Sumário

motilidade celular é a base para a invasão de células cancerosas e metástases. No caso de cancro da mama, o tipo mais comum de cancro entre as mulheres, a metástase representa o estágio mais devastadora da doença. O papel central da motilidade celular no desenvolvimento do câncer enfatiza a importância de compreender os mecanismos específicos envolvidos neste processo. Neste contexto, o desenvolvimento de tumores e metástases são a consequência de uma perda ou defeito dos mecanismos que controlam a remodelação do citoesqueleto. Profilina que pertence a uma família de pequenas proteínas de ligação à actina que são pensados ​​para auxiliar no alongamento do filamento de actina no bordo de ataque de células migratórias. Tradicionalmente, profilina I tem sido considerado como um elemento essencial para o controlo da polimerização de actina e a migração celular. Expressão de profilina I é sub-regulada no cancro da mama e várias outras células cancerosas. Em células MDA-MB-231, uma linha celular de cancro da mama, ainda mais a inibição da expressão profilina que promove a hipermotilidade e disseminação metastática, uma descoberta que contrasta com o papel proposto para profilina no reforço de polimerização. Neste relatório, temos aproveitado a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) de GFP-actina para quantificar e comparar a dinâmica de actina no nível de ponta em ambos os modelos de células não-cancerosas e câncer. Os nossos resultados sugerem que (i) um elevado nível de dinâmica de actina (ou seja, uma grande fracção celular de filamentos de actina e um retorno rápido) é uma característica comum de algumas células cancerosas; (Ii) a polimerização de actina mostra um alto grau de independência em relação à presença de fatores de crescimento extracelulares; e (iii) os nossos resultados também confirmam o papel de profilina I na regulação a polimerização da actina, tal como elevando os níveis intracelulares de profilina I diminuiu a relação da fracção celular de filamentos de actina e abrandou a taxa de polimerização; Além disso, o aumento dos níveis Profilin também levou a velocidade de célula individual reduzida e direcionalidade

Citation:. Lorente G, Syriani E, Morales M (2014) actina filamentos na vanguarda das células cancerosas são caracterizados por uma fração móvel de alta e do Regulamento de rotatividade por Profilin I. PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10.1371 /journal.pone.0085817

editor: Yulia Komarova, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de maio de 2013; Aceito: 03 de dezembro de 2013; Publicação: 17 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lorente et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Ministério Espanhol de Investigação (SAF2010-16024; BFU 2012-17537, uma vez 2010 e 2011) e fundos Fundación Rioja. GL foi bolsista da Universidad de Barcelona. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

motilidade celular é um processo complexo que ocorre em todos os tipos de células [1]. A migração sobre uma superfície plana envolve a saliência de uma manta fina membrana, a lamela, preenchido com uma actina intrincada rede ramificada. A força para a saliência membrana e extensão é fornecido por polimerização de actina controlado e limitado na extremidade mais próxima da membrana, o assim chamado bordo de ataque. Durante o alongamento, os filamentos de actina são polarizados com a sua extremidade farpado (ou mais final) que aponta para a membrana [2], o qual é empurrado por os filamentos, forçando a extensão da lamela. A extensão de lamelas, por conseguinte, é o que determina a direcção e movimento da célula [3]. Fechar regulação da migração das células é essencial para o desenvolvimento, a cicatrização de feridas e respostas imunes, ao passo que a motilidade celular aberrante e descontrolada é um recurso recorrente em vários tipos de células cancerosas.

Uma série de estudos indicam que profilina I (PfnI) , uma proteína essencial se liga à actina, pode desempenhar um papel regulador importante no processo da motilidade celular. Assim,

Dictyostelium amebas

mutantes para PfnI motilidade exposições e defeitos citocinese [4], como faz “chickadee”, o mutante nulo para o homólogo de PfnI em

Drosophila

[5]. Da mesma forma, o silenciamento PfnI em células endoteliais vasculares humanas induz a inibição de motilidade e defeitos na membrana saliência [6]. Além disso, PfnI nocaute foi mostrado para resultar em morte celular embrionário inicial em ratinhos [7].

Dos membros da família profilina (PfnI a PFN IV), PfnI é o mais amplamente expressos. Foi inicialmente identificada como uma proteína sequestrante G-actina [8], e desde então, tem sido atribuído várias outras funções, incluindo o tráfego nuclear-citoplasma de actina por ligação a exportina 6 [9], mRNA splicing [10], bem como endocitose vesicular, interagindo com clatrina e proteína contendo valosin [11]. Hoje em dia, é comummente aceite que o seu papel principal é promover a polimerização de actina, catalisando a troca de ADP para ATP na monômero G-actina [12]. Além disso, a estrutura de PfnI contém um domínio de ligação de poliprolina (PLP) [13], [14] e dois locais de ligação Phosphoinositide [15] – [17]. Em virtude do anterior, PfnI interage com uma profusão de proteínas ricas em prolina. Entre outros, ele se liga diretamente para Ena /VASP [18], N-WASP [19], WAVE [20] e da actina família nucleador de forminas [21]. Todas estas proteínas recrutar PfnI para as zonas de remodelação dinâmica da actina, tal como o bordo de ataque da lamelip�ios. A localização intracelular de PfnI confirma a sua associação com áreas de intensa polimerização de actina, e assim PfnI é encontrado em microfilamentos pTK2 de fibroblastos marsupiais [22], sanguessuga neuronais cones de crescimento [23], lamelas bovina trabecular malha [24], projetando-se áreas de rato fibroblastos [25], e perto da borda de avanço da células endoteliais [26].

uma característica fundamental da invasão de células de tumor e a metástase é um aumento da motilidade e migração capacidade das células. Interessantemente, os níveis de expressão são PfnI regulada para baixo em vários mama invasivo, pâncreas e tipos de células de cancro hepático [27] – [31]. Maior redução dos níveis de PfnI silenciando seus resultados de expressão em ainda maior motilidade [29], [32] e progressão do tumor [33]. O oposto também é verdade: um aumento nos níveis PfnI reduz a invasividade e motilidade celular, seguido por uma sobre-regulação do stress e as fibras de adesão focal [27], [29]. Além disso, a sobre-expressão PfnI suprime tanto tumorigenicidade ectópica e ortotópico e micro-metástases [32]. Para a actividade de supressão de tumores de ocorrer através deste mecanismo, ambos os sítios de ligação à actina e Phosphoinositide em PfnI deve ser funcional [30], [32], [34]. Além disso, PfnI superexpressão foi relatado para regular a expressão de PTEN, portanto, indiretamente, suprimindo a atividade Akt, controlando a produção fosfoinositídeo [35].

O fosfoinositídeo ligação de PfnI é mais importante do que o anteriormente esperado. A família de Ena /VASP de proteínas uncaps as extremidades dentadas livres de actina, permitindo o seu alongamento progressiva [36]. Lamellipodin (LPD) liga-se Ena /VASP através de um domínio EVH1 e, especificamente interagir com PI (3,4) P

2. Desta forma, a membrana alvo de Lpd é capaz de recrutar Ena /VASP à membrana. Uma série de descobertas recentes sugerem que PfnI restringe o conjunto disponível de PI (3,4) P

2. Desta forma, seria PfnI regular negativamente os níveis de fosfoinositida na membrana, e indirectamente limitar LPD-Ena /VASP direccionamento para a membrana [37]. Em células MDA-MB-231, esgotamento PfnI regula a acumulação de LPD, indiretamente, aumentando a concentração Ena /VASP na vanguarda e, consequentemente, promover a polimerização de actina e hipermotilidade relatado após a depleção PfnI [38]. Contudo, as consequências subjacentes a estas acções supressivas PfnI no volume de negócios actina continuam a ser elucidado. A evidência experimental indica que um domínio funcional de ligação a actina de PfnI é crucial para a redução da motilidade das células de cancro e fenótipo tumoral [29], [30]. Dada a grande quantidade de evidência experimental apoiando a importância da PfnI na regulação da polimerização de actina e migração celular, é intrigante o quão baixo níveis de PfnI expressão estão associadas com a motilidade celular melhorada, e como treadmilling actina pode ser regulada.

neste relatório, o volume de negócios de actina lamellipodial foi examinada usando Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) [39]. Os nossos resultados indicam que o citoesqueleto no bordo de ataque de células cancerosas é muito mais do que a dinâmica de células não tumorais. Além disso, o aumento dos níveis PfnI em células de câncer leva à redução treadmilling actina e motilidade celular prejudicada. Finalmente, também encontramos evidências sugerindo que treadmilling actina em células cancerosas é insensível a regulação extracelular por fatores de crescimento

Materiais e Métodos

As culturas de células

MDA-MB-231. linhas celulares de tumor da mama humano foram cultivadas em DMEM-Ham F12 e meio 10% de FBS (Sigma). A linha celular MCF10A humano mamária epitelial foi cultivada no seguinte meio de cultura: HEPES 15 mM, soro de cavalo a 5%, EGF 20 ng /mL, hidrocortisona 0,5 mg /ml, a toxina da cólera 100 ng /ml, insulina humana a 10 mg /ml, 50 mg /ml de penicilina e 50 U /ml de estreptomicina, em DMEM F12 HAM (todos fornecidos pela Sigma). A linha de pulmão humano A549 de células de tumor, fibroblastos de rato embrionários MEF e linha celular de tumor de colo humano HeLa foram cultivadas em DMEM, suplementado com 50 mg /ml de penicilina, 50 U /ml de estreptomicina e 10% de FBS (Sigma Aldrich). As células MDA-MB-231 foram adquiridos à ATCC (EUA; HTB-26 Ref.). células MCF10A, passagem 8, foram uma generosa oferta do LP Saucedo (CNIO, Madrid, Espanha). A549 e as células HeLa, a passagem 10, foram um generoso presente de forma H. ​​Aguilar (ICO, Barcelona, ​​Espanha). células MEF, passagem 6, foram generoso presente de A. Angulo (IDIBAPS, Barcelona).

Imunocitoqu�ica e imagem análise

Resumidamente, para as análises imunocitoquímicos, culturas de células foram lavadas em PBS e fixadas para 15 minutos em paraformaldeído a 4% /PBS. As lamelas foram então lavadas três vezes em PBS e incubadas durante 30 min em solução de bloqueio (soro de cabra a 2%, 2% de albumina de soro, 0,1% de Triton X-100 em PBS). Os anticorpos foram diluídos para a concentração apropriada em solução de bloqueio. As lamelas foram incubadas durante 60 minutos na solução de anticorpo. As amostras foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas durante 30 minutos com anticorpos secundários conjugados com fluorescência-competentes. Finalmente, lamelas foram lavadas cinco vezes e montadas com Mowiol. As imagens de fluorescência foram obtidas com um microscópio invertido (Olympus IX70), usando um monocromador ATÉ como fonte de luz. Fotos foram tiradas com uma câmera acoplada arrefecida CCD (Orca II-ER, Hamamatsu)

Os anticorpos seguintes foram utilizados:. Anti-vinculin anticorpo monoclonal (. Chemicon, ref MAB3574) e anti-Profilin policlonais e anticorpos monoclonais (Cell Signaling, ref. 3237 e do sistema Synaptic, ref. 308 011). anticorpos secundários, Oregon verde faloidina e faloidina-Alexa Fluor® 594 foram adquiridos da Invitrogen. Imagem J software de análise (National Institutes of Health) foi utilizado para quantificar divulgação e adesão focal.

medições de área celular e adesões focais quantificação

Resumidamente, até 10000 células foram semeadas em 12 lamelas mm em 24 poços de placas. Após o tratamento correspondente, as células foram fixadas em 4% de PFA e coradas com faloidina Oregon-verde ou faloidina-Alexa Fluor® 594. Apesar da falta de fibras de stress, faloidina coloração permitiu a medição da superfície de células inteiras. área celular foi quantificada por análise de limiar digital usando o software Image J..

A proteína recombinante

Em algumas experiências, os níveis intracelulares de profilina foram modificadas utilizando uma versão membrana permeável de PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-profilina (21 kDa) foi gerado através da fusão de um domínio de transdução, PTD4 [41], para profilina. A proteína recombinante foi expressa em

E. Coli

e purificada como descrito anteriormente [40]. Resumidamente, competente

E. Coli

BL21 plys-transformadas com o vector pRSETA-PTD4-PFN I foram estimuladas pela adição de IPTG 1 mM (Sigma) a 37 ° C durante 6 h. Os sedimentos bacterianos foram lisadas por congelação e descongelação protocolo em N líquido

2, seguido de sonicação em gelo na presença de DNase e um cocktail de inibidores de proteína (Sigma). Os lisados ​​celulares foram resolvidas por centrifugação, e a proteína solúvel foi isolado, empregando colunas empacotadas com resina de Ni-NTA (Qiagen). Proteína de lavagem e a eluição foi realizada com elevadas concentrações de imidazole. troca de tampão e a concentração da proteína recombinante foram realizados por centrifugação em Amicon Ultra-15 10000 MWCO filtros centrífugos (Millipore), repondo o meio de eluição com PBS. As proteínas foram congeladas em N líquido

2 e armazenadas a -80 ° C em 10-15% de glicerol-PBS. Bactérias e proteínas foram tratadas de acordo com as Diretrizes de Segurança para Laboratório pessoal que trabalha com Trans-Ativando Transdução (TAT) Protein Transdução domínios.

A transfecção

A transfecção foi realizada utilizando o kit Efectene Transfection Reagent da Qiagen , seguindo as instruções do fabricante. Foram utilizados vários vectores de expressão: CMV-GFP, CMV-GFP-actina e CMV-MembraneCherry gentilmente cedido pelo Dr. F Tebar (Universidade de Barcelona, ​​Espanha), e CMV-GFP-PfnI gentilmente cedido pelo Dr. Hitomi Mimuro (Universidade de Tóquio, Japão).

linhas celulares estáveis ​​

linhas celulares estáveis ​​foram gerados a partir da linha de células de cancro MDA-MB-231 transfectadas com os plasmídeos que expressam GFP-actina, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI e GFP sob o controlo de um promotor de CMV (todo o trabalho foi realizado com passagens de células de 6 a 8). As transfecções foram realizadas com Efectene Transfection Reagent (Qiagen), como descrito no protocolo. As células transfectadas foram seleccionadas com três semanas de incubação em gentamicina 1 mg /ml (Sigma). FACS foi utilizada para separar células de alta e baixa-expressando GFP-actina. A solução tampão de separação de células utilizado consistiu em 5 mM de EDTA, 25 mM de HEPES pH 7,0, 1% de FBS (inactivado pelo calor) e PBS sem Ca

2 + /Mg

2+. níveis relativos de expressão de proteínas recombinantes foram analisados ​​por Western blot.

motilidade celular ensaio

células MDA-MB-231 foram semeadas em placas de 6 poços (Nunc) a 40% de confluência e marcadas com DRAQ5, um corante de ADN fluorescente vermelha distante célula-permeável, durante 5 min (Cell Signaling Technology). As placas de cultura foram montados no estágio de uma Leica DMITCS SL microscópio confocal de varrimento laser espectral (Leica Microsystems Heidelberg, GmbH) ligado a um microscópio invertido Leica DMIRE2 equipado com um sistema de incubação com temperatura e CO

2 de controlo. Todas as experiências foram realizadas a 35 ° C e 5% de CO

2. Para visualização dos núcleos DRAQ5 manchados, as imagens foram obtidas usando uma lente de 40 × objetivo (NA 1,32) e animado com uma linha de laser 633 nm. O pinhole confocal foi fixado em 4,94 unidades Airy para minimizar a perda de fluorescência. As fotografias foram tiradas a cada 5 min durante 8 h. Imagem software de análise de J (NIH) foi usada para a quantificação da velocidade e direccionalidade. dados direcionalidade foi apresentado como a distância linear (End) dividido pelo comprimento total distância durante 8 h, como descrito por Pankov et al., 2005 [42].

recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP)

experimentos FRAP foram realizadas utilizando os seguintes scans protocol:10 individuais (pré-branqueamento) foram adquiridas em intervalos de 300 ms, seguido por 20 scans de branqueamento no poder do laser completa usando uma área quadrada de 24 mm

2. Durante o período pós-branqueamento, 30-60 scans foram adquiridas em intervalos de 300 ms, seguido de 100 imagens adquiridas em intervalos de 5 s, este período de tempo foi necessário para permitir a fluorescência para atingir o equilíbrio. A fim de resolver a rápida recuperação inicial, alguns experimentos foram realizados utilizando o Leica voar aquisição modo; clareamento foi realizado durante a varredura para a frente X mosca utilizando 100% da potência do laser, e durante a varredura para trás, a fluorescência foi lida com intensidade do laser ajustados para valores de imagem (185 ms Intervalo de imagens), enquanto as imagens pós-clareamento (30-60 s) foram adquiridos ao mesmo intervalo de tempo. Para evitar a fotodegradação significativa, a intensidade de excitação foi atenuada para ~ 5% da potência do laser, durante a aquisição de imagem. recuperação de fluorescência foi quantificada utilizando Processamento de Imagens Leica confocal Software. a fluorescência de fundo foi medida num campo aleatório fora da célula e subtraída de todas as medições. O sinal de fluorescência medido na região de interesse (ROI), corrigida para aquisição fotobranqueamento e flutuações de fluorescência toda a seguir um método de normalização dupla, determinada como se segue: Ire = A /I0 * T0 /tt, onde é a intensidade média de ROI no tempo t; I0 é a intensidade média da ROI durante o período de pré-branqueamento; T0 é a intensidade durante a pré-branqueamento da área não-branqueada (normalmente, uma célula vizinha ou a região nuclear); e TT é a intensidade em tempo t desta área. A introdução do factor de correcção (T0 /TT) é responsável por possíveis pequenas flutuações na intensidade total de fluorescência causadas pela própria lixívia, e produz uma estimativa mais precisa da fluorescência medida no ROI [43], [44].

a recuperação líquida de fluorescência (fração móvel; Mf) medido na região de interesse foi determinada como: Mf = Fend-Fpost /Fpre-Fpost, onde Fend é ROI intensidade no estado estacionário significa; Fpost representa intensidade ROI após fotodegradação; e Fpre é a média pré-branqueamento intensidade ROI. A constante de tempo de recuperação (τ) foi obtido pela montagem usando Prism Software (GraphPad) curva, assumindo um modelo one-exponencial (parte inferior, em seguida, aumentando ao topo).

valores intracelulares de recombinante Profilin

cálculo dos montantes intracelulares de PTD4-PfnI foi feito pela densitometria de Western blot. Resumidamente, células a crescer em 25 cm

2 frascos foram lavadas cinco vezes, tripsinizadas e lavadas exaustivamente por centrifugação para reduzir a concentração de proteína extracelular. Os lisados ​​celulares foram corridos num gel de SDS-poliacrilamida. quantidades diluídas de recombinante purificada PTD4-PfnI, foram carregados nas mesmas cavidades. Ambas as proteínas, endógena Profilin e PTD4-PfnI foram facilmente distinguidos pelos seus pesos moleculares e foram sondados com um anticorpo monoclonal contra Profilin I.

Estatísticas

Todos os dados são representados como média ± SEM e foram analisados ​​utilizando software Prism (versão 4.0 e 6.0, Graphpad). Os dados foram analisados ​​utilizando o teste t de Student quando apropriado. Os níveis de significância foram notadas como se segue:. * P 0,05, ** p 0,01, *** e p 0,001

Resultados

dinâmica de actina das células cancerosas são caracterizadas por um elevado celular fração e curto tempo de recuperação

a fim de estudar a dinâmica do citoesqueleto de actina na ponta de crescimento de células tumorais, nós escolhemos a linha de células do cancro da mama MDA-MB-231. Esta linha de células leva o

KRAS

G13D e

BRAF

mutações G464V [45] e é particularmente adequada para estudos pré-clínicos, como é altamente agressivo, tanto

in vitro Comprar e

in vivo

[46]. MDA-MB-231 células em exposição cultura de uma extensão lamela contínua e de alta mobilidade, apresentando numerosas babados ao longo da membrana, o que torna este tipo de célula um excelente candidato para estudar o volume de negócios de actina lamellipodial usando FRAP. A fim de facilitar as experiências de imagiologia, gerada anteriormente tínhamos uma linha celular transfectada estável MDA-MB-231 que expressam a construção de GFP-actina. O nível relativo de expressão de GFP-actina foi analisada por Western-blot e comparado com GFP expressa linha de células como um controlo, em média, a expressão da proteína de fluorescência resultaram em 5,2% do total profilina (dados não mostrados).

O bordo de ataque característico de células MDA-MB-231 é uma estrutura geral 2 uM enriquecido em GFP-actina e facilmente identificada por faloidina-Alexa 594 a coloração (Figura 1A). Uma área rectangular suficientemente grande para cobrir o bordo de ataque inteiro (4 mm de largura e 6 uM de comprimento) foi Foto-descoloração [39] (Figura 1B). Como mostrado na Figura 1C, as células MDA-MB-231 exibiram uma recuperação da fluorescência perto de um 70% a cada 15 s. A cinética de recuperação foi descrita por uma curva exponencial de dois componentes evidenciando um componente rápida inicial seguida de um segundo componente mais lento. O componente inicial tinha um tempo de recuperação de cerca de 500 ms, semelhante ao valor obtido quando a recuperação foi examinado em células transfectadas com tau GFP monoméricos (100-200 ms; Figura S1). Isto é muito provavelmente devido à rápida difusão dos monómeros GFP-actina. O componente rápido inicial foi apenas detectada quando um protocolo de aquisição rápida foi empregado, e, portanto, foi negligenciado na maioria das experiências. O segundo componente mais lento foi conduzido por a polimerização da actina [47], [48], o que foi confirmado por meio da adição de 90 nM de citocalasina D (um bloqueador reversível farpado-end) ao meio de cultura cinco minutos antes da experiência FRAP. Na presença de citocalasina D, a fluorescência de GFP-actina não conseguiu recuperar (Figura 1C), confirmando que a polimerização da actina impulsiona a recuperação de fluorescência. Em média, a fracção celular medido 30 segundos após o tempo de branqueamento máxima foi estimada como sendo de 71,5 ± 4%; este segundo componente foi montado por uma curva de um-exponencial com um valor de tau média de 4 ± 0,3 segundo (linha vermelha pontilhada na Figura 1C).

) A células MDA-MB-231 transfectadas com GFP-actina, duplamente coradas com faloidina-Alexa 594 (a). Actina de fluorescência acumula principalmente na área de borda a principal. A barra de escala de 5 um. Note-se que as células MDA-MB-231 tem uma evidente falta de fibras de stress de actina. secção detalhada da aresta da frente, que mostra a acumulação de GFP-actina (b) e os filamentos de actina (c): á direita. A barra de escala de 2 um. B) imagem Representante quadros a partir de experimentos FRAP sequenciais. Antes FRAP (pré-branqueamento), depois da exposição a laser de alta intensidade (branqueamento), durante a fase inicial de recuperação (5 s) e no fim da parte estável da curva (30 s). A área de bordo de ataque branqueada é indicado pela caixa branca (4 x 6 mm). C) Exemplo de um experimento FRAP; recupera fluorescência a um valor médio de 71,5 ± 4%, após um curso de tempo monoexponencial (FIT representado por uma linha ponteada vermelho). A incubação com citocalasina D (90 nM) inibe a recuperação de fluorescência (CytD). Gráfico D) Resumo das fracções celulares médios a partir de células MDA-MB-231. As células transfectadas estáveis ​​(S, n = 44), expressores elevados GFP-actina (alta, n = 10), baixa expressadores GFP-actina (baixo, n = 10) e transitoriamente células transfectadas (231t, n = 6). Os valores médios da fração móveis não mostraram diferenças estatísticas sob quaisquer condições experimentais quando comparado com a linha de células transfectadas estáveis ​​(teste t de Student).

Em seguida, perguntou se os valores da fração móveis observados eram dependentes os níveis de expressão da GFP-actina. Para este efeito, analisou-se os níveis de recuperação para três condições diferentes: células com elevados níveis de expressão baixos ou GFP-actina (populações classificadas por citometria de fluxo a partir da linha celular de GFP-actina gerado estável) e depois de uma transfecção transiente durante 48 horas. Os resultados, resumidos na Figura 1D, indicou que a fracção de média móvel era similar para todas as três condições, suportando a hipótese de que a taxa de recuperação de actina não foi dependente da concentração de GFP-actina intracelular.

Para explorar se este intervalo recuperação de actina é específica para as células MDA-MB-231 ou é uma característica comum da maioria dos cancros de origem epitelial, duas linhas de células de cancro adicionais foram estudados. Assim, a dinâmica de actina no bordo de ataque de células HeLa e A549, um colo e um adenocarcinoma de pulmão humano, respectivamente [49], [50], foram examinados após a transfecção transiente com GFP-actina (Figura 2A). Ambas as linhas celulares exibiram uma fracção celular grande após 30 segundos, com valores médios semelhantes aos do MDA-MB-231 (valores de 62 a 64%; Figura 2B) e os tempos de recuperação diferentes dentro de uma faixa semelhante, de 2 a 5 segundos (Figura 2C). Aliás, as células A549 exibiram a recuperação mais rápida, com um valor de tau perto de 2 segundos (Figura 2C).

A) Dois exemplos de recuperação de fluorescência individual de GFP-actina obtido a partir A549 e as células HeLa. B) Gráfico de barras da fracção de média móvel comparando MDA-MB-231, HeLa e as células A549. Os valores médios foram calculados de 62,4 ± 4,2% para as células HeLa (n = 12) e de 64,7 ± 4,3% para A549 (n = 10). Não foram encontradas diferenças estatísticas quando comparado com células MDA-MB-231. C) Os valores médios dos valores exponenciais tau obtidos a partir das curvas de recuperação de montagem. As células MDA-MB-231 recuperada com um valor de Tau 4,1 ± 0,6 s, enquanto que as células HeLa exibido um tau de 5,5 ± 1,7 s. As células A549 mostrou a recuperação mais rápida de tudo, com um tau de 1,9 ± 0,35 s, o que foi estatisticamente diferente do tempo de recuperação de MDA-MB-231 (p 0,005, teste t de Student).

Desde MDA-MB-231 de cancro da mama têm uma origem epitelial, também em comparação com a sua dinâmica de actina que a de uma linha celular não cancerosa do MCF10A, uma linha celular epitelial mamaria humana transfectadas com GFP-actina. Os resultados (resumidos na Figura 3) indicaram que o citoesqueleto de MCF10A tinha uma fracção celular actina menor do que a da linha celular de cancro contraparte (50% versus 70%: Figura 3A-B). O tempo de recuperação também foi diferente, com um valor médio próximo de 7 segundos. Resultados semelhantes foram obtidos quando as células de fibroblastos de origem não-relacionada foram examinadas. Murino embrionárias fibroblastos (MEFs) tiveram um valor fração móvel perto de 40%, com um tempo de recuperação de cerca de 8 segundos (Figura 3A-C). Em resumo, os dados experimentais indicam que as células cancerosas testados mostram um citoesqueleto muito mais dinâmico do que as células não-cancerosas.

A) Dois exemplos de curvas de recuperação actina individuais na vanguarda após a fotodegradação de GFP-actina de MCF10A células MEF (murinos) (humana) e. A recuperação das células MDA-MB-231 é representado como uma linha pontilhada vermelho para comparação. B) o resumo dos dados das fracções celulares de MEFs (39 ± 4,2%, n = 18) e MCF10A (51,7 ± 1%, n = 6) em comparação com células MDA-MB-231 células de tumor. Cada tipo de célula mostra diferenças estatísticas em comparação com a recuperação fracção celular MDA-MB-231 (p 0,005, teste t de Student). As fracções celulares de células MEF MCF10A e não foram estatisticamente diferentes (teste t de Student). C) Os tempos de recuperação de ambos os MEFs (tau = 7,5 ± 1,6 s) e células MCF10A (tau = 6,5 ± 0,4 s) foi estatisticamente diferente do que a de células MDA-MB-231 (p 0,005 e p 0,05; teste t de Student -test).

MDA-MB-231 a dinâmica de actina são independentes da presença de fatores de crescimento extracelulares

independência adquiridos de sinalização do fator de crescimento extracelular é uma característica típica de células de cancro da mama [51]. Em linhas de células não-cancerosas, motilidade celular e polarização são guiados por uma acumulação local de PIP

3; impulsionada principalmente pela activação de PI3K ou activação de integrina local. Na verdade, a sinalização PI3K aberrante é um tema recorrente, tanto no início e progressão de uma variedade de cancros, incluindo o cancro da mama [45]. A seguir, queria testar a dependência da dinâmica de actina no bordo de ataque na presença de factores de crescimento extracelular. Para este fim, foi estudada a dinâmica de actina de cancro e de linhas de células não cancerosas, após um período de jejum de soro de 16 horas. Os resultados indicam que a MDA-MB-231 fracção celular não foi afectada pela condição privação de soro (Figura 4A), com um valor médio móvel fracção de 58 ± 3%, e uma proteína tau significativo de recuperação de 6,6 segundos, o que não era estatisticamente diferente a partir dos valores obtidos na presença de soro (Figura 4B e D). Uma consequência imediata da ausência de factores de crescimento é a redução do PIP

3 sinalização ao nível da membrana. Para confirmar a influência de PIP

3 na modulação da actina, a dinâmica de actina na vanguarda foi analisada após 30 minutos, tendo as células tratadas com o inibidor de PI3K LY294002 (20 uM). A fracção celular mostraram um valor médio de 57 ± 2%, e a fluorescência recuperado com uma constante de tempo de 4,2 segundos, o que não era estatisticamente diferente do que sob condições de fome ou de controlo do soro (Figura 4B e D).

a) Exemplo de recuperação de fluorescência após FRAP sob condições de controlo (10% de FBS, FBS a parcela) e privação de soro durante 16 horas (esfomeados trama). Dados B) Resumo da fração móvel médio nas células MDA-MB-231. A fracção celular média sob condições de FBS foi de 62 ± 5,2% (n = 6), em comparação com 58 ± 3%, após 16 horas de jejum, e 57 ± 2% (n = 6) depois de inibição de PI3K com LY294002 (n = 6) . Deve notar-se que nós incluímos novas células de controlo, que crescem em paralelo e analisados ​​no mesmo dia e sob as mesmas condições; Por conseguinte, a fracção celular média tem um valor um pouco diferente, que a média total (70% versus 65%). C) A fracção celular de células não-cancerosas sob condições privadas de soro foi reduzido para 27 ± 5,2% (n = 10) em fibroblastos de rato e de 28 ± 2,4% no MCF10A (n = 6), (P 0,05; Student t-teste). D) gráfico de resumo de tempo de recuperação. MDA-MB-231 crescendo em FBS tendia a mostrar dinâmica mais rápida (4,14 ± 0,6 s) não estatisticamente significativas a partir de células que em jejum (6,6 ± 1,7 s). O uso de LY294002, um inibidor químico da PI3K, não afetou o tempo de recuperação (4,2 ± 1,0 s). E) Em contraste, privação de soro afectou o tempo de recuperação de células não cancerosas, o aumento da constante de tempo de 8,2 ± 0,2 s para 9,5 ± 0,1 s para MEFs (p 0,05) e 6,5 ± 0,4 s para 8,0 ± 1,2 s para MCF10A células (p 0,05; teste t de Student)

Em contraste, a fracção celular de células MCF10A foi reduzido sob condições de privação de soro (valor de 28 ± 2,4% em comparação com 51% em condições de controle significa. ; Figura 4C). dependência semelhante de soro extracelular foi observada em MEFs, cuja fração móvel diminuiu de um valor próximo de 40% para um valor em torno de 27% (Figura 4C). O tempo de recuperação também foi afetada, em células MCF10A aumentou de 6,5 ± 0,4 segundos para 8,0 ± 1,2 segundos, enquanto em células MEF aumentou de 8,2 ± 0,2 para 9,5 ± 0,1 segundos (Figura 4E)

.

A partir dos resultados obtidos nesta seção, concluímos que no MDA MB-231, tanto a fração móvel actina e o curso de tempo de recuperação não são afetados pela presença de fatores de crescimento extracelular e regulação de membrana de PIP

3 níveis.

PfnI sobre-regulação aumenta o tamanho das células e o número de CC

várias proteínas de ligação a actina são desregulados em linhas celulares de cancro [28], [52], entre eles profilina (PfnI), a qual foi proposta como um proteína supressora de tumor [27], [30]. Os níveis de expressão PfnI são significativamente regulada negativamente em vários tipos de células de adenocarcinoma.