Abstract

Fundo

análise mutacional Oncogênicos fornece orientação preditivo para terapêuticas tais como anticorpos anti-EGFR, mas só é bem sucedida para um subconjunto de pacientes de câncer colorretal (CRC).

Método

a molecular profiling abrangente de 120 pacientes com CCR, incluindo 116 primário, 15 metástase hepática, e 1 amostras de tecido de semeadura peritoneal foi realizada para identificar a relação entre v-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rato viral homólogo oncogene (

KRAS

) WT e mutante CRC tumores e os resultados clínicos. Isto incluiu a determinação dos padrões de activação de proteínas de receptor epidérmico humano 1 (HER1), HER2, HER3, c-Met, o factor de crescimento semelhante a insulina 1 receptor (IGF1R), phosphatidylinositide 3-quinase (PI3K), Src homologia 2 domínio contendo ( SHC), proteína quinase B (AKT) e extracelular quinase regulada por sinal (ERK) quinases utilizando a enzima colaborativo multiplexado imunoensaio reativa (CEER).

resultados

KRAS

WT e mutantes CRCs não eram diferentes no que diz respeito à expressão das diversas moléculas de sinalização. Mau prognóstico em termos de recidiva precoce ( 2 anos) e menor sobrevida livre de doença (DFS) correlacionado com maior ativação de PI3K sinalização relativa à sinalização HER quinase, mas não com o

estado mutacional do KRAS

.

KRAS

WT CRCs foram identificados como uma população mista prognóstico dependendo do seu nível de sinalização de PI3K.

KRAS

WT CRCs com rácio elevado índice de HER1 /c-MET demonstraram uma melhor DFS pós-cirurgia. atividades de c-MET e IGF1R em relação ao HER atividade do eixo foram consideravelmente maiores em CRCs recidiva precoce, o que sugere um papel destas quinases alternativas receptor tirosina (RTK) na condução de sinalização alta PI3K.

Conclusões

os dados apresentados subclassificados CRCs com base em suas vias de sinalização activadas e identificar um papel de c-Met e sinalização de PI3K impulsionado-IGF1R em CRCs, que é superior ao KRAS testes mutacionais sozinho. Os resultados deste estudo podem ser utilizados para identificar CRCs agressivos, explicar o fracasso das terapêuticas actualmente aprovados em subconjuntos específicos CRC, e, mais importante, gerar hipóteses para estratégias terapêuticas guiadas por via que podem ser testados clinicamente.

Citation : Lee J, Jain A, Kim P, Lee T, Kuller A, Princen F, et al. (2014) ativado cMET e-Driven IGF1R PI3K sinalização prediz pior sobrevida no câncer colorretal Independentes de KRAS mutacional Status. PLoS ONE 9 (8): e103551. doi: 10.1371 /journal.pone.0103551

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 25 Abril de 2014; Aceito: 30 de junho de 2014; Publicação: 04 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela Samsung Biomedical Research Institute conceder # SS1-B3-011-1. Esta pesquisa foi suppoorted por uma concessão do amp tecnologia Korea Saúde R D Projeto através do Korea Institute Indústria Saúde para o Desenvolvimento (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia. (Número Grant: HI13C1951). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Enquanto AJ, PK, TL, FP e SS são empregados pela Prometheus Laboratories, este não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

os anticorpos monoclonais, tais como cetuximab e panitumumab que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), um membro da família do receptor epidérmico humano (HER), têm provado ser eficaz em termos de taxa de resposta e sobrevida livre de progressão em combinação com quimioterapia citotóxica padrão em câncer colorretal metastático (CRCs) [1] – [4]. O visando EGFR anticorpos se ligam ao domínio extracelular do EGFR, que conduz à inibição da sua vias de sinalização a jusante, incluindo a 1 (MAPK1) eixo RAS-RAF-activada por mitogénio proteína quinase que é principalmente envolvidos na proliferação celular, e o v- akt timoma murino oncogene viral homólogo 1 (AKT1) via, que é principalmente envolvidos na sobrevivência celular e tumor invasão [5]. AKT1 é regulada pelo fosfatidilinositol a montante 3-quinase (PI3K) via de sinalização.

As mutações no homólogo oncogene viral v-Ki-ras2 Kirsten rato sarcoma (

KRAS

), mais frequentemente detectados em códons 12, 13 e 61, ocorrem em aproximadamente 40% dos pacientes CRC [6], [7].

KRAS

mutações surgiram como o fator preditivo negativo chave para a resposta ao tratamento em doentes tratados com cetuximab [8], [9]. Estes estudos têm sugerido que o

KRAS

do tipo selvagem tumores (WT) CRC seria sensível ao cetuximab; No entanto, até 65% de pacientes com

KRAS

WT tumores ainda são resistentes a anticorpos monoclonais anti-EGFR [10]. Resistência aos anticorpos anti-EGFR em um subconjunto de

KRAS

WT CRCs pode ser explicado pela presença de uma mutação no interior da

BRAF

oncogene [8], que é a jusante de

KRAS

. A razão para a não-resposta cetuximab nos restantes

KRAS

WT CRCs ainda não está claro. Além disso, embora

KRAS

mutações são tipicamente associados com a falta de resposta aos anticorpos anti-EGFR, dados recentes indicam que

KRAS

mutações G13D pode ser um preditor positivo da resposta cetuximab [8]. As mutações dentro do

PIK3CA

gene [10], que é um importante regulador da sinalização PI3K, também estão presentes em alguns tumores CRC que podem co-ocorrer com

KRAS

ou

BRAF

mutações [8], [11], sugerindo sua possível influência sobre a capacidade de resposta à terapêutica alvo, tais como anticorpos anti-EGFR, mas uma clara demonstração de tal correlação está faltando [12], [13].

a partir dos estudos descritos acima e, dado que uma grande parte dos pacientes de CRC com

KRAS

WT tumores não respondem ao cetuximab ou panitumumab, é evidente que uma análise mutacional simples não é suficiente para prever a capacidade de resposta a tais agentes terapêuticos. Além disso, uma vez que estudos recentes sugeriram que as respostas terapêuticas para inibidores de PI3K foram não se limitando a linhas celulares colorrectais com mutações de activação ou em pacientes com mutações [14] – [16], é imperativo ao perfil tumores para a sua predominante, bem como potencial controladores da via de sinalização alternativas, além da análise mutacional oncogénica. Portanto, nosso objetivo ao perfil tecidos CRC para investigar a correlação entre o estado mutacional e expressões de proteínas diferentes receptor tirosina quinase (RTK), tais como HER1, HER2, HER3, c-MET, e fator de crescimento semelhante à insulina 1 receptor (IGF1R). Além disso, as quinases a jusante de PI3K, Src homologia 2 domínio contendo (SHC), proteína quinase B (AKT), e extracelulares regulada por sinal quinase (ERK) foram determinados usando o immunomicroarray multiplexado com base Collaborative Enzima reforçada reactiva (CEER) imunoensaio [17] – [19] em 120 pacientes com CCR de fase I a IV, que incluiu 116 primário, 15 metástase hepática, e 1 amostras de tecido semeadura peritoneal. Em paralelo, análise mutacional somática marcou para mutações dentro do

KRAS Comprar e

BRAF

oncogenes. tumores CRC com mutações oncogênicas semelhantes demonstraram heterogeneidade nos seus perfis via de sinalização.

Pacientes e Métodos

grupo de pacientes e amostra de tecido Procurement

O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional (IRB) no Samsung Medical Center. Tudo investigação clínica foi realizada de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O consentimento informado foi dispensado pelo IRB devido à análise retrospectiva e os dados anónimos. tecidos congelados frescos (n = 120) recolhidos de tumores cirurgicamente ressecados (73 cólon, recto 47), 15 a partir de tumores hepáticos metastáticos e um do nódulo semeadura peritoneal, estavam disponíveis para análise final. Todos os tecidos congelados frescos foram recolhidas dentro de 30 min, no campo cirúrgico por um cirurgião, foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. espécimes de tumor foram confirmadas quanto à presença de tumor 70% área por um patologista. Para a análise, pequenos pedaços de tecidos congelados (10 mícrons Secções x 3) foram preparados utilizando lâminas de barbear previamente arrefecido e depois foram lisadas em 100 ul de tampão de lise. Os lisados ​​resultantes foram armazenadas a -80 ° C até análise posterior.

Collaborative Enzyme avançado Reactive-imunoensaio (CEER)

CEER usa uma plataforma baseada em microarray de anticorpos que podem medir a expressão e ativação os níveis de proteínas de transdução de sinal em tecidos tumorais e tecidos substitutos. O alvo seleccionado é primeiro capturado por um anticorpo de captura específico para o alvo, seguida por co-localização dos dois anticorpos detectores adicionais contra o mesmo alvo, o que resultou na detecção de alvo específico e quantificação. Métodos pormenorizados para esta tecnologia tenha sido descrito anteriormente [17] – [19] e podem ser encontrados no ficheiro S2. experiências representativas são mostrados na Fig.S1 em S1 Arquivo.

A análise da mutação

DNA genômico foi extraído de tecidos CRC utilizando o kit de tecido Qiagen. As amostras foram rastreados para mutações no

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

genes: G12a /C /D /S /V, G13C /D, e Q61H em

KRAS Comprar e V600E no

BRAF

. O ensaio mutacional foi baseado na tecnologia TaqMan tempo real de reacção em cadeia da polimerase (PCR), em combinação com os iniciadores específicos do alelo (ASP), bloqueador, e sonda utilizando uma modificação do tempo real Alelo método de detecção de PCR específica [20]. Resumidamente, ASPs foram usadas para detectar especificamente o alelo mutante. Um oligonucleótido bloqueador (bloqueador) complementar à sequência de tipo selvagem, foi utilizado para suprimir qualquer amplificação não específica do alelo de tipo selvagem. A mistura de PCR utilizado para todos os ensaios foi GTXpress Master Mix de Life Technologies. Todos os ensaios foram executados em placas de 384 poços ABI 7900HT PCR em tempo real do instrumento (Life Technologies).

A percentagem da variante alélica presente em amostras desconhecidas foi calculada utilizando uma curva padrão. A curva padrão foi gerada para cada mutação a partir do ADN extraído a partir de uma linha celular positiva para que a mutação utilizando uma série de diluições de ADN (100, 10, 1, 0,1 e 0,01 ng). Uma lista de linhas de células positivas utilizados para gerar as curvas padrão é mostrada na tabela abaixo. O ADN a partir das respectivas linhas de células foi extraído utilizando o Qiagen DNeasy Blood Kit de tecido.

Usando a curva padrão, a quantidade da respectiva mutação na amostra de ADN desconhecido foi calculado a partir do valor de Ct que poderia então ser utilizada para calcular a variante alélica por cento com base no pressuposto de que o padrão da célula a linha é 100% positivo para que a mutação específica. A variação alélica das linhas de células foi determinada utilizando iniciadores específicos para o alelo de tipo selvagem. Seguem-se as linhas celulares utilizadas para mutações do gene: SW1116 (KRASG12A), NCI-H23 (KRASG12C), LS174T (KRASG12D), PSN1 (KRASG12R), A549 (KRASG12S), SW403 (G12V), H1734 (KRASG13C), T84 (KRASG13D ), H460 (KRASQ61H) e HT29 (BRAF V600E).

A análise estatística

Mann-Whitney

t

-Testes, análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, e análise de correlação de Pearson foram realizadas utilizando GraphPad Prism versão 5 para Mac OS X (GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA, www.graphpad.com). DFS foi determinada utilizando o método de Kaplan-Meier e as curvas de sobrevida foram comparados usando o método de Log-ratio. A sobrevivência foi medido a partir da data da cirurgia. Todos os testes foram em frente e verso, e valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. A análise estatística foi realizada usando SPSS 20 software para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

características do paciente

As características dos 120 pacientes de CRC são proporcionados na Tabela 1. Setenta e três pacientes apresentaram com um primário de cólon, enquanto que 47 pacientes tiveram reto primário. Aproximadamente 70% dos pacientes submetidos a quimioterapia ou radioterapia adjuvante dependendo da localização do tumor primário. Dez pares de metástase do fígado e do cólon, um par de semeadura cólon-peritoneal foram incluídos na análise. Todos os tecidos, incluindo amostras pareadas, foram adquiridos no momento da cirurgia e imediatamente congelados instantaneamente no campo cirúrgico para análise molecular futuro.

diferenciais ativações via de sinalização previsto pior sobrevida melhor do que mutações KRAS

KRAS

mutações, com

KRAS

mutações G12D e G13D sendo as mais frequentes, foram observadas em 39% (45/115) das amostras em nossa coorte CRC. Em particular, 28/115 pacientes realizado

KRAS

mutações G12 e 17/115 pacientes realizado

KRAS

mutações G13D. Mutações em

BRAF, que é a jusante de

KRAS

, foram encontrados em 4% (5/115) dos pacientes. Embora

KRAS

CRCs G12-mutantes são geralmente associados com mau prognóstico, uma percentagem considerável de

KRAS

WT CRCs mostrou baixa DFS e alguns

KRAS

G12 CRCs mutantes apresentaram alta DFS independentemente do seu estágio do tumor (Fig. 1A). Tumores em cada

KRAS

subtipo mutacional demonstrou uma expressão média semelhante de ERK fosforilada (pERK), que é a jusante da

KRAS

(Fig. S1). Uma percentagem equivalente de tumores CRC expressa pERK acima da mediana (51,8% em

KRAS

WT, 48,5% no G12 mutado, e 44,4% no G13D tumores mutantes).

(A) Lote de sobrevida livre de doença (DFS) versus o estágio do tumor em

KRAS

WT e G12mut CRCs primários. Cada ponto representa um paciente individual e os pontos marrons e azuis indicam os pacientes que fizeram ou não receberam quimioterapia adjuvante, respectivamente. (B) curvas comparativas DFS de amostras de CRC segregados por seus tempos de recorrência pós-cirurgia. DFS para pacientes recidiva precoce (recorrência ≤ 2 anos) é mostrado em vermelho e DFS para pacientes de recaída tardios (recidivas 2 anos) é mostrado em azul. Os valores P são indicados. A tabela abaixo do gráfico lista a porcentagem de pacientes com um determinado

KRAS

genótipo em cada grupo. análise de correlação (C) Pearson dos primeiros vs. CRCs recaída final à expressão de pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2 e pPI3K /pHER3 em toda a coorte CRC. correlações significativas são destacadas em amarelo. A trama na caixa mostra a diferença nas proporções pPI3K /pHER3 em recidiva precoce vs. CRCs tardios de recidivas.

Como esperado, as curvas de sobrevivência para os dois grupos foram significativamente diferentes (Fig. 1B) , com os respectivos tempos de sobrevida mediana de 19,8 meses para recidiva precoce (2 anos de cirurgia) e indefinido para recorrência tardia (taxa de risco = 117,5). Como mostrado na Fig. 1C, maior expressão de PI3K activada correlacionada com recidiva precoce e, especificamente, maior expressão de rácios /pher pPI3K foi significativamente associada com uma recidiva precoce. PI3K é um importante efectora de sinalização a jusante do eixo HER-cinase com sítios de ligação directos sobre HER3. O valor de corte para a relação pPIK3 /HER3 foi determinada como mostrado na Fig.S2 em S1 Arquivo. Além disso, a expressão pPI3K /pHER3 foi significativamente maior nos tumores CRC que recidivaram dentro de 2 anos (Fig. 1C). Portanto, a sinalização PI3K melhorada foi observada em CRCs com um DFS mais curtos ou pior prognóstico.

sinalização de alta PI3K está associado a recidiva precoce no CRC

Para obter mais conhecimentos sobre o alto vs. baixo pPI3K sinalização coortes CRC, nós nos concentramos em sub-coortes CRC segregadas pela relação pPI3K /pHER3 (Fig. 2A). As características dos pacientes na alta vs. baixa pPI3K sinalização coortes CRC foram bem equilibradas em termos de seu estágio do tumor, tratamentos de quimioterapia e estado mutacional dos oncogenes

KRAS Comprar e

BRAF

(Fig. 2B ). DFS de

KRAS

WT CRCs com maior expressão pPI3K /pHER3 foi significativamente pior do que a de

KRAS

WT CRCs com menor expressão pPI3K /pHER3 (Fig 2C.); no entanto,

KRAS

tumores G12mut demonstrado pobres DFS independentemente do seu nível de expressão pPI3K. Curiosamente, as comparações DFS de

KRAS

WT, G13Dmut e G12mut CRCs dentro do grupo de baixo pPI3K mostrou diferenças consideráveis, com

KRAS

WT e

KRAS

tumores G13D ter uma melhor sobrevivência do que o

tumores KRAS

G12mut (Fig. 2D). Apesar das diferenças dramáticas na sobrevivência observadas nos grupos de alta e baixa pPI3K /pHER3 dependendo de sua

KRAS

WT ou G12 mutado genótipo, os dois grupos foram muito semelhantes em termos de suas diferenças dos marcadores relevantes de expressão. Em outras palavras, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2 e pPI3K /pHER3 foram expressas a níveis consideravelmente mais elevados no grupo de alto pPI3K /pHER3 tanto em

KRAS

WT e G12 mutado CRCs (Fig. S3 no arquivo S1 ). Note-se que a expressão pPI3K não foi consideravelmente maior, mas era a expressão pPI3K relação ao activado HER eixo que foi maior nos grupos que mostram sobrevida.

Os respectivos valores de p são indicados. (A) Os diagramas de caixa da Mann-Whitney

t

-test mostrando a diferença na expressão de pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2 e pPI3K /pHER3 entre o grupo de alto pPI3K /pHER3 e baixa pPI3K /grupos pHER3. Os respectivos valores de p estão indicados. (B) Tabela listando as características dos CRCs primárias em alta PI3K (alta pPI3K /pHER3) versus baixo PI3K (baixo pPI3K /pHER3) coortes de sinalização. Características incluem segregações com base no estágio do tumor, o estado do tratamento de quimioterapia e estado mutacional de

KRAS

e

BRAF

. Ao todo, 67/115 amostras estão incluídos na coorte de alta PI3K e 48/115 amostras estão incluídos na coorte baixo PI3K. Os números indicam a percentagem de amostras dentro de cada grupo com base em cada um indicado característica. (C) DFS de acordo com os rácios pPI3K /pHER3 em

KRAS

WT e

KRAS

G12mut CRCs. (D) as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier de alta PI3K (pPI3K /pHER3) e coortes baixos PI3K comparando a DFS da

KRAS

WT, G13Dmut, e as amostras G12mut. (E) de alta PI3K (alta pPI3K /pHER3) e baixa PI3K (baixo pPI3K /pHER3) grupos em amostras de CRC primários e metastáticos emparelhados.

Estes dados fornecidos evidências de que uma sinalização de alta pPI3K, que podem possivelmente, ser accionado por outros que, ou em adição ao SEU eixo sinais a montante, está associado com os CRCs agressivos com recidiva precoce. Além disso, estes dados demonstram claramente a heterogeneidade dentro da

KRAS

WT população com base no nível de expressão pPI3K nestes tumores. Por outro lado,

KRAS

G12 mutado CRCs tipicamente demonstrado sobrevivência pobres, independentemente do nível da sinalização pPI3K.

CRCs agressivos orientada por PI3K, incluindo CRCs metastáticos, apresentam maior c-MET e sinalização IGF1R que o HER eixo sinalização

uma vez que mais elevados rácios /pher pPI3K correlacionadas com CRCs recidiva precoce, a hipótese de que deve haver também uma diferença significativa na pher /PMET e rácios pher /pIGF1R se PMET e pIGF1R são responsáveis para sinalização de alta pPI3K. Em seguida, examinamos essas redes de sinalização em 10 pares de amostras pareadas síncronos primários metastático disponíveis em nossa coorte de estudo. Os pares de primários CRC-metastático foram separados em dois grupos com base na razão de expressão pPI3K /pHER3 da amostra CRC primária em cada par. Houve um aumento significativo na proporção pPI3K /pHER3 para as amostras metastáticos correspondentes, no grupo baixa relação pPI3K /pHER3 (Fig. 2e), ao passo que permaneceu inalterada entre amostras primários e metastáticos do grupo de alta proporção pPI3K /pHER3.

Agressividade de KRAS G12mut CRCs está correlacionada com alta c-MET expressão relativa aos membros SEUS eixo

em seguida, tentaram identificar marcadores que podem ser diferencialmente expressos entre

KRAS

WT e G12mut CRCs no grupo de baixo pPI3K. Com base em nossa observação preliminar de alta expressão de um total de c-MET e IGF1R em

KRAS

tumores G12mut comparação com o

tumores KRAS

WT (Fig. 3A, Fig. S4 no arquivo S1), examinamos se um diferencial de c-Met ou expressão dependente de IGF1R pode segregar os subgrupos

KRAS

WT e G12mut dentro do grupo de baixa relação pPI3K /pHER3. rácios relativos HER1 /c-Met e HER3 /c-Met foram consideravelmente maiores no

KRAS

WT CRCs que em

KRAS

tumores G12mut (Fig. 3b) no grupo de baixo pPI3K /pHER3 , mas não no grupo de alto pPI3K /pHER3, o que foi consistente com as diferenças DFS (Fig. 3a). Nós investigamos se proporções adequadas de HER1 /c-MET (Fig. S5 em S1 Arquivo) ou HER3 /c-MET também pode segregar as diferenças DFS observadas entre o

KRAS

WT e G12mut CRCs dentro da baixa pPI3K /grupo rácio pHER3. Análise de o

KRAS

genótipos das amostras nas duas sub-coortes revelou que a maioria das amostras

KRAS

WT e G13D estavam presentes na alta HER1 /c-met sub-coorte (ou seja, HER1 c-Met), enquanto que a maior parte da

KRAS

amostras G12mut estavam presentes em baixa HER1 /c-met sub-coorte (isto é, HER1 c-Met) (Fig . 3C). Um rácio de corte de HER1 /c-MET semelhante não segregou o grupo de alto pPI3K /pHER3 baseado no

KRAS

genótipos (Fig. 3D). análise paralela com um índice de HER3 /c-MET resultou em dados semelhantes, mas menos robusto que não segregou o KRAS WT e G12mut CRCs tão claramente como o índice de HER1 /c-MET (

dados não mostrados

). Estes dados indicaram que o agressivo

KRAS

tumores G12mut são molecularmente distinta, porque eles são mais marcados por uma expressão elevada de c-met, que é equivalente ou superior a expressão HER1 e HER3.

( a) PMET rácio /Tc-MET foi comparada entre alta PI3K (alta pPI3K /pHER3) e baixa PI3K (grupos de alto pPI3K /pHER3), utilizando o teste de Mann-Whitney

t

-teste. A comparação é mostrado em todas as CRCs,

KRAS

WT, G13D mutado, e G12 mutado CRCs. diferenças significativas com p-valores são indicados em azul. (B) a expressão comparativa entre grupos de alta e baixa PI3K para os seguintes marcadores: pHER1 /PMET, pHER2 /PMET, pHER3 /PMET, pHER1 /pIGF1R, pHER2 /pIGF1R e pHER3 /pIGF1R. diferenças significativas com p-valores são indicados em azul.

Discussão

Este estudo baseou-se na hipótese de que o estado de activado vias de sinalização em

KRAS

WT e CRCs mutantes pode fornecer informações adicionais que podem ser úteis para a compreensão dos resultados terapêuticos nestes tumores [17] – [19]. A análise apresentada neste estudo dá provas de que CRC pode ser sub-classificados de acordo com seus perfis moleculares da via de sinalização, independentemente das

KRAS

estado mutacional, conforme resumido na Fig. 4. Além de proporcionar conhecimentos moleculares em CRC prognóstico, tal perfis baseados em via pode ter implicações importantes sobre a estratificar a população de pacientes CRC para as estratégias terapêuticas adequadas.

esquemático resumindo a sub-classificação dos CRCs com base na sua via de sinalização perfis e

KRAS

estado mutacional. As possíveis opções terapêuticas para cada sub-classe com base em seus perfis da via são indicados.

Prognosis CRC tumores primários pós-operatório tem sido correlacionada com a sua

estado mutacional do KRAS

[21 ]. Embora esta tendência geral também foi observado em nossa coorte amostra CRC, com

KRAS

WT tumores demonstrando melhor DFS pós-cirurgia do que

tumores mutantes G12 KRAS

, não foi significativa devido à heterogeneidade as vias de sinalização dentro de cada

KRAS

subtipo mutacional, especialmente em estágios II e III tumores CRC independentemente de haver ou não os pacientes receberam quimioterapia. Isto sugere que

KRAS

mutações confere apenas uma parte da vantagem necessário para a sobrevivência de células tumorais com sinais de sobrevivência adicionais, presumivelmente decorrentes de múltiplas vias de sinalização. CRCs com alta atividade da PI3K recaída dentro de 2 anos, independentemente da sua

estado mutacional do KRAS Comprar e teve mau prognóstico. Mesmo

KRAS

WT CRCs com a sinalização de alta PI3K foram tão agressiva como a

KRAS

G12mut CRCs com DFS pós-cirurgia indistinguíveis. Em contraste,

KRAS

WT CRCs com a atividade de sinalização de baixo PI3K demonstrou um melhor prognóstico e pode ser separada da agressiva

KRAS

G12mut CRCs com uma relação de corte índice de HER1 /c-MET apropriada , porque os níveis de expressão de c-MET foram maiores no

KRAS

G12mut CRCs. Em nossa coorte do estudo, estes

KRAS

WT CRCs constituído ~44% do total

KRAS

população WT e revelou heterogeneidade. Heterogeneidade no

populações KRAS

WT CRC foi previamente notado em vários outros estudos, porque nem todos

KRAS

WT CRCs são sensíveis a anticorpos anti-EGFR. Uma razão possível tem sido descrita a presença de

BRAF

mutações. O número de

BRAF

amostras -mutated em nossa coorte foi pequeno demais para tirar conclusões razoáveis; no entanto, 3/5 do

BRAF

CRCs -mutated na presença de WT

KRAS

demonstrou uma sinalização de alta PI3K. Nosso estudo fornece um possível mecanismo para a heterogeneidade no

KRAS

WT CRCs e especula-se que 44% da

KRAS

WT CRCs com baixa de sinalização PI3K e expressão alta HER1 podem ser aqueles sensíveis às anti -Seu terapias, tais como anticorpos anti-EGFR. Aproximadamente 47% das amostras de CRC com

KRAS

mutações G13D recentemente foram sugeridos como tendo características de resultados distintos baseados em terapia [8] e foram monitorados com a nossa

amostras KRAS

WT em termos de ter baixo sinalização PI3K e uma alta expressão de HER1. A relevância da sinalização PI3K e inibidores de PI3K /mTOR foi previamente sugerido na

KRAS mutante

[22] e

BRAF

mutante [23] CRCs. Os resultados do nosso estudo são consistentes com esses relatórios e expandir ainda mais a importância da PI3K sinalização em CRCs independentemente do seu estado mutacional.

relativamente elevados c-MET e IGF1R actividades em comparação com suas atividades membros quinase em CRCs agressiva sugeriu que estes RTKs alternativas podem ser os condutores da sinalização de alta PI3K.

KRAS

CRCs G12-mutantes foram anotados para expressar níveis de receptores mais elevados de c-met do que os os seus membros que se correlacionaram com o seu mau prognóstico. evidência mais convincente em apoio da actividade PI3K-driven IGF1R em CRCs agressivos c-Met e veio a partir dos pares de amostras primárias metastático, em que estes marcadores mostraram um claro aumento da contrapartida metastático quando comparado com a amostra primária correspondente, mesmo que o estado mutacional do par manteve-se inalterada. É importante notar que as diferenças de expressão para os marcadores individuais não apresentaram diferenças significativas, mas foi a expressão relativa de pher sinalizando para PMET e pIGF1R que revelaram padrões consideravelmente diferenciais entre CRCs que eram mais agressivo e recidivante anterior contra os que foram associados com melhor prognóstico. Atualmente, não há opções tangíveis para identificar CRCs agressivos e definindo opções terapêuticas para tratá-los. testes de mutação são a única estratégia disponível, que não identifica o agressivo

KRAS

WT CRCs. O nosso estudo fornece provas para os perfis da via de sinalização activados que são superiores aos testes oncogénica mutacionais sozinho, porque estes resultados podem ser utilizados para identificar os CRCs agressivos e, possivelmente, guiar as estratégias terapêuticas. A implicação clínica de caracterização de proteínas combinatória e testes de mutação em termos de sensibilidade às drogas está sendo testado tanto em estudos clínicos pré-clínicos e potenciais.

O nosso estudo também descobriu uma variação substancial no perfil de proteômica fosforilada entre correspondido CRCs primários e metastáticos . Isto estava em contraste com a genotipagem, de acordo com o qual houve completa concordância entre os tecidos tumorais primários e metastáticos. Isto está de acordo com os resultados de um dos maiores estudos de comparação entre metástases hepáticas primárias e combinados em 305 pacientes com CCR (taxa de concordância, 96,4%; intervalo de confiança de 95%, 93,6-98,2%) [24]. Além disso, uma análise genômica recente sobre 84 pacientes com metástases CRC e hepáticos primários demonstrou uma taxa de concordância alta de 90% entre metástases primárias e fígado por cinco genes (ou seja,

KRAS

,

ARN

,

BRAF

,

PIK3CA

,

TP53

) [25]. Uma das hipóteses mais plausíveis para esta elevada taxa de concordância no estado mutacional é que

KRAS

mutações são os eventos de condução início em progressão CRC de adenoma [26]. Se essas diferenças em perfis via correlacionam-se com as respostas ao tratamento para inibidores específicos RTK, pode ser necessário fazer uma biópsia sítios metastáticos, além de tumores primários para obter uma previsão mais precisa da resposta ao tratamento. No entanto, o tamanho da amostra era muito pequena, com apenas dez pares de primários e metástases. Assim, uma análise mais profunda emparelhado é necessária para abordar rigorosamente esta discrepância em perfis proteômica.

Em conclusão, nosso estudo demonstra que existe uma heterogeneidade significativa nas vias de sinalização da proteína activada, apesar de um estado mutacional semelhante no CRC. Portanto, dicotomizando CRC simplesmente como

KRAS mutante

contra

KRAS

WT pode ser uma subestimação da heterogeneidade molecular dentro de cada subgrupo de CRC. Além disso, um perfil mais abrangente via de sinalização, para além de testes mutacionais oncogénicos, deve ser realizado para obter uma identidade molecular mais clara dos tumores.

Informações de Suporte ficheiro

S1.

Apoio Figuras. Figura S1. Profiling de sinalização marcadores Caminho no cancro colorectal usando CEER. (A) Classificação de expressão pERK de alto a baixo em

KRAS

do tipo selvagem, G12 mutação e G13D mutado CRCs é mostrado em uma trama cachoeira. expressão pERK acima da mediana é representada no eixo dos Y positivo. pAKT expressão em cada amostra é também mostrada. A tabela abaixo mostra os valores medianos CU pERK em cada subgrupo mutacional de tumores CRC, bem como a percentagem de tumores que expressam pERK acima da mediana. (B) imagens de imuno-matriz CEER para proteínas de transdução de sinal indicados em 8 amostras colorretal. Como representado com uma barra de cor abaixo da imuno-array, um branco ou um vermelho representa uma expressão de alto nível ou fosforilação enquanto um verde ou um azul representa uma expressão de baixo nível ou fosforilação dos respectivos marcadores. estágio do tumor e do

KRAS

estado mutacional de cada amostra são indicados. Figura S2. Efeito do índice pPI3K /pHER3 na sobrevida livre de doença em CRCs. curvas DFS comparativos de amostras de CRC segregados, diminuindo índices pPI3K /pHER3. DFS para amostras acima de cada respectivo corte é mostrado em vermelho e DFS para amostras abaixo de cada respectivo corte é mostrado em azul. p-valores respectivos são indicados. Figura S3. Características dos pares de amostras de CRC primárias metastático combinados. Tabela listando as características do tumor primário dos 10 pares combinados primários metastático CRC segregados por seus rácios de expressão pPI3K /pHER3. 6 pares de amostras emparelhadas estão incluídos no grupo de DFS pior onde a expressão pPI3K /pHER3 era 10/02. Características incluem o número de amostras em cada estágio do tumor, se o paciente recebeu quimioterapia e número de amostras com base no estado mutacional de

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

. Figura S4. Comparativa expressão do marcador de sinalização entre

KRAS

WT e G12 mutado CRCs. Figura S5.