prazo.

Em comparação com o TEM, há poucos dados sobre como AXL depende de HSP90 para a estabilidade. Recentemente, Krishnamoorthy et ai. relataram que 17-AAG induz a regulação de endógena ou ectopicamente expressa proteína AXL em linhas celulares de cancro da tiróide e em células HeLa em um tempo e modo dependente da dose, conduzindo à inibição da sinalização AXL-mediada e a actividade biológica [35 ]. Para nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a demonstrar que a inibição HSP90 por AUY922 pode superar a resistência AXL mediada em linhas de células de câncer de pulmão e em modelos animais. Tomados em conjunto, portanto, a evidência indica que, devido a inibição HSP90 pode superar a resistência adquirida ao EGFR-TKI causada pelas três principais mecanismos de resistência (T790M, reuniu-se, e Axl), a inibição HSP90 poderia ser uma opção promissora para o tratamento de resistência EGFR-TKI.

em estudos atuais, temos mostrado que AUY922 suprimiu completamente o crescimento do tumor em ambas as células. No entanto, ambas as células resistentes mostrou o padrão diferente na taxa de crescimento e rebrota após a descontinuação da droga. células HCC827 /GR crescer mais rápido que HCC827 células /ER sob condição de livre de drogas e eles mostraram rebrota após a retirada da droga. A taxa de crescimento de células /ER HCC827 foi mais lento do que as células HCC827 /GR

in vitro

(S2 Fig.). Embora vários factores que podem afectar o crescimento do tumor em modelos de xenotransplante, as diferenças de taxa de crescimento podem influenciar o crescimento do tumor. Na verdade, as células HCC827 /ER tinha EGFR inferior, bem como a actividade de Akt do que as células HCC827 /GR em nível basal (dados não mostrados). Não houve diferenças em apoptose, necrose, paragem do ciclo celular (G2 /M prisão, S3 Fig.) E proliferação entre estes dois tumores. Assim, a resposta diferente para a retirada da droga permaneceram obscuros.

Metástase depende de vários processos, tais como a separação de células tumorais a partir do tumor primário, a migração, a invasão de vasos sanguíneos e do estroma que rodeiam, e sobrevivência e proliferação em locais distantes. factor de crescimento de hepatócitos (HGF), o ligando é conhecido apenas do TEM e é reconhecido como um factor derivado de fibroblastos, que promove o deslocamento de células epiteliais e estimula a invasão [36,37]. MET afeta a migração celular, o crescimento na embriogênese, e controla o crescimento e metástase em células de câncer [38]. Por conseguinte, Wu et al. demonstraram que LY2801653 (um inibidor de MET) inibe significativamente o crescimento do tumor primário e as metástases para os nódulos linfáticos e da parede do peito em modelos ortotópicos H441 [39]. AXL também está associada com a invasão de células de tumores e metástases e promove o crescimento tumoral em vários tipos de cancro. Forçado expressão AXL ectópica induz as características altamente invasivos visto em células cancerosas da mama MCF-7 de fenótipos fracamente invasivas iniciais, enquanto usando o tratamento shRNA para induzir AXL knockdown diminui as capacidades invasivas e migratórias de células cancerosas altamente invasivas [29]. Além disso, AXL é necessária para as células de cancro da mama MDA-MB-231 para metastizar para os pulmões em modelos ortotópicos [27]. Em nossas análises atuais, AUY922 reduziu significativamente as capacidades invasivas e migratórias de ambas as células tumorais com MET ou ativação AXL. Outras investigações sobre o papel da HSP90 inibidores em metástase de câncer são necessários.

Em resumo, AUY922 exerce um controlo efectivo sobre fenótipos malignos que são movidos por MET e AXL, incluindo a resistência aos medicamentos, no cancro do pulmão.

Informações de Apoio

S1 Fig. As células foram tratadas com 0,1 mmol /L AUY922 de um modo dependente do tempo.

As experiências foram realizadas tal como descrito na Fig. 2A e B.

doi: 10.1371 /journal.pone.0119832.s001

(TIF)

S2 Fig. As células (5 X 10

3) foram semeadas em placas de 24 poços com meio contendo completaram 10% de FBS

Os números de células foram determinados com um contador de células automático ADAM MC-

doi:.. 10.1371 /jornal. pone.0119832.s002

(TIF)

S3 Fig. Os tecidos tumorais de cada grupo foram homogeneizados para a preparação lisado e analisados ​​por Western blot para avaliar G2 /M de detenção.

Ciclina B1, anticorpos p21 cdc2 e foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e p-cdc2 ( Tyr15) foi obtido a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA): doi:. 10.1371 /journal.pone.0119832.s003

(TIF)