Abstract

Foram analisados ​​os níveis de enzimas que metabolizam fluoropirimidina expressão (timidilato sintase [TS ], diidropirimidina desidrogenase [DPD], timidina fosforilase [TP] e fosforribosil orotate [OPRT]) para identificar potenciais biomarcadores relacionados com os resultados do tratamento de câncer gástrico (GC) pacientes que receberam adjuvante S-1 quimioterapia. Neste estudo, 184 pacientes que receberam gastrectomia curativa (D2 linfonodo dissecação) e adjuvante S-1 foram incluídos. Imunohistoquímica e reação reversa quantitativa em cadeia da polimerase de transcrição foram realizados para medir a proteína e níveis de mRNA de TS, DPD, TP, e OPRT no tecido tumoral. Na análise univariada, a expressão da proteína DPD intratumoral baixo estava relacionado com pior sobrevida livre de doença em 5 anos (DFS; 78% vs. 88%; P = 0,068). intratumoral baixa expressão de mRNA DPD (1º [menor] quartil) também foi relacionado ao pobre DFS (69% vs. 90%; P 0,001) em comparação com a alta expressão DPD intratumoral (2ª a 4ª quartis). Na análise multivariada, a baixa expressão da proteína ou mRNA DPD intratumoral foi relacionada a pior DFS (P 0,05), independentemente de outras variáveis ​​clínicas. TS, TP e expressão OPRT níveis não estavam relacionadas com os resultados do tratamento. toxicidades não hematológicas graves (grau ≥ 3) tiveram uma tendência para um desenvolvimento mais frequente em pacientes com baixa expressão de mRNA DPD intratumoral (29% vs. 16%; P = 0,068). Em conclusão, os pacientes do GC com alta expressão DPD intratumoral não teve resultado inferior seguinte adjuvante S-1 terapia comparação com aqueles com baixa expressão DPD. Em vez disso, a baixa expressão DPD intratumoral foi relacionada à má DFS

Citation:. Kim J-Y, Shin E, Kim JW, Lee HS, Lee D-W, Kim S-H, et al. (2015) Impacto dos níveis de expressão intratumoral de Fluoropirimidina que metabolizam enzimas sobre resultados do tratamento de adjuvante S-1 terapia no câncer gástrico. PLoS ONE 10 (3): e0120324. doi: 10.1371 /journal.pone.0120324

Editor do Academic: Qing-Yi Wei, Cancer Institute, Duke, Estados Unidos

Recebido: 13 de novembro de 2014; Aceito: 20 de janeiro de 2015; Publicação: 20 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado por bolsas de investigação da National University Bundang Hospital Fund Research Seoul (02-2014-019) e Jeil Pharmaceutical Company (Seul, Coréia). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este estudo foi parcialmente financiado pelo Jeil Pharmaceutical Company sob a forma de financiamento da investigação para Keun -Wook Lee. Os outros autores não relatam nenhum conflito de interesses. Não há patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O câncer gástrico (CG) é o quinto a maioria de cancro comum ea terceira principal causa de morte por câncer no mundo. Cerca de metade dos casos ocorrem na Ásia Oriental [1]. A cirurgia é o tratamento de escolha em GC localizada, e D2 dissecção é considerado o método padrão. Apesar D2 dissecção, a recorrência é observado em mais de 40% dos pacientes com GC fase avançada após a cirurgia por si só [2, 3]. Recentemente, dois estudos prospectivos demonstraram que a quimioterapia adjuvante para GC ressecado é eficaz na redução da taxa de recorrência [2, 3].

S-1 é um agente oral contendo tegafur (um pró-fármaco de f luorouracilo), gimeracilo (um inibidor da di-hidropirimidina desidrogenase [DPD]), e oxonato de potássio (um inibidor de 5-fluorouracilo [5-FU] no tracto gastrintestinal) [4]. A Quimioterapia Adjuvante Trial of TS-1 para o cancro gástrico (ACTS-GC) revelou que adjuvante S-1 quimioterapia por 1 ano reduz recorrência do tumor em pacientes com GC curativa ressecado [3]; a taxa de sobrevivência livre de recidiva em 5 anos foi de 65,4% no grupo adjuvante S-1 e 53,1% no grupo só de cirurgia (hazard ratio [HR], 0,653; 95% intervalo de confiança [IC], 0,537-0,793). Com base nesses resultados, adjuvante S-1 quimioterapia é actualmente amplamente utilizado para prevenir GC recidiva em países do Leste Asiático [5-7].

A timidilato sintase (TS), timidina fosforilase (TP), fosforribosil orotate (OPRT ), e DPD estão relacionadas com o metabolismo fluoropirimidina. Vários estudos sugeriram que os níveis dessas enzimas que metabolizam fluoropirimidina expressão têm associações com os resultados de sobrevivência em pacientes GC metastático submetidos a quimioterapia baseada em S-1 paliativos [8-10]. No entanto, esses estudos mostraram resultados inconsistentes sobre o valor preditivo destas enzimas em quimioterapia paliativa baseado em S-1, o que pode ser devido ao pequeno número de pacientes e diferenças na S-1 contendo esquemas utilizados entre os estudos. Até o momento, os estudos sobre a relação entre os níveis de expressão de enzimas que metabolizam fluoropirimidina e resultados do tratamento adjuvante S-1 em GC têm sido escassos. Por isso, foram analisados ​​os perfis de proteínas e expressão de mRNA de enzimas que metabolizam fluoropirimidina (TS, DPD, TP e OPRT) para identificar marcadores relacionados com os resultados do tratamento de adjuvante S-1 quimioterapia em pacientes GC.

Materiais e Métodos

população de pacientes

Usando um câncer GC grupo de pacientes que foi prospectivamente mantida em Seoul National Bundang Hospital Universitário [5, 6], este estudo foi concebido de forma retrospectiva. Na coorte prospectivo, todos os pacientes foram submetidos a gastrectomia curativa com D2 dissecção e foram tratados com adjuvante S-1 quimioterapia. Os pacientes preencheram os seguintes critérios elegíveis: junção gastroesofágico histologicamente confirmado ou adenocarcinoma gástrico; patológica estágio II-III usando American Joint Committee on Cancer (AJCC, 7

th edição); Grupo de Oncologia Cooperativo do Leste (ECOG) performance status (PS) 0-2; e de medula óssea adequadas, renais e função hepática. Dois pacientes com IB palco e fatores de risco adicionais (isto é, N2 metástase em linfonodo pela classificação encenação japonês [11]) também foram incluídos.

Os pacientes que foram submetidos a gastrectomia entre novembro de 2006 e setembro de 2010 foram matriculados (N = 184 ). Para este estudo, os consentimentos informados por escrito foram recebidos a partir de pacientes para a utilização de tecidos de tumor e arquivados dados clínicos. O Conselho de Revisão Institucional de Seul Bundang Hospital da Universidade Nacional aprovou este estudo. (Número IRB: B-1205 /154-006)

avaliação de Tratamento e toxicidade

S-1 foi administrado por via oral para 4 semanas, seguido de 2 semanas de repouso. A duração do S-1 tratamento foi planejado para ser um ano, se não havia nenhuma evidência de recorrência tumoral, efeitos adversos inaceitáveis, ou recusa da paciente. A dose inicial e modificação de S-1 dose durante o tratamento foram determinados como em relatórios anteriores [5, 6]. A toxicidade foi classificada de acordo com os Critérios Comuns do National Cancer Institute toxicidade (versão 3.0).

A intensidade da dose (DI) foi definida como a razão do total de S-1 dose por metro quadrado do paciente, dividido pela a duração total do tratamento de S-1. A intensidade da dose relativa (RDI) foi calculado dividindo-se o DI recebidos pelo DI planejado.

imuno-histoquímica (IHQ)

Anteriormente manchadas hematoxilina e eosina lâminas foram revisadas, e um representante de formalina-fixo embebido em parafina (FFPE) bloco de arquivo foi selecionado. blocos de matriz de tecido foram preparadas como descrito em nosso estudo anterior (SuperBiochips Laboratories, Seoul, Coreia) [8]. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: TS anti-humanos (TS106 clone, monoclonal de ratinho; Thermo Scientific; 1:70 diluição), OPRT anti-humano (clone 2F5; monoclonal de ratinho; Abnova; diluição de 1: 1000), anti-humano TP (. clone P-GF 44C; monoclonal de ratinho; Thermo Scientific; diluição de 1: 500), e DPD anti-humano (clone ERP8811; coelho monoclonal; Abcam; diluição de 1: 500). A ligação do anticorpo foi detectada utilizando avidina-biotina-peroxidase de complexo (Universal Elite ABC kit PK-6200; Vectastain, Burlingame, CA, EUA) durante 10 min e uma solução de tetracloridrato de diaminobenzidina (Kit HK 153-5K; Biogenex, San Ramon, CA, EUA). As secções foram contrastadas com hematoxilina de 0,1%, desidratado, e montado. A coloração foi examinado por dois investigadores independentes cegos para o resultado clínico. intensidades de coloração foram semi-quantitativamente medido com uma ampliação de 200 × e categorizados como negativo (pontuação = 0), fraco (pontuação = 1), moderada (pontuação = 2) ou forte (pontuação = 3). A percentagem de células imunorreactivas também foi avaliada. A pontuação IHC foi calculado da seguinte forma:. A pontuação de intensidade de coloração foi multiplicado pela percentagem de área manchada da amostra de tumor

quantitativa transcrição reversa reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR)

A os níveis de expressão de genes de ARNm foram quantificados por qRT-PCR. De ARN (500 ng) a partir de tecidos FFPE foram submetidos a síntese de ADNc, utilizando o ADNc da platina amfiRivert Master Mix Síntese (GenDEPOT). Sete genes (quatro genes de vias fluoropirimidina e três genes de referência) foram pré-amplificado, a uma diluição final de 0,05 x concentração inicial ensaio TaqMan (Applied Biosystems por Life Technologies). As condições termo-ciclo foram as seguintes: 1 ciclo de 95 ° C (10 min), seguido por 14 ciclos de 95 ° C (15 s) e 60 ° C (4 minutos). Após a amplificação do alvo, as amostras foram diluídas 1: 5 com tampão de suspensão de ADN e, em seguida qPCR foi realizado em Fluidigm 48,48 dinâmico matrizes utilizando o sistema BioMark HD de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram corridas em triplicado. Três genes de referência (ACTB, GAPDH, e FTL) foram usadas para normalizar os dados de expressão de genes. genes de referência foram seleccionadas com base na sua expressão baixa variabilidade nos dados de microarray anteriores (dados não mostrados). Para a normalização dos dados de qRT-PCR, significa ciclo limiar de valores (Ct) foram convertidos em valores de expressão relativa (-ΔCt) subtraindo a média dos genes de referência, em que cada unidade reflecte um aumento de 2 vezes na expressão. As sondas utilizadas foram como se segue: TS (Hs00426586_m1), OPRT (Hs00923517_m1), TP (Hs01034319_g1), DPP (Hs00559279_m1), ACTB (Hs01060665_g1), GAPDH (Hs02758991_g1) e FTL (Hs00830226_gH); informações mais detalhadas está disponível em https://www.appliedbiosystems.com (Applied Biosystems por Life Technologies).

A análise estatística

As diferenças nas características clínicas foram comparadas usando c2-testes,

t

-Testes, ou Mann-Whitney

U

teste. c2-testes foram utilizados para comparar as distribuições de toxicidades relacionadas com o S-1 entre os diferentes grupos de frequências. sobrevida livre de doença (DFS) foi calculado a partir da data da cirurgia para o momento da primeira recorrência ou morte por qualquer causa. A sobrevivência global (OS) foi definido como o intervalo de uma cirurgia para morte devido a qualquer causa. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para analisar DFS ou OS. Univariada e multivariada na DFS ou OS foram realizadas utilizando os testes de log-rank e testes proporcional perigos de regressão de Cox, respectivamente. Os valores de P dois lados de 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises de dados foram realizados utilizando o IBM SPSS Statistics 21 para Windows (IBM Corp., Armonk, NY, EUA).

Resultados

As características dos pacientes e entrega dos S-1 quimioterapia

as características basais dos 184 pacientes são mostradas na Tabela 1. A idade mediana foi de 57 anos (gama, 30-79 anos). gastrectomia laparoscópica foi realizada em 50% dos pacientes, e a proporção de pacientes com doença de fase III foi de 55%. A mediana de duração de seguimento foi de 47,0 meses (variação, 3.5-81.8 meses). Durante o seguimento, recidiva tumoral e da morte foram confirmados em 29 (16%) e 22 (12%) casos, respectivamente. Cinco ano DFS e OS tarifas em todos os pacientes foi de 83% (Fig. 1 (A)) e 87%, respectivamente. Como tempo de seguimento não foi suficiente para análise posterior OS, foi realizada análise de sobrevivência apenas para DFS. DFS resultados clínicos de acordo com as variáveis ​​são apresentados na Tabela 1, Fig. 1 (B), e S1 Fig.

Planejada 1 ano de tratamento com S-1 foi concluída em 139 pacientes (76%), e o número médio de entrega S-1 quimioterapia ciclos foi de 7,4 (95% CI, 7,0-7,8). Média e mediana RDI durante todos os ciclos de terapia S-1 foram de 77% (95% CI, 73-81) e 88% (intervalo de 4-100), respectivamente. S-1 foi no geral o tratamento tolerável, e perfis de toxicidade são apresentados no Quadro S1

Impacto de níveis de enzimas metabolizadoras de fluoropirimidina expressão em resultado do tratamento:. Analisa univariada

Dos 184 pacientes, IHC foi bem sucedido em 183 pacientes. Vamos definir o valor mediano da pontuação IHC para cada proteína (TS, OPRT, TP, e DPD) como valor de corte para dividir os pacientes em dois grupos. Embora os níveis de quatro proteínas de expressão não foram significativamente relacionados com DFS (Tabela 2), o baixo nível de expressão DPD (pontuação IHC 10 [valor de corte; mediana]) mostrou uma tendência de pior em 5 anos DFS (78% vs . 88%; P = 0,068; A Fig. 2 (A)). Além disso, os pacientes com maior expressão TP (pontuação IHC 0 [valor de corte; mediana]) tinham uma tendência a ter menor duração DFS do que aqueles com nenhuma expressão TP (78% vs. 87%; P = 0,094). Os níveis de TS e OPRT expressão não tinha associação com desfechos DFS (P = 0,914 e 0,109, respectivamente).

(A) Doença de sobrevida livre de acordo com as feridas IHC de DPD (cut-off valor; mediana). As curvas de sobrevida livre de doença de acordo com os níveis de expressão de mRNA intratumorais de DPD ((B) quando o valor de cut-off é a mediana; (C) quando os pacientes são classificados em quartis; (D) quando os pacientes são classificados em 2 grupos [1

st quartil; quartil mais baixo] vs. outros quartis [2

nd, 3

ª e 4

th quartis]). Abreviaturas: IHC, imuno-histoquímica; DPD, diidropirimidina desidrogenase.

testes qRT-PCR foram realizados com sucesso em 179 pacientes. Tal como em testes de IHC, um valor médio dos níveis de expressão dos genes individuais de ARNm foi definido como um valor de corte para os grupos. Entre os quatro genes, somente o nível de expressão de ARNm de DPD mostrou uma tendência de ter uma relação aos resultados DFS; pacientes com menor expressão de ARNm de DPD tinha DFS mais pobres do que aqueles com maior expressão DPD (P = 0,067; A Fig. 2 (B)). níveis dos TS, OPRT e genes TP expressão de mRNA não estavam relacionadas com DFS (Tabela 2). Em seguida, foram classificados os níveis de expressão de ARNm de DPD em quartis para investigar se existe uma relação dose-resposta entre os níveis de expressão do gene DPD e os resultados de sobrevivência. Curiosamente, apenas o grupo de pacientes no menor expressão quartil gene DPD mostrou inferior DFS para outros quartis, mas não foi observada nenhuma diferença nas taxas de DFS entre a 2

nd, 3

rd e 4

th quartis ( Fig. 2 (C)). Por isso, classificamos os pacientes em dois grupos que utilizam este valor de corte (1

st quartil [menor expressão do mRNA DPD] vs. outros quartis [mais elevada expressão de mRNA DPD incluindo o

nd, 3

rd 2, e 4

th quartis]) nas seguintes análises (Fig 2 (D.); Tabela 2)

Impacto dos níveis de enzimas que metabolizam fluoropirimidina expressão no resultado do tratamento:. análise multivariada

Entre as variáveis ​​clínicas, factores que apresentaram P 0,10 em análises univariadas para DFS (idade [ 60 anos vs. 60-69 anos vs. ≥ 70 anos, p = 0,003], método cirúrgico [laparoscópica vs. aberta; P = 0,082], invasão linfática [no vs. sim ; P = 0,068], invasão venosa [no vs. yes; P = 0,045], e estágio [IB /II vs. III; P = 0,012]; Tabela 1) foram incluídos na análise multivariada. Entre as proteínas ou genes relacionados com o metabolismo fluoropirimidina, aqueles com P 0,10 na análise univariada para DFS também foram incorporadas análises multivariadas (Tabela 2). Como mostrado na Tabela 3, baixo nível de expressão da proteína DPD (pontuação IHC 10; HR, 2,32; IC 95%, 1,08-4,96; P = 0,030) e baixa expressão do gene DPD (1

st quartil [quartil mais baixo] ; HR, 3,67; IC 95%, 1,67-8,03; P = 0,001) foram relacionados com pior DFS, independentemente de outras variáveis ​​clínicas. A idade avançada (≥ 70 anos) e maior etapa também foram associados de forma independente com a má DFS.

Relação entre nível de expressão DPD e tolerância ao S-1 terapia

A correlação positiva entre a DPD pontuação IHC e os níveis de expressão de mRNA foi observada (P = 0,022), embora os intervalos de pontuação IHC nos dois grupos (1

st quartil de expressão de mRNA DPD [DPD IHC pontuação: mediano, 0; gama, 0-200] vs. outros quartis [DPD IHC pontuação: média, 10; gama, 0-300]) sobrepostas em uma proporção considerável de casos (S2 FIG)

Não houve diferença na S-1 RDI ou frequência toxicidade (hematológica. foram observadas ou não hematológica) de S-1 de tratamento entre os pacientes com baixo ( pontuações DPD IHC [Tabela a na Tabela S2] 10) e alta (≥ 10). No entanto, em comparação com pacientes com níveis de mRNA DPD intratumorais mais elevadas (2

nd a 4

th quartis), os pacientes com os mais baixos níveis de mRNA DPD (1

st quartil) apresentaram uma tendência de desenvolvimento de não-hematológica grave toxicidades (≥ grau 3) mais frequentemente, embora estatisticamente insignificante (29% vs. 16%; P = 0,068); No entanto, a incidência do grau 3 ≥ toxicidade hematológica não foi diferente entre os dois grupos. Além disso, embora estatisticamente insignificante, a proporção de doentes que mantiveram S-1 IDI ≥ valor mediano (87,8%) durante a quimioterapia adjuvante foi menor nos pacientes no quartil mais baixo de expressão de ARNm de DPD do que em pacientes dentro de outras quartis (40% vs. 54%; P = 0,111;. Tabela B em S2 Table)

Discussão

neste estudo, nós exploramos a relação entre os níveis de expressão intratumoral de enzimas que metabolizam fluoropirimidina e os resultados de sobrevivência de adjuvante S quimioterapia -1. expressão alta DPD intratumoral não estava relacionado com os resultados de sobrevivência inferiores; em vez disso, a baixa expressão DPD foi associada com DFS desfavorável em pacientes tratados com GC adjuvante S-1therapy. Os níveis de outras enzimas de expressão não se correlacionou com DFS. No nosso estudo, os níveis de enzimas metabolizadoras de fluoropirimidina expressão foram avaliados através de dois métodos, nomeadamente IHC e de qRT-PCR.

DPD é a enzima inicial e limitante da velocidade no catabolismo de 5-FU. Vários estudos pré-clínicos demonstraram que o nível mais baixo de expressão do mRNA intratumoral DPD ou actividade está associada com uma melhor resposta a 5-FU e que um nível mais elevado em células tumorais DPD está relacionada com a resistência ao 5-FU [12-14]. Descobertas semelhantes foram também observados em pacientes com tumores sólidos, incluindo vários GC [14-22]. A eficácia da quimioterapia em pacientes fluoropirimidina GC tem sido mostrado para ser dependente dos níveis de expressão da DPP intratumorais, quer em paliativas [22], adjuvante [19-21], ou neoadjuvante [16-18] configurações.

Entre os três componentes, com S-1, gimeracilo é utilizado como um inibidor de DPD para manter as concentrações prolongados 5-FU em tecidos tumorais [23]. Embora alguns estudos relataram que a eficácia de S-1 também é afectada por níveis de expressão DPD intratumorais como outras fluoropirimidinas [24, 25], a maioria dos estudos demonstraram consistentemente que o efeito do S-1 a terapia não é influenciada pela DPD intratumoral Os níveis de expressão, especialmente em GC [8-10, 19, 26-29]. Estudos anteriores sugeriram que a S-1 é mais eficaz do que o 5-FU ou outros fluoropirimidinas em tumores com expressão elevada da DPD [19, 25, 28, 29]. A relação entre a eficácia da quimioterapia contendo o S-1 e os níveis de enzimas metabolizadoras de fluoropirimidina expressão tem sido investigada em GC [8-10]; No entanto, a maioria destes estudos incluíram pequenos números de pacientes e foram conduzidos em pacientes que receberam GC metastáticos vários regimes contendo o S-1-como tratamento paliativo. Portanto, os resultados anteriores não podem ser generalizados para pacientes GC que se submetem a cirurgia curativa e adjuvante S-1 quimioterapia

Em nosso estudo, o resultado do tratamento global de D2 gastrectomia seguido de adjuvante S-1 quimioterapia foi excelente.; 5 anos as taxas de DFS de doentes com estádio IB /II e III foram de 91% e 77%, respectivamente (Tabela 1). Entre as quatro enzimas analisadas (TS, DPD, OPRT e TP), apenas o nível de DPD expressão estava relacionada com o resultado do tratamento de S-1. proteína DPD ou mRNA superexpressão não se correlacionou com DFS inferior em pacientes GC receberam adjuvante terapia S-1; Esta observação é consistente com relatórios anteriores que S-1 é eficaz em tumores com alta DPD intratumoral [19, 25, 29, 30].

Curiosamente, em nossa coorte, baixa expressão DPD intratumoral foi relacionada a pior DFS, em comparação com a alta expressão de DPD. Esta observação foi inesperada e desconcertante, porque, até que finalizou a análise dos dados deste estudo, não tinha havido nenhum estudo sobre a associação entre enzimas e resultados do adjuvante S-1 quimioterapia em pacientes GC-metabolizando fluoropirimidina. No entanto, quase ao mesmo tempo em que relatou os resultados deste estudo em uma reunião acadêmica [31], um estudo com o quase mesmo projeto com o nosso foi relatado pelos investigadores ATOS-GC [32]. Nesse estudo, os investigadores ATOS-GC analisou a expressão intratumoral de 4 genes (TS, DPD, OPRT e TP) em pacientes inscritos no ACTS-GC e investigadas as suas possíveis funções como biomarcadores para os resultados do tratamento. Como nós, os investigadores ATOS-GC também sugeriu que a baixa expressão de mRNA DPD em tumores está relacionada com a DFS desfavorável; entre os pacientes do GC que tinham recebido quimioterapia adjuvante S-1 (N = 401), pacientes com baixa expressão de mRNA DPD intratumoral teve inferior 5 anos DFS (60,8% vs. 70,8%; P = 0,039) e OS (66,8% vs. 78,0 %; P = 0,015) do que aqueles com níveis de expressão elevada da DPD [32]. Portanto, os estudos, tanto do grupo ATOS-GC e os nossos investigadores chegou à inesperada mesmo resultado de coortes independentes de pacientes.

Como apenas os pacientes que receberam S-1 tratamento foram incluídos neste estudo, ainda é incerto se nível de expressão DPD intratumoral é um marcador preditivo ou prognóstico em pacientes GC receberam adjuvante terapia S-1. No entanto, como o ATOS-GC teve o grupo de pacientes que receberam a cirurgia por si só, sem quimioterapia adjuvante de controlo, os investigadores ATOS-GC mostrou que o benefício de adjuvante terapia de S-1 está principalmente confinada a pacientes GC com elevada expressão de ARNm de DPD intratumoral [ ,,,0],cirurgia seguida de adjuvante S 1-terapia versus cirurgia sozinha; HR no OS, 0,52 (IC 95%; 0,38-0,72)]; Em contraste, em doentes com baixa expressão DPD intratumoral, adjuvante S-1 terapia parecia ter menos benefício [cirurgia seguida de adjuvante S 1-terapia contra a cirurgia por si só; HR no OS, 0,85 (IC 95%; 0,56-1,28)] [32]. Portanto, considerando-se os resultados do estudo de ambos os investigadores ATOS-GC e nós, cautelosamente sugerem que a expressão do mRNA DPD intratumoral pode ser um biomarcador preditivo para a eficácia do adjuvante S-1 quimioterapia em pacientes GC após D2 gastrectomia. No entanto, a nossa sugestão precisa ser mais investigada em futuros estudos prospectivos.

Se o nível de expressão DPD intratumoral é um biomarcador preditivo de adjuvante S-1 quimioterapia em pacientes GC, as razões pelas quais a baixa expressão DPD intratumoral confere inferior DFS resultado em pacientes GC receberam adjuvante terapia S-1 vai exigir uma investigação mais aprofundada. Em primeiro lugar, embora os autores do grupo ATOS-GC não investigou a associação entre perfis de toxicidade ou RDI de S-1 e o nível de expressão DPD intratumoral [32], foram analisadas as diferenças de frequências de toxicidade e RDI de S-1 de acordo com intratumorais os níveis de expressão de DPD. Nós não conseguimos encontrar quaisquer diferenças de toxicidade e RDI entre pacientes DPD-alto e DPD-baixas de pontuação IHC. No entanto, embora estatisticamente insignificante, pacientes com os mais baixos níveis de mRNA DPD intratumorais (1

st quartil) mostrou uma tendência de mais não-hematológica toxicidades de ≥ grau 3 (29% vs. 16%; P = 0,068) e parecia têm menor tolerância ao S-1 do que os pacientes com níveis de mRNA DPD mais elevadas (S2 tabela). Num estudo anterior [5], que relataram que RDI de S-1 está relacionado com o DFS de pacientes GC receberam adjuvante terapia de S-1 e que a causa mais frequente de redução da dose de S-1 foi enterocolite, uma das mais comuns toxicidades não hematológicas desenvolvidos durante a terapia adjuvante S-1. Embora se os níveis de expressão de DPD correlacionar entre as células tumorais e as células normais do hospedeiro permanece desconhecida, Bertino et ai. [15] relataram que a baixa expressão DPD intratumoral pode estar associada com o aumento da toxicidade da capecitabina em pacientes com câncer de pulmão. Cui et al. [33] relataram que o nível de expressão da DPP soro é associado com o desenvolvimento da toxicidade da quimioterapia baseada em S-1 em pacientes GC metastáticas. Tomados em conjunto, temos a hipótese de que os níveis de expressão DPD intratumorais pode refletir níveis globais DPD em tecidos hospedeiros normais, indicando que a baixa expressão DPD intratumoral pode estar relacionado a um desenvolvimento mais frequente de S-1 toxicidades e pode diminuir a tolerância paciente a S-1. Esta hipótese pode explicar o DFS inferior em pacientes com baixa expressão DPD intratumoral, em comparação com pacientes com alta expressão de DPD, ao receber adjuvante S-1 quimioterapia. Em segundo lugar, alta intratumoral DPD

per se

pode conferir mais sensibilidade ao S-1 de baixo DPD intratumoral em pacientes GC. Shimizu et al. informou que a taxa de resposta foi significativamente maior em pacientes com carcinoma cirrosos gástrico metastático com tumores DPD-positivo do que naqueles com tumores DPD-negativos quando tratados com quimioterapia à base de S-1 [29]. Todas as sugestões acima são gerador de hipóteses, e mais estudos são necessários.

Além disso, mais aspectos precisam ser mais bem investigado. deve ser conduzida a padronização dos métodos de qRT-PCR e a otimização de um ponto de corte para níveis de mRNA DPD em amostras tumorais FFPE. Os investigadores do grupo ATOS-GC utilizado o menor tercil de níveis de mRNA intratumorais DPD como um ponto de corte [32]. Em nosso estudo, o quartil mais baixo foi usado como um cut-off. Quando realizamos mais análises usando o tercil mais baixo dos níveis de DPD intratumorais como um cut-off, o impacto dos níveis de expressão DPD na previsão DFS ainda era válida no univariada (S3 Fig) e multivariada (S3 tabela). O ponto de corte mais adequado dos níveis de expressão de mRNA intratumorais DPD para prever os resultados do tratamento de adjuvante terapia S-1 precisa ser validado em estudos futuros. Além disso, intratumorais níveis de expressão de proteína DPD medidos por dezenas de IHC (intensidade de coloração multiplicado pela percentagem de área manchada) também foram relacionados a diferentes resultados do tratamento em nosso estudo. No entanto, no estudo pelo grupo ATOS-GC, em que os níveis de expressão de proteína foram medidos através de coloração apenas a intensidade, os autores não poderia encontrar qualquer associação entre os resultados IHC e os resultados do tratamento [32]. Além disso, os investigadores ATOS-GC relatado que os níveis de expressão de mRNA intratumorais TS foram também preditivo da eficácia do adjuvante S-1 quimioterapia. No entanto, em nosso estudo, os níveis de TS-se foi medido por IHC ou qRT-PCR-não estavam relacionadas com os resultados de sobrevivência de adjuvante terapia S-1 expressão. Portanto, estas diferentes observações entre os investigadores ATOS-GC e nós (a utilidade dos níveis de expressão de proteína intratumorais DPD medida pelos níveis de expressão de mRNA IHC e TS em predizer os resultados do tratamento) precisa ser mais investigada no futuro.

em conclusão, ao receber adjuvante terapia S-1, os pacientes do GC com alta expressão DPD intratumoral não teve resultado inferior àqueles com baixa expressão DPD. Em vez disso, a baixa mRNA ou proteína expressão de DPD foi relacionada à má DFS. A administração de doses mais baixas de S-1 devido a toxicidades poderia ter levado a este resultado do tratamento inferior inesperada em pacientes com baixos níveis de DPD. Os níveis de expressão de outras enzimas que metabolizam fluoropirimidina (TS, OPRT e TP) não estavam relacionados com os resultados de sobrevivência de tratamento adjuvante S-1. Futuros grandes estudos prospectivos sobre biomarcadores preditivos da eficácia do tratamento adjuvante S-1 são justificadas.

Informações de Apoio

S1 Fig. Os resultados de sobrevivência de acordo com as fases: (a) de sobrevida livre de doença e (b) a sobrevida global

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120324.s001

(DOCX)

S2 Fig. Distribuição das pontuações (A) IHC de DPD e os níveis de DPD (B) de expressão de mRNA

(C) A correlação entre a pontuação IHC e os níveis de expressão de mRNA de DPD

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0120324. S002

(DOCX)

S3 Fig. As curvas de sobrevida livre de doença de acordo com os níveis de expressão de mRNA intratumorais de DPD (quando os pacientes são classificados em tercis)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120324.s003

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S1 Table. Toxicidades desenvolvidas durante S-1 quimioterapia (por paciente)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120324.s004

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S2 Table. A comparação da distribuição de S-1 e toxicidades desenvolvidos entre grupos intratumoral DPD-baixa e DPD de alta expressão [(A) por dezenas de IHC e (B) por níveis de expressão de mRNA]

doi:. 10.1371 /journal.pone .0120324.s005

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S3 Tabela. . Impacto das intratumorais níveis de expressão de mRNA DPD na sobrevida livre de doença

Os níveis de expressão de mRNA DPD foram divididos em 3 grupos (tercis)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120324.s006

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Reconhecimentos

Este artigo foi apresentado, em parte, como uma apresentação de pôster na de 2014 ESMO (European Society for Medical Oncology) Congresso, Madrid, Espanha (26-30 setembro 2014).