Abstract

Fundo

Quase 20% dos cancros humanos em todo o mundo têm uma etiologia infecciosa com os exemplos mais proeminentes sendo hepatite B e C carcinoma hepatocelular e associada ao vírus do papiloma humano cervical associada ao vírus Câncer. Há uma necessidade urgente de encontrar novas abordagens para o tratamento e prevenção de cancros associados a vírus.

Metodologia /Principais Achados

antígenos virais não foram previamente consideradas como alvos para o tratamento ou prevenção de vírus cancros -associated. Colocámos a hipótese de que era possível no tratamento do cancro experimental associada-HPV16 cervical (CC) e carcinoma hepatocelular Hepatite B-associado (HCC), visando antigénios virais expressos em células de cancro com anticorpos radiomarcados para antigénios virais. O tratamento de CC experimental e tumores HCC com

mAbs 188Re-rotulados para E6 e HBX proteínas virais, respectivamente, resultou em atraso significativo e dependente da dose do crescimento do tumor em comparação com os ratos não tratados ou ratos tratados com os anticorpos não marcados.

Conclusões /Significado

Esta estratégia é fundamentalmente diferente dos usos anteriores de radioimunoterapia em oncologia, que alvo antígenos humanos associados a tumores e promessas maior especificidade e toxicidade mínima do tratamento. Ele também levanta uma possibilidade empolgante para evitar cancros associados a vírus em pacientes cronicamente infectados, eliminando células infectadas com vírus oncogénicos antes que eles se transformar em câncer

Citation:. Wang XG, Revskaya E, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Tratamento do câncer como uma doença infecciosa doença viral Antígenos Metas como novos para o tratamento e prevenção Potencial de Tumores de Viral Etiologia. PLoS ONE 2 (10): E1114. doi: 10.1371 /journal.pone.0001114

Editor do Academic: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de outubro de 2007; Aceito: 10 de outubro de 2007; Publicação: 31 de outubro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. E. Dadachova é suportado pelo AI60507 concessão NIH; A. Casadevall – pelos NIH bolsas AI33774, AI33142, AI52733, HL59842 e U54 AI157158; R. D. Burk pela CA078527 concessão NIH. Este trabalho foi financiado em parte pelo Albert Einstein College of Medicine Comprehensive Cancer Center e do Centro de Pesquisa em Aids da Albert Einstein College of Medicine e Montefiore Medical Center financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH AI-51519).

Conflito de interesses: o pedido de patente para esta tecnologia foi apresentado com US PTO

Introdução

Estima-se que quase 20% dos cancros humanos em todo o mundo têm uma etiologia infecciosa [1]. A maioria destes tumores são de origem viral, e incluem associações firmemente estabelecidos de vírus da hepatite B (HBV) e vírus da hepatite C (VHC) com carcinoma hepatocelular; e do vírus do papiloma humano (HPV) -com cancros do colo do útero, ânus, vulva, vagina; bem como as associações de vírus de Epstein-Barr orofaringe (EBV) com linfoma e carcinoma da nasofaringe; humano t linfotrópico do vírus do tipo 1 (HTLV-1) -com adulto leucemia de células T /linfoma, e vírus do herpes humano 8 (HHV-8) -com o sarcoma de Kaposi [2] – [7]. Em conjunto, estes tumores associados a vírus representam uma carga de aproximadamente 1,3 milhões de casos de câncer a cada ano, com câncer HBV /HCV associada ao fígado respondendo por 523.000 casos e tumores associados ao HPV responsáveis ​​por 561.000 casos [8]. A necessidade de encontrar novas abordagens para o tratamento e prevenção de cancros associados a vírus é óbvia e urgente.

radioimunoterapia (RIT) utiliza a ligação a entregar doses de radiação citotóxicas para as células tumorais em partículas [9] antigénio-anticorpo, [10]. RIT, por exemplo, tem sido usado com sucesso para tratar linfomas refractários e recorrentes, com dois anticorpos monoclonais marcados radioactivamente (mAb) contra CD20 segmentados (ZEVALIN® e Bexxar®) que tenham recebido aprovação da FDA para este efeito. É provável que, de facto, que se tornará RIT uma primeira linha de tratamento para o linfoma folicular [11]. Este “tradicionais” RIT câncer de alvos “auto” antígenos. Recentemente, foi demonstrado que também tem RIT amplo potencial para o tratamento de infecções fúngicas e bacterianas através de direccionamento de antigénios microbianos com mAbs radiomarcados em modelos experimentais de infecções fúngicas e bacterianas [12], [revisto em 13]. Além disso, verificou-se que o HIV-1 de células infectadas pode ser eliminado in vitro e in vivo através da segmentação gp120 e gp41 glicoproteínas virais expressos na superfície de células infectadas com mAbs específicos para a proteína virais radiomarcados [14].

Colocámos a hipótese de que RIT dirigidas contra antigénios virais pode ser usado no tratamento de uma ampla gama de doenças infecciosas virais e tumores associados a vírus [15], [16]. Muitos cancros associados a vírus expressar antígenos virais internamente ou em suas superfícies. É importante notar que mesmo os antigénios virais expressos intracelularmente são alvos potenciais para RIT, uma vez que o retorno da célula de tumor é susceptível de resultar na libertação destas proteínas para o espaço intersticial do tumor. Esta abordagem é fundamentalmente diferente dos usos anteriormente descritos de RIT que têm como alvo antigénios associados a tumores, que são “independentes” (isto é, humano) proteínas. Ao direccionar proteínas virais “auto” e não, espera-se que os mAbs radiomarcados pode ser mais especificamente concentrada no interior do tecido do tumor, resultando em uma maior eficácia e menor toxicidade. Aqui, descrevemos os experimentos de prova de princípio destinados a demonstrar a possibilidade de tratar o cancro experimental associada-HPV16 cervical (CC) e carcinoma hepatocelular Hepatite B-associado (HCC), visando antigénios virais expressos em células de cancro com anticorpos radiomarcados para antigénios virais .

resultados

Seleção de uma combinação line-antigénio da célula para agir como um câncer experimental cervical (CC) modelo

para avaliar o potencial da RIT para direcionar antígenos virais em cânceres de etiologia viral, que precisávamos para identificar linhas celulares de tumores que expressam o antigénio alvo e também poderiam ser implantadas em ratinhos nus. Foram selecionados HPV16 e HPV18 celulares linhas, uma vez que estes dois tipos de HPV são responsáveis ​​por aproximadamente 70% dos cancros do colo do útero e uma fração significativa de tumores de cabeça e pescoço [17], [18]. As oncoproteínas E6 e E7 foram considerados os melhores alvos antigénicos potenciais, uma vez que estas proteínas são expressas em essencialmente todas as células de cancro cervical, enquanto que outros genes virais podem ser perdidos. A análise mutacional demonstrou que os E6 e E7 oncoproteínas virais são necessárias e suficientes para a imortalização de células humanas por HPV. Portanto, avaliou-se por Western blot da expressão de E6 e E7 em três linhas de células de células de carcinoma cervical humano, linhas de HPV16 CaSki e SiHa positiva e uma linha de células HeLa S3 de HPV18-positiva. Enquanto as células CaSki expressa ambos os antigénios E6 e E7 (Fig. 1a, b), linhas de células SiHa e HeLa S3 não tinham expressão de antigénio mensurável E6 (resultados não mostrados), mas fez proteína E7 expresso (Fig 1D, E.); se bem que, o nível de expressão de E7 foi baixa em células SiHa

a) E6 a partir de extractos de proteína de células CaSki tratados com MG132 durante 3 horas (Fig 1D.).; b) E7 a partir de extratos de proteína das células CaSki tratados com MG132 durante 3 horas; c) E6 a partir de extratos de proteína das células CaSki tratados com MG132 durante 6 horas; d) E7 a partir de extratos de proteína das células SiHa tratados com MG132 durante 3 horas; e) a partir de extractos de proteína E7 de células HeLa S3 tratados com MG132 durante 3 horas; f) HBX a partir de extractos de proteína de células Hep 3B2.1-7 tratados com MG132 durante 3 horas.

O inibidor de proteassoma MG132 reduz a degradação de proteínas de ubiquitina conjugada em células de mamífero sem afectar ATPase ou isopeptidase actividades. MG132 foi relatada como resultando num aumento dos níveis de proteínas E6 e E7 em células do cancro do colo do útero [19], [20]. Como quantidades mais elevadas de antigénios alvo pode melhorar potencialmente a resultados RIT, foi investigada a influência de pré-tratamento de células de CC com inibidor de proteassoma MG132 sobre os níveis de expressão de E6 e E7. FIG. 1a e b mostra que em células CaSki pré-tratamento com MG132 causou um aumento na expressão de ambas E6 e E7, com o maior nível de expressão obtido com a utilização de 2 e 5 ug /mL de MG132 que diminuiu quando se utilizaram as doses mais elevadas. O prolongamento do período de incubação de células CaSki com MG132 não resultou em maior expressão de E6. Na verdade, nós observamos diminuição na expressão de E6 com a exposição de células CaSki prolongada a MG132 (Fig. 1c), o que pode refletir um aumento da degradação de proteínas após mais de 3 horas de incubação. Foram realizadas experiências semelhantes para a proteína E7 em SiHa e linhas de células HeLa S3 (Fig. 1D, E). células SiHa não demonstrou um aumento significativo nos níveis E7 (Fig 2d.); Considerando que, os níveis E7 fez aumentar ligeiramente para células HeLa S3 tratados com 1 e 2 ng /mL MG132 (Fig. 1e). Dada a expressão de confiança e alta de E6 em células CaSki, bem como sua capacidade de produzir tumores em camundongos nus-selecionamos células CaSki e proteínas E6 para mais in vitro e in vivo.

a, b) imunofluorescência de células de tumor fixadas e permeabilizadas. painéis da esquerda mostram imagens de microscopia de luz das células. células fortemente danificadas são marcadas com setas. painéis da direita mostram imagens de imunof luorescência das mesmas lâminas tratadas com mAbs específicos para a proteína virais, seguido por anticorpo policlonal de FTIC-conjugado de IgG de ratinho: as células A-CaSki e C1P5 mAb, b-Hep 3B2.1-7 células específicas-E6 e HBx- mAb 4H9 específico; c) imuno-histoquímica de tumores CaSki. painel esquerdo mostra a ligação de C1P5 mAb E6 específicas do. O painel direito mostra a ausência de ligação do mAb 18B7 controlo; d) transferência de Western de tumor Hep 3B2.1-7 com HBx específico mAb 4H9.

A selecção de um linha de combinação de antigénio de célula para actuar como um carcinoma hepatocelular Hepatite B-associado experimental (HCC) modelo

Foram avaliadas duas proteínas virais de hepatite B-associados como potenciais alvos para RIT-HBx e PreS2. HBx é suspeito de ter um papel na carcinogênese hepática e, ao contrário de outras opções possíveis, HBx não tem homologia para hospedar proteínas. Além disso, o gene que codifica para HBx é mantida mesmo quando o genoma de HBV torna-se integrado no carcinoma hepatocelular, ao passo que outros genes de HBV pode ser perdido [21], [22]. PreS2 também é suspeito de ter um papel na hepatocarcinogenese (isto é, através de transactivação de genes celulares importantes no controlo do crescimento) [22]. HBx foi consistentemente detectados por Western blot da linha celular de carcinoma hepatocelular Hep 3B2.1-7 usando mAb 4H9, e a sua expressão foi independente do pré-tratamento com inibidor de proteassoma MG132 (Fig. 1F), ao passo que pré-S2 não foi detectada (resultados não apresentados ). Por isso, selecionamos a combinação linha celular Hep 3B2.1-7 e proteína HBx para outras experiências.

A ligação de anticorpos contra antígenos virais em células não viáveis ​​

Para descobrir se anticorpos para proteínas virais que foram identificados como alvos para RIT será capaz de se ligar a proteínas virais nas células tumorais não-viáveis, foi realizada imunof luorescência de células fixadas e permeabilizadas CaSki e Hep 3B2.1-7 com mAbs C1P5 para E6 e 4H9 de proteínas HBX , respectivamente, seguido por anticorpo policlonal conjugado com FITC de IgG de rato. Enquanto a ligação de C1P5 mAb para as células que eram quase intacta era fraco, as células fortemente danificadas com membranas penetráveis ​​mostrou fluorescência brilhante apontando para ligação de C1P5 para E6 (Fig. 2a). A fixação e a permeabilização também tornada possível para o mAb 4H9 para se ligar à proteína HBx (Fig. 2b). Sem ligação de controlo IgG1 mAb para fixo e permeabilizadas CaSki ou Hep 3B2. 1-7 células foi observado (resultados não apresentados).

A expressão de proteínas virais nos tumores

Para confirmar que CaSki e Hep 3B2.1-7 células continuaram a expressar E6 e HBx viral antigénios, respectivamente, em que os tumores induzidos em ratinhos nus, foi realizada imuno-histoquímica e por imunotransferência E6 e HBx, respectivamente. Western blot foi escolhido para tumores induzidos 3B2.1-7 Hep com base nas dificuldades de comunicação literatura em detectar com fiabilidade HBx em órgãos por imuno-histoquímica [23]. Houve uma intensa coloração da E6 com C1P5 específico mAb em tumores CaSki (Fig. 2c, painel esquerdo) sem coloração observada com controle IgG1 mAb (Fig. 2c, painel da direita). Western blot de tumores induzidos por 3B2.1-7 Hep revelou a presença de HBx (Fig. 2d). Assim, a presença de proteínas virais alvo no cc e tumores experimentais HCC fornecida a possibilidade de orientar estes antigénios in vivo com mAbs radiomarcados para imagiologia cintigráfica e terapia.

Biodistribuição de mAbs radiomarcados para proteínas virais em CaSki e Hep 3B2.1-7 portadores de tumor ratos pelados

Realizamos experimentos com imagens e biodistribuição com

188Re-radiomarcado C1P5 e 4H9 mAbs em CaSki e Hep 3B2.1-7 portadores de tumor ratos nus, respectivamente, para determinar a localização de mAbs para tumores. Às 24 h pós-injecção do tumor CaSki foi visível na imagem cintigráfica de um rato injectado com

188Re-C1P5 mAb (Fig. 3a), em oposição à imagem de um rato injectado com irrelevante

188Re-18B7 mAb (Fig. 3b). Também calculamos o tumor a relação músculo a partir dos resultados 48 horas de biodistribuição que foi 10:01 para

188Re-C1P5 contra 3:01 para

188Re-18B7. A absorção total de

188Re-C1P5 mAb nos tumores em 48 h após a injecção foi de 2,0 (± 0,3)% da dose injectada por grama de tumor. Outros órgãos, como fígado, baço e sangue mostraram os níveis de característica absorção de IgG1 mAbs. Para Hep 3B2.1-7 utilizamos outra abordagem para provar a especificidade da captação mAb no tumor por meio de um modelo, quando um rato carrega dois tumores-One diferentes do tumor de interesse e outro irrelevantes tumorais controle. ratinhos nus realizada tumor de melanoma metastático humano A2058 no flanco direito e Hep 3B2.1-7 do lado esquerdo (Fig. 3c). Os camundongos foram injetados com

188Re-4H9 mAb e fotografada scintigraphically às 24 horas após a injecção. O anticorpo localizada ao tumor Hep 3B2.1-7 em oposição ao controlo irrelevante do tumor de melanoma (Fig. 3d). A capacidade dos mAbs radiomarcados aos antígenos virais para localizar a estes tumores em camundongos justifica uma avaliação da RIT nestes modelos de câncer in vivo.

RIT de CaSki e Hep 3B2.1-7 portadores de tumor nu camundongos

Para avaliar o efeito terapêutico de

188Re-C1P5 mAb em CaSki camundongos portadores de tumor, os animais foram injectados com 350 uCi

188Re-C1P5 mAb, ou montantes correspondentes (30 ug por mouse) de não marcado ( “frio”) C1P5 mAb ou não tratada. FIG. 4a mostra a mudança no volume do tumor nos grupos tratados e de controlo. RIT com 350 uCi

188Re-C1P5 mAb detido completamente o crescimento tumoral e resultou na redução de volume (Fig. 4a e b), enquanto que os tumores não tratados cresceram de forma agressiva (Fig. 4a e c) e ratinhos de controlo não tratados tiveram que ser sacrificados dia 20 pós-tratamento (P 0,01). Curiosamente, a administração de “frio” C1P5 mAb também resultou em atraso significativo do crescimento do tumor, o que pode ser devido à indução de inflamação e complementar as cascatas pelo mAb

a) as alterações no volume do tumor.; b) de rato tratado com 350 uCi

188Re C1P5-mAb; c) rato de controlo (ambos os ratos mostrados no dia 20 pós-tratamento).

Para RIT de Hep 3B2.1-7 tumores em ratinhos nus que inicialmente utilizou o mesmo modelo experimental que para tumores CaSki por utilizando 350 uCi

188Re-4H9 mAb, “frios” controles tratados com mAb e grupos não tratados. A administração de 350 uCi

188Re 4H9-mAb resultou no crescimento do tumor mais lento, mas não prendeu-o como no caso de tumores CaSki. “Cold” 4H9 mAb não têm um efeito sobre o crescimento do tumor. Para encontrar a dose mais eficiente de radiomarcado mAb para retardar o crescimento de muito agressivo Hep 3B2.1-7 um experimento de resposta à dose foi feito. O efeito terapêutico de

188Re 4H9-mAb começou a manifestar-se, na dose de 280 jiCi e o efeito aumentado com cada aumento subsequente na dose (Fig 5a.) (P 0,02). Na conclusão da experiência, os tumores dos murganhos de controlo não tratados e ratinhos do grupo mais elevado 600 uCi foram analisados ​​histologicamente. O tumor controle consistiu de células hepatóides moderadamente diferenciados com pequenos focos dispersos de necrose, trombose de fibrina, e hemorragia. As células neoplásicas teve amplo eosinofílica para o citoplasma e médias núcleos finamente vacuolizadas a núcleos muito grandes e anaplásico contendo grande nucléolo eosinofílica múltipla com células multinucleadas ocasionalmente evidentes. O índice mitótico foi elevada e não se espalharam células apoptóticas (Fig. 5b). Em contraste, os tumores tratados com RIT tinham significativamente mais necrose e hemorragia do que o observado nos controlos. A aparência morfológica das células tumorais muitas vezes tinha uma degeneração citoplasma sugerindo mais vacuolizado (Fig 5c.)

a) mudanças no volume do tumor.; b) controlar o mouse não tratada; c) rato tratados com 600 uCi

188Re-4H9 mAb. Ambos os ratos mostrados no dia 18 pós-tratamento. Em B e C painéis inferiores mostram H E tumores manchado após a conclusão do experimento

Discussão

Foi realizada uma prova de princípio in vitro e in vivo para estabelecer. a viabilidade da segmentação antigénios virais nos tumores de etiologia viral com anticorpos radiomarcados para terapia. Para este fim, estudamos carcinoma experimental cervical (CC) e os modelos de carcinoma hepatocelular (HCC), uma vez que estes cancros são etiologicamente relacionado com HPV e HBV /HCV, respectivamente, e têm importantes implicações para a saúde pública mundial.

o primeiro desafio foi a escolha de antígenos virais alvo em CC e HCC. Em CC associada ao HPV foram identificados oncoproteínas E6 e E7 como potenciais alvos para RIT, porque eles são pensados ​​para ser expresso em todas as células cancerosas do colo do útero; Considerando que, outros genes virais podem ser perdidas durante o processo multi-etapa da tumorigénese. Da mesma forma, em CHC, HBx expressão é pensado para ser mantido. Não é, no entanto, uma preocupação importante na segmentação destes três proteínas com mAbs radiomarcados-sua localização subcelular. Ambos E6 e E7 estão localizados no interior do núcleo, e HBx é encontrada no núcleo e, ocasionalmente, no citoplasma. Como consequência, os mAbs radiomarcados para estas proteínas podem ligar-se apenas aos seus respectivos antigénios quando eles são libertados a partir das células mortas ou quando as células tumorais são permeabilizadas. Para realizar estas experiências, nós escolhemos a linha de células CaSki como um modelo CC, desde que encontramos expressa E6 e E7 em níveis elevados in vitro e os tumores cresceram agressivamente em ratinhos nus após o período latente. A linha celular Hep 3B2.1-7 foi escolhido como um modelo de HCC, depois observou-se que expressa HBx em níveis elevados e apresentado o crescimento do tumor em ratinhos rápido.

A imunofluorescência das células tumorais e imuno-histoquímica e Western blot dos tumores revelou amplas quantidades de E6 e HBX alvos antigénicos em CasKi- e tumores induzidos 3B2.1-7 hep, respectivamente (Fig. 2). A presença de antigénio acessível para os mAbs radiomarcados é provavelmente um resultado da libertação de proteínas a partir de células de tumor submetidas a rotação rápida. Consequentemente, os anticorpos radiomarcados acumulada no tecido do tumor de tal modo que eles podem ser visualizados scintigraphically (Fig. 3). Uma das vantagens da segmentação antigénios virais nos tumores que eles só são encontrados em células malignas. Em contraste, Chen e seus colegas observaram diferenças na captação tumoral para ambos os anticorpos radiomarcados específicas e não-específicas em seus experimentos de biodistribuição quando alvejado histonas intranucleares [24].

A capacidade de mAbs radiomarcados contra proteínas virais para entregar radionuclídeo citotóxico 188-rénio para as células tumorais facilitados os resultados bem sucedidos de RIT com estes mAbs em ratinhos portadores de tumor. A administração de 350 uCi dose de E6 de ligação

188Re C1P5-mAb a ratinhos portadores de tumor CaSki parou completamente o crescimento do tumor e ainda resultou na sua regressão (Fig. 4). É também provável que houve algum benefício terapêutico adicionado a partir do próprio anticorpo, tal como anticorpos não marcados podem mediar reacções inflamatórias e activam complemento. No futuro, será interessante investigar se o aumento dos níveis celulares de E6 e E7 oncoproteínas poderia ser obtido com a utilização de pré-tratamento de MG132 in vivo, e se esta resulta num benefício terapêutico. As experiências de resposta à dose em ratinhos com hepatite 3B2.1-7 HCC-tumores demonstraram claramente uma dependência da dose para o efeito terapêutico (Fig. 5). O facto de as doses mais elevadas de mAb marcado radioactivamente foram necessários para produzir um efeito terapêutico no carcinoma hepatocelular do que no tumor do colo do útero pode reflectir a agressividade de Hep 3B2.1-7 eo radiorresistência conhecido de tumores do fígado em comparação com os carcinomas cervicais relativamente radiossensíveis [25] . É também digno de nota que os ganhos terapêuticos em ambos os tumores experimentais foram obtidos com doses de radioactividade que estão bem abaixo da dose máxima tolerada de cerca de 800 uCi de

IgG1s marcado com 188Re em ratos [26], e como tal, as doses utilizadas eram não deverá produzir qualquer curto ou a longo prazo toxicidades.

é importante ressaltar que, quando o tratamento de cancros virais associadas, visando antígeno viral não todas as células do tumor precisa expressar antígenos virais para um efeito terapêutico . emissores de longo alcance, tais como

188Re (gama de emissão de tecidos de 10 mm) emitem radiação numa esfera de 360 ​​° e, por conseguinte, pode matar as células na vizinhança do local de antigénio. Além disso, uma elevada concentração do antigénio virai alvo provavelmente não é necessário para o fornecimento de uma dose terapêutica para o tumor, de acordo com a nossa recente modelo de RIT para o melanoma (dirigido contra a melanina, que também é um antigénio intracelular). Este modelo mostrou que a dose de radiação ao tumor é largamente independente de melanina (antígeno) concentração [27].

Esta abordagem também mantém a promessa de prevenir cancros virais associadas em indivíduos, por exemplo cronicamente infectada, persistência da infecção por HPV em indivíduos infectados pelo HIV coloca-los em risco significativo de desenvolver cancros associados ao HPV. Embora haja imunoterapia para HBV e HCV, muitos pacientes não conseguir depuração viral eo tratamento é associado com morbidade substancial. Também não há vacina para o HCV, e muitos milhões de pessoas no mundo estão infectadas com o HBV, apesar da disponibilidade de uma vacina eficaz. Células persistentemente infectado com o HPV, HBV, HCV ou outros vírus poderia, potencialmente, ser eliminado com RIT alvo para antigénios virais antes de se transformar em fenótipo maligno.

Em conclusão, nós efectuados in vitro e em experiências in vivo para avaliar a novel estratégia para tratar tumores de vírus associado usando mAbs radiomarcados direcionados contra proteínas virais. Esta estratégia é fundamentalmente diferente de utilizações anteriores do RIT em oncologia que têm como alvo antigénios associados a tumores humanos, resultando, assim, em absorção significativa do anticorpo radioactivo em tecidos normais, levando a toxicidade. Os resultados do presente estudo sugerem que pelo direccionamento auto-proteínas virais em vez e não pode ser possível para os mAbs radiomarcados para se concentrar mais especificamente no interior do tecido do tumor, resultando em uma maior eficácia e menor toxicidade. Esta estratégia também levanta uma possibilidade adicional emocionante para evitar cancros associados a vírus em pacientes cronicamente infectados, eliminando células infectadas com vírus oncogénicos antes que eles se transformar em câncer.

Métodos

Os anticorpos

mouse mAbs de Abcam C1P5 para HPV16 E6 + HPV18 E6 e TVG 701Y para HPV16 E7 foram utilizados em experimentos CC. Mouse mAb 4H9 ao HBV HBx (Aviva, Cat # AVAMM2005) e mAb de murganho para a proteína S26 de HBV Hbs (Gene Tex Inc. Cat # GTX18797), que reage de forma cruzada com o antigénio HBsAg preS2 foram utilizados em experiências de HCC. Murino 18B7 mAb (IgG1) a

C. neoformans

[28] foi utilizado como um controlo irrelevante para todos os anticorpos específicos. anticorpo policlonal de coelho conjugado com fosfatase alcalina para IgG de ratinho com H L foi comprado de Abcam e usado como o anticorpo secundário em Western blot

linhas de células e cultura de células

Três linhas de células de carcinoma cervical humano:. HeLa S3, SiHa e CaSki foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). As células foram cultivadas rotineiramente em DMEM /Ham F-12K (Sigma, 01:01) contendo 10% de FBS (Sigma) e solução de penicilina-estreptomicina a 1% (Sigma, penicilina e estreptomicina 10000 U de 10 mg /ml) a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. A linha de células Hep 3B2.1-7 (

Homo sapiens

hepatatocellular carcinoma) foi adquirida da ATCC. Ele contém um genoma do vírus da hepatite B integrado e foi derivado a partir do tecido de carcinoma hepatocelular, de 8 anos de idade menino preto. As células foram cultivadas rotineiramente em Mínimo de Eagle Essential Médium (EMEM) (ATCC), contendo 10% de FBS (Sigma) a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. camadas de células em 75 ml balão foi disperso pela adição de 2 ml de 1 × solução de tripsina-EDTA (Sigma, 0,25% (w /v) de tripsina-EDTA 0,53 mM) à temperatura ambiente durante 15 minutos. linha de células A2058 derivada de uma metástase em linfonodo de paciente com melanoma maligno foi obtida a partir de ATCC. As células foram mantidas como monocamadas em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com 4 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucose /L, 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, suplementado com soro bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 5%, a 37 ° C e 5% de CO

2, e colhidas utilizando 0,25% (w /v) de solução de tripsina-EDTA. A manutenção de rotina de todas as linhas de células foi realizada de acordo com os protocolos de ATCC.

Western blots

Os sedimentos celulares foram suspensos em tampão de lise (SDS a 4%, glicerol a 20%, 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,002% de azul de bromofenol e 10% β-mercaptoetanol). As amostras de proteína foram fervidas em água durante 15 min antes de executar SDS-PAGE. Vinte e cinco e trinta ul solução de proteína foi carregada em cada poço do gel de SDS-PAGE pré-moldado 12% (Bio-Rad). SDS-PAGE foi utilizado para monitorizar as quantidades relativas de proteína nas amostras. Doze por cento de gel de SDS-PAGE foi utilizado para as proteínas separadas, e a electroforese foi realizada utilizando mini-3 Protean® sistema celular (Bio-Rad). Após a electroforese, o gel foi transferido para o tampão de transferência de PVDF (metanol Tris 25 mM, glicina 190 mM e 2,5% (v /v)) durante 5 min. Em seguida, as proteínas foram transferidas do gel para a membrana Immun-Blot ™ de PVDF (Bio-Rad) no semi-seco celular transferência electroforética (Bio-Rad) a 15 V durante 17 min. A membrana foi embebida no tampão de bloqueio (Tris-HCl 25 mM (pH 7,6), EDTA 1 mM e NaCl 150 mM) durante 5 min, e, em seguida, transferido para a solução de bloqueio (leite seco a 5% não gordo no tampão de bloqueio) , agitando suavemente durante uma hora. A membrana foi incubada numa solução de TBST (0,1% de Tween-20, Tris-HCl 25 mM (pH 7,6) e NaCl 500 mM) contendo 1:3000 diluída anticorpo primário, à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBST (10 minutos por lavagem). A membrana foi hibridada pelo anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (policlonal de coelho para IgG de ratinho com H L (fosfatase alcalina)) em TBST com uma diluição 1:100,000. Após três lavagens com TBST, a membrana foi incubada em CDP-Star ™ solução de substrato quimioluminescente (Sigma) durante 5 min, e em seguida exposto a um filme CL-Xposure ™ (Pierce). O filme foi desenvolvido de acordo com as instruções do fabricante.

tratamento MG132 de células

MG132 (Z-LLL-CHO, PM = 457,6) comprado de CALBIOCHEM é um potente, proteassoma reversível e de células-permeável inibidor (Ki = 4 nM). MG132 foi primeiro dissolvido em uma gota de etanol a 100% seguido de meio DMEM /Ham F-12K, sem adição de FBS, e a solução estoque foi armazenado a 4 ° C. A cultura de células foi recolhido e transferido para 6 tubos de ensaio estéreis. Cada tubo continha 0,5-1 ml de cultura de células (concentração de células foi de ~ 10

6 células /ml), e as células foram deixadas a crescer a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora durante a noite. Em seguida, a solução de MG132 foi adicionado aos tubos para as concentrações finais de 0, 1, 2, 5, 10 ou 25 ug /ml (0, 2,1, 4,2, 10,5, 21 ou 52 uM, respectivamente). As células foram incubadas sob as mesmas condições durante mais 3 ou 6 horas. Finalmente, as células foram colhidas por centrifugação e clarificado por meio de lavagem com PBS.

radioisótopos e a marcação radioactiva dos anticorpos

O beta-emissor

188Re com uma meia vida de 16,9 horas foi eluida nas a forma de perrenato de sódio na

188ReO

4 a partir de um

188W /

gerador de 188Re (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN). Os anticorpos foram marcados com

188Re directamente através da ligação de reduzida

188Re ao grupo-SH gerado em anticorpos, tal como anteriormente descrito [11].

detecção de imunofluorescência de antigénios virais em células tumorais

as células tumorais foram cultivadas em câmaras de lâminas a 37 ° C durante 12 horas. O meio foi removido e as células foram lavadas com PBS três vezes. Durante todo o processo, as células foram lavadas 3 vezes com PBS, depois de cada tratamento. Eles foram fixadas com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de permeabilização com 0,3% de Triton-X100 em PBS à temperatura ambiente durante 10 min. As células fixadas e permeabilizadas foram bloqueadas com BSA a 5% mais 0,1% de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 30 min. mAbs específicos virais antigénios foram diluídos-1:200 com o BSA acima e Triton X-100 a solução e incubou-se com as células à temperatura ambiente durante 60 min. FTIC-conjugado de anticorpo policlonal de coelho contra IgG de ratinho em 1:300 diluição foi adicionado às células durante 60 minutos de incubação à temperatura ambiente no escuro. As lâminas foram vistos com um microscópio Olympus AX70 (Melville, NY) equipado com um filtro FITC.

modelos de tumor

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto de animal estudos do Albert Einstein College of Medicine. linhas celulares de carcinoma cervical humano CaSki e carcinoma hepatocelular humano Hep 3B2.1-7 foram escolhidos como os modelos de tumor com base na sua expressão de E6 e HBx, respectivamente, e a sua tumorigenecity em ratinhos nus. Seis ratinhos nus do sexo feminino semanas de idade nu /nu CD1 adquiridos de Charles River foram injectadas no flanco direito com 10

7 CaSki ou Hep 3B2.1-7 células em 0,1 ml de meio DMEM contendo 10% de soro fetal de vitelo. tumores CaSki começaram a aparecer em torno de 60 dias após a injecção, Hep 3B2.1-7 tumores de 10 dias após a injecção de células. Para biodistribuição de HBx específicas do mAb, ratinhos nus foram inoculados com 10

7 células de melanoma A2058 humanos metastáticos e 10

7 células Hep 3B2.1-7 na flancos direito e esquerdo, respectivamente. Biodistribuição e terapia experiências foram iniciados quando os tumores atingiram 0,3-0,7 cm de diâmetro.

detecção imuno-histoquímica da proteína E6 de HPV em tumores CaSki

Os tumores tomadas a partir de ratos portadores de tumores foram fixadas em CaSki