Abstract

Rho GTPases são reguladores chave da invasão das células tumorais e, portanto, constituem alvos atraentes para a concepção de agentes anti-cancro. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para modular o aumento das suas atividades durante a progressão do câncer. Curiosamente, nenhuma destas abordagens teve em conta a existência de um relacionamento antagonista bem conhecido entre RhoA e Rac1. No presente estudo, nós primeira comparou o invasividade de um conjunto de linhas celulares de cancro colorrectal com as suas actividades de RhoA, Rac1 e Cdc42. Uma diminuição marcada de Cdc42 e Rac1 activo correlacionada com o elevado potencial invasivo das linhas de células estabelecidas a partir de metástases de adenocarcinoma colo-rectal (LoVo, SKCo1, SW620 e COLO205). Por outro lado, não foi detectada nenhuma correlação entre a actividade de RhoA e invasividade, enquanto que a actividade da sua ROCHA quinase efector foi mais elevada em linhas celulares de cancro com um fenótipo mais invasiva. Além disso, a capacidade de invasão nestas linhas celulares de cancro de cólon foi correlacionada com uma rodada e morfologia típicas formação de bolhas. Em seguida, testou-se se o tratamento com PDGF para restaurar actividades Cdc42 e Rac1 e /ou com Y27632, um inibidor químico de rocha, poderia diminuir a capacidade de invasão de células SW620. A associação dos dois tratamentos diminuiu substancialmente o potencial invasivo de células SW620 e este efeito foi acompanhado por uma perda de formação de bolhas de membrana, a restauração de uma morfologia celular alongada e mais re-estabelecimento de junções aderentes de E-caderina-dependente. Este estudo abre caminho para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas em que diferentes moduladores Rho GTPase são combinados para modular o cross-talk entre GTPases Rho eo seu contributo específico na progressão metastática

Citation:. De Toledo M, Anguille C , Roger L, Roux P, Gadea G (2012) Efeito Cooperativa Anti-Invasive de Cdc42 /Rac1 activação e ROCHA inibição em células SW620 câncer colorretal com níveis elevados de formação de bolhas de atividades. PLoS ONE 7 (11): e48344. doi: 10.1371 /journal.pone.0048344

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de maio de 2012; Aceito: 24 de setembro de 2012; Publicação: 07 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 de Toledo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pela Ligue Nationale contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la Recherche contre le Cancer (contrat 17029), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, e Le Centre national de la recherche scientifique. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

GTPases Rho são essenciais para muitas funções celulares, incluindo transporte de membrana, a activação da transcrição, a apoptose, a progressão do ciclo celular, da polaridade celular, adesão e migração [1], [2], [3], [4]. Na verdade a sua desregulamentação tem consequências importantes em muitos processos fisiopatológicos [5]. Em particular, as GTPases Rho são reguladores cruciais da progressão do cancro através da modulação da proliferação celular, apoptose, invasão e formação de metástases [6].

O papel de três Rho GTPases na migração bi-dimensional tem sido bem caracterizado. Rac1 impulsiona motilidade, promovendo a formação de saliências e lamellipodium celular [7]. sinalização RhoA activa a família de quinases ROCHA, promovendo a formação de fibras de stress de actina e a geração de força contráctil actomiosina que é necessário para a retracção da parte traseira na célula-tipo mesenquimais movimento [8], [9]. Cdc42 é ativado na vanguarda da lamellipodia e é necessário para a montagem Arp2 /3 dependente de actina [10]. Além disso, a existência de uma relação entre o antagonista e Rac1 RhoA explica o movimento polarizada durante a migração celular dirigida. Curiosamente, estas duas proteínas suprime cada outras atividades e fenótipos [11], [12], [13]. Especificamente, as atividades RhoA e Rac1 são espacialmente e temporalmente controlada para promover mudanças do citoesqueleto dinâmicas durante a migração. actividade Rac1 está limitado ao bordo de ataque para estender as saliências na parte da frente, enquanto que impulsiona RhoA contracção na parte traseira da célula de migração. RhoA e Rac1 efeitos localizados são presumivelmente impulsionado por mecanismos regulatórios específicos. Com efeito, Wildenberg e colegas demonstraram que Rac1-dependente a sub-regulação de actividade de RhoA é controlada pela integridade adherens junção [14].

No entanto, os mecanismos que medeiam a motilidade de células tumorais são diferentes em matrizes tridimensionais mais complexos . Neste contexto, algumas células tumorais adoptar uma forma amebóide de movimento [15], [16], que é caracterizado por uma configuração arredondada, a morfologia das células de vesículas, a independência de proteases extracelulares e o requisito de níveis elevados de actomiosina contractilidade a jusante da RhoA-ROCK via para deformar o movimento extracelular célula da matriz e unidade [17], [18], [19], [20]. Estudos utilizando microscopia intravital têm mostrado que o movimento ameboide de células tumorais pode ser muito rápida in vivo (~ 5 uM /min [21]). Por outro lado, o movimento de tipo mesenquimal é caracterizada por uma morfologia alongada, resultante da montagem Actina Rac1-dependente no bordo de ataque. Estes dois modos de movimento são inter-convertíveis e células de tumor podem sofrer amebóide-mesenquimal e transições mesenquimais-amebóide [15], [18], [20] que parece ser controlada por um antagonismo entre as vias de sinalização Rac1 e RhoA. A descoberta de proteínas Rac1 GTPase-activação regulada-rock (GAPs) ajudou a compreender como a via de RhoA /ROCK pode suprimir Rac1 mediada por polimerização de actina [14], [22], [23]. Em qualquer caso, esta plasticidade pode permitir que as células para adaptar o seu modo de migração para os diferentes ambientes e, portanto, pode ser benéfico para células tumorais.

Para além da regulação apertada espaço-temporal dos diferentes GTPases Rho, também o actividade dos seus parceiros a montante ea jusante é rigorosamente controlada. Na verdade, os efeitos Rho GTPase no comportamento de células pode ser modulada também através de interações específicas com os reguladores (por exemplo, Guanina factores de câmbio de nucleotídeos, GEFs) para regular os processos aparentemente incompatíveis. Por exemplo, DOCK10, um Cdc42 GEF, é um jogador fundamental na migração amebóides através de uma via de sinalização DOCK10-Cdc42-PAK2. Por conseguinte, a expressão de Cdc42 activada induz uma transição mesenquimal-amebóide. No entanto, a inibição de Cdc42 resulta em perda de morfologia mesenquimal, sugerindo que Cdc42 também desempenha um papel na morfologia do tipo mesenquimais através de diferentes percursos que pode implicar outros GEFs [24]. Além disso, em modelos de cultura bidimensionais, RhoA activada é não só na cauda contráctil, mas também ao bordo de ataque. De fato, a atividade RhoA continua alto, em babados de membrana em lamellipodia nascente [25]. Estas observações sugerem que RhoA está implicada na regulação da membrana ruffling Rac1-dependente. Na verdade, RhoA coopera com Rac1 para induzir babados membrana através do recrutamento de sua MDIA efetoras específico. Tomados em conjunto, estes dados indicam claramente que a conversa cruzada entre estes GTPases Rho exclui a hipótese de que cada um deles é responsável por apenas um modo de migração. GTPases

Rho regular também a organização de actina do citoesqueleto e adesão celular. E-caderina, uma glicoproteína do vão trans-membrana, estabelece interacções homofílicas com moléculas de caderina-E adjacentes que são expressas por células vizinhas, formando assim o núcleo das junções aderentes epiteliais [26], [27]. Através de suas citoplasmática de domínio, E-caderina associa a um número de proteínas, incluindo três Cateninas (alfa, beta, e p120), que ligam E-caderina ao citoesqueleto de actina. O complexo E-caderina-catenina e o citoesqueleto de actina subjacente sofrem uma série de reorganizações que são controlados pela Rho GTPases RhoA e Rac1 e que resultam na expansão e conclusão de adesão célula-célula. Em virtude do seu papel na manutenção de junções aderentes e sua ligação estreita com GTPases Rho, a perda de E-caderina pode promover metástases, permitindo que o primeiro passo da cascata metastática: a perda de contactos célula-célula. De facto, diminuiu a expressão da E-caderina tem sido associada invasividade do tumor com, disseminação metastática e mau prognóstico clínico [28], [29], [30].

Portanto, GTPases Rho parece ser atraente alvos para a terapia do cancro . Várias estratégias têm sido desenvolvidas para neutralizar Rho GTPase sinalização desregulamentação durante tumorigênese, como segmentação direta das atividades Rho GTPase [31], [32], ou inibição de efectores a jusante, como o rock, com resultados promissores na prevenção da invasão

in vivo

[33]. Uma estratégia alternativa consiste em alvejar reguladores de Rho GTPase estado ativo, como GEFs, lacunas e inibidores de dissociação nucleótido guanina (Góis) [32] [34]. Embora os inibidores Rho GTPase ainda não foram amplamente adotado para uso clínico, o seu valor potencial como drogas anticâncer ainda dirige a investigação farmacêutica considerável e desenvolvimento [35]. No entanto, o cross-talk entre GTPases Rho e sua dualidade funcional, que é uma característica fundamental da sua regulamentação, nunca foram considerados por essas estratégias de segmentação.

Neste estudo, primeiro comparou a invasão de uma coleção de linhas celulares de cancro colorrectal com as suas actividades de RhoA, Rac1 e Cdc42. Nós relatamos que o elevado potencial invasivo de células de câncer colorretal com a atividade blebbing elevada se correlaciona com tanto maior ativação ROCK e diminuiu atividades Cdc42 e Rac1. O tratamento combinado com PDGF para restaurar a função Cdc42 e Rac1 e com Y27632 sinergicamente para inibir ROCHA reduziu o potencial invasivo de tais células de cancro colorrectal. Este fornece novas pistas para o desenvolvimento de agentes anticancerígenos que podem combinar inibição simultânea de rocha e re-ativação de Cdc42 e Rac1 a agir em ambas as vias específicas e comuns.

Resultados

O nível de Cdc42 ativo e Rac1, mas não da RhoA, é diminuída em linhas de células colorretal altamente invasivos

a transição para um fenótipo altamente móveis é uma característica das células cancerosas invasivas e uma indicação de que um tumor pode metástase. Para classificar o seu potencial invasivo, comparou-se a capacidade de um conjunto de linhas celulares de cancro colorrectal para invadir Matrigel, uma matriz tri-dimensional que se assemelha a membrana basal e imita o meio extracelular complexo encontrada em muitos tecidos. Nós, portanto, avaliou a capacidade de invasão de duas linhas normais de células do cólon (FHC e con), da linha de células de carcinoma HCT-116 do cólon, das linhas celulares Caco2, LS174T, SW480, HT29 e WiDr que foram derivadas de adenocarcinomas colorretais e de quatro células linhas (LoVo, SKCo1, SW620 e Colo205) estabelecido a partir de sítios metastáticos de adenocarcinoma colorretal. As quatro linhas celulares emitidos a partir de sítios metastáticos apresentou maior capacidade de invadir Matrigel, indicando que estas células têm mantido a sua capacidade de invadir mesmo depois que eles chegaram ao seu site secundário (Figura 1a)

.

(a) Os resultados do ensaio de invasão de Matrigel para as diferentes linhas de células de cancro do cólon. As células que tinham invadido por meio de Matrigel foram detectados no lado inferior do filtro por fluorescência e contadas como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de pelo menos três experiências independentes. (B) As células foram lisadas e o nível de GTP Cdc42-ligado foi medida como descrito em Materiais e Métodos. Cdc42-GTP precipitado com GST-PAK1 e Cdc42 total nos lisados ​​foram detectados por imunotransf erência com um anticorpo anti-Cdc42. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de pelo menos três experiências independentes. (C) As células foram lisadas e o nível de Rac1 GTP-ligado foi medida como descrito em Materiais e Métodos. Rac1-GTP precipitado com GST-PAK1 e Rac1 total nos lisados ​​foram detectados por imunotransf erência com um anticorpo anti-Rac1. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de pelo menos três experiências independentes. (D) As células foram lisadas e o nível de RhoA-GTP ligado foi medida como descrito em Materiais e Métodos. RhoA-GTP precipitado com GST-RBD e RhoA total nos lisados ​​foram determinados por immunoblotting com um anticorpo anti-RhoA. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de pelo menos três experiências independentes.

Em seguida, avaliou se de invasão e o nível de GTPases Rho ativos, que são os principais componentes da máquina invasiva, foram correlacionados através da comparação do nível de GTP-bound Cdc42, RhoA e Rac1 nas diferentes linhas celulares de cancro colorrectal. Uma diminuição marcada na Cdc42 e Rac1 activo foi observada nas linhas mais invasivos de células de cancro colorectal (Figura 1B e 1C). Por outro lado, o nível de RhoA GTP-bound não se correlacionou com capacidade de invasão celular. Em particular, uma actividade de RhoA forte foi observada em células HCT-116, que foram caracterizados por baixa capacidade de invadir Matrigel (Figura 1D). As variações no nível de GTPases activos nas diferentes linhas celulares não foram devidos a uma diferença na sua expressão da proteína como este foi quase equivalente em todas as linhas celulares (não mostrado). Conclui-se que, nas linhas celulares de cancro colo-rectal testadas, o nível de Cdc42 e Rac1 activa, mas não da RhoA, está inversamente correlacionada com a capacidade invasiva de células (tais respectivos

valores de p: 0,0008, 0,0003 e 0,134 ).

cofilina fosforilação aumenta com a capacidade de invasão das diferentes linhas celulares de cancro colorrectal

a verificação de que a actividade de RhoA não estava relacionada com a capacidade de invasão das diferentes linhas de células de cancro do cólon não está de acordo com o envolvimento frequente da via RhoA na invasão das células tumorais, nomeadamente através da activação do seu ROCHA efetoras quinase. Nós portanto testado a hipótese de que, em estas linhas de células, o nível de activação de rocha não pode espelhar o nível de RhoA-GTP ligado. Para este objectivo, avaliamos a ativação ROCHA nas linhas celulares de cancro colorrectal estudadas pela quantificação do estado de fosforilação do substrato ROCHA cofilina, que controla a formação de feixes orientados actomiosina II no corpo celular [36]. Cofilina fosforilada foi detectada por imunotransferência com anticorpos específicos anti-cofilina fosforilados e a sua expressão foi normalizada para que de um total de cofilina (Figura 2a). Cofilina foi fracamente fosforilada na linha con célula normal do cólon, bem como nas linhas pouco invasivos de células HCT-116 e SW480 em comparação com as mais altamente invasivo linhas de células LoVo, SW620, Colo205 e SKCo-1, em que fosforilada cofilina foi muito abundante. Estes resultados sugerem que o nível de rocha activa, mas não da RhoA activa, está associada com capacidade de invasão de células de cancro do cólon.

As células foram lisadas e a quantidade de cofilina fosforilada e do total cofilina presente nos lisados ​​foi analisada por imunotransferência. (A) immunoblot Representante. (B) Quantificação da cofilina fosforilação. Os histogramas representam as proporções do sinal de fosfo-cofilina sobre o sinal total cofilina. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de três experimentos independentes.

restauração combinada de atividades e inibição da formação de bolhas celular diminuição ROCHA Cdc42 e Rac1 e induzir o alongamento das células

-dependente ROCHA contratilidade actomiosina é fundamental para a morfologia celular. Alta atividade ROCHA também pode induzir a formação de bolhas de membrana dinâmica. Para verificar se a ativação ROCHA nas diferentes linhas de células colorretal foi correlacionada com a morfologia das células, nós monitorados células usando microscopia de lapso de tempo de contraste de interferência diferencial. Enquanto que as células SW480 HCT-116 e manteve algumas características epiteliais (forma alongada, contatos célula-célula), SW620 células eram esféricas e exibiu intensa atividade blebbing periférica (Figura 3a, painéis superiores: ainda fotografias a partir de vídeos S1, S2, S3, S4, S5 e S6), de acordo com a contractilidade actomiosina elevada devido à sua actividade ROCHA muito mais elevado em comparação com as outras duas linhas de células (ver Figura 2b). Para testar se a diminuição observada em Cdc42 e Rac1 e aumento na atividade ROCHA foram ambos envolvidos na progressão tumoral para estágios mais avançados, nós tratamos estas linhas celulares de cancro três cólon com PDGF para reativar Cdc42 e Rac1 e /ou com Y27632 para o bloco ROCHA. PDGF combinado e Y27632 tratamento resultou na aquisição de um fenótipo mais do epitélio com células alongadas, em particular na linha celular SW620 (Figura 3A, painéis inferiores). Com efeito, estas células, que foram redondo e com formação de bolhas de membrana elevada no início do tratamento combinado, parou vesiculação e achatada (Figura 3B e vídeo S7). A quantificação do número de células alongadas seguindo os diferentes tratamentos claramente demonstrado que a restauração combinada das actividades de inibição e de rocha Cdc42 e Rac1 teve um efeito aditivo (Figura 3c). Para monitorizar a activação do PDGF-dependente de Cdc42 e Rac1 nas três linhas de células, foi medido o nível de GTP-bound Cdc42 e Rac1 (Figura 3D e e). PDGF não afetou fortemente a quantidade de GTP-bound Cdc42 e Rac1 em células HCT-116 e SW480, enquanto que aumentou claramente em células SW620. Além disso, nós também verificado Y27632 efeito sobre a miosina Cadeia leve 2 (MLC2) fosforilação, como uma leitura da contratilidade dependente-ROCK e descobriu que fosforilada MLC2 foi diminuída em Y27632-tratados SW620 células (Figura 3F). Em conjunto, estes dados sugerem que o tratamento combinado com PDGF e Y27632 para restaurar a atividade Cdc42 e Rac1 e inibir ROCHA pode converter, células blebbing SW620 invasivos para um fenótipo mais epitelial.

(A) Ainda DIC imagens de lapso de tempo de células tratadas ou não (controle) com PDGF e Y27632 (a partir de vídeos S1, S2, S3, S4, S5 e S6). Caixilharia mostrar a mudança na morfologia (de volta para uma forma mais alongada) das células no início dos filmes. As barras de escala, 10 | im. (B) imagens de lapso de tempo DIC de SW620 células antes e depois do tratamento com PDGF + Y27632 (de vídeo S7). Caixilharia mostrar a mudança na morfologia celular nos tempos indicados. As barras de escala, 10 | im. (B) Quantificação do alongamento celular. Uma célula foi considerado alongada quando a sua dimensão mais longa foi de duas vezes a mais curta e, quando se mostrou pelo menos uma protrusão [23]. Os histogramas representam a percentagem de células SW620 alongadas seguinte tratamento ou não (controlo) com PDGF e /ou Y27632 durante 24 horas. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de três experiências independentes e a significância estatística foi calculada usando o teste-t não emparelhado. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. actividade (d) Cdc42 foi determinado após o tratamento ou não (controlo) com PDGF, durante 24 horas, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de quatro experiências independentes e a significância estatística foi calculada usando o teste-t não emparelhado. * P 0,05. actividade (e) Rac1 foi determinado tratamento ou não seguinte (controlo) com PDGF, durante 24 horas, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de quatro experiências independentes e a significância estatística foi calculada usando o teste-t não emparelhado. * P 0,05. (F) as células SW620 foram lisadas e a quantidade de fosforilada Miosina Cadeia leve 2 (MLC2) e do total MLC2 presente nos lisados ​​foi determinada por imunotransf erência em diferentes pontos de tempo (0 a 30 minutos) após o tratamento com 10 uM Y27632. É mostrado um immunoblot representativa.

restauração combinada de atividade Cdc42 e Rac1 e inibição da ROCHA re-localizar a E-caderina às junções celulares

Após tratamento combinado com PDGF e Y27632, células SW620 parecia ter junções aderentes restaurados (Figura 3A). A fim de esclarecer este ponto, avaliamos a expressão de E-caderina por imuno-coloração no controle e células tratadas (Figura 4A). Considerando que quase não há alterações na expressão de E-caderina foi observada em células SW480 e HCT-116, a forte coloração de E-caderina nas células SW620 indicaram claramente que os contactos célula-célula foram re-estabelecida após tratamento com PDGF e Y27632. Quantificação de junções aderentes de células SW620 confirmou o efeito sinergístico de PDGF e Y27632.

(A) coloração representativas E-caderina nas células de cancro do cólon ou não tratada (controlo) com PDGF e Y27632 durante 24 horas. As barras de escala, 10 | im. (B) Quantificação de junções de E-caderina. Nós classificado como positivo cada célula que mostra, pelo menos, uma junção de E-caderina com uma ou mais células vizinhas. Os histogramas representam a percentagem de células cancerígenas do cólon SW620 com junções de E-caderina ou a seguir ao tratamento não com PDGF e /ou Y27632 durante 24 horas. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de três experiências independentes e a significância estatística foi calculada usando o teste-t não emparelhado. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001

restauração Combinada da atividade Cdc42 e Rac1 e inibição da ROCHA prejudicar SW620 propriedades invasivas

Como combinado PDGF e Y27632 tratamento conduziu ao re-estabelecimento de junções aderentes na linha celular SW620 invasiva, que, em seguida, testados directamente o efeito de PDGF e Y27632 tratamento na invasividade destas células em ensaios de invasão de Matrigel. Mais uma vez, a associação de PDGF e Y27632 foi mais eficaz do que os tratamentos individuais na inibição das propriedades invasivas das células SW620 (Figura 5). PDGF e Y27632 teve quase nenhum efeito sobre HCT-116 e invasividade SW480 (dados não mostrados). Em conjunto, os nossos dados sugerem que o comportamento invasivo da linha celular de cancro do cólon metastático SW620 pode ser diminuída dramaticamente com a utilização combinada de PDGF e Y27632 que leva a Amoeboid a epiteliais de transição e re-estabelecimento de junções aderentes e-dependente-caderina.

A capacidade de invasão de células cancerígenas do cólon SW620 após o tratamento ou não (controlo) com PDGF e /ou Y27632 foi quantificada usando ensaios de invasão de Matrigel, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são a média +/- SD (barras de erro) de pelo menos três experiências independentes e a significância estatística foi calculada usando o teste-t não emparelhado. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001, ns não significativo

Discussão

Neste estudo, foi investigada a possível relação entre a capacidade de invasão e o nível de actividade dos principais Rho GTPases em um conjunto de linhas celulares de cancro colorrectal. Mostra-se que a capacidade para invadir uma destas linhas celulares de cancro colorrectal é correlacionada com uma diminuição acentuada na Cdc42 e Rac1 actividade e um aumento em Rock, mas não RhoA, actividade. Como este fenótipo molecular foi associada com uma rodada, morfologia celular formação de bolhas que, em seguida, perguntou se a morfologia epitelial normal poderia ser restaurada através da inibição da rocha com Y27632 e reativando Cdc42 e Rac1 com PDGF. De facto, na linha de células SW620 invasivo, o tratamento combinado com PDGF e Y27632 blebbing preso e células adquiriram uma morfologia achatada e mais propagação. Sob estas condições, também adherens junções foram restauradas, como indicado pela aparência de re-expressão de E-caderina em contactos célula-célula. Esta conversão morfológica foi associada a uma forte redução da sua capacidade de invadir através de Matrigel. É altamente provável que estas características (contatos célula-célula /morfologia e invasão) estão diretamente ligados.

Nossos dados indicam que uma forte diminuição da actividade Cdc42 e Rac1 está claramente associada ao aumento da capacidade de invasão do cancro do cólon. Esses achados corroboram os obtidos em outras linhas de células epiteliais. Em Madin Darby células epiteliais de rim canino (MDCK), activação de Cdc42 e Rac1 tem sido implicada na formação de junções aderentes [37]. Além disso, as formas activadas constitutivamente de Cdc42 e Rac1 pode prevenir o Factor de Crescimento de hepatócitos (HGF) espalhamento celular induzida pelo aumento da adesão célula-célula mediada por E-caderina [37]. Os nossos resultados estendem estas observações para células de carcinoma do cólon humano. Especificamente, na restauração dos níveis de GTP Cdc42 e Rac1 ligado por tratamento PDGF, vesiculação actividade celular SW620 foi fortemente suprimida e células espalhar com a formação de filopodia e lamelas. Além disso, pode-se constatar que a expressão de Cdc42 constitutivamente activa ou inibe Rac1 SW620 propriedades invasivas (dados não mostrados). Além disso, PDGF também favoreceu o E-cadherin- restabelecimento dependente de junções aderentes. Outros estudos têm mostrado que a activação dos resultados Rac1 na adesão célula-célula mediada por E-caderina e, subsequentemente, a inibição da migração e invasão de células epiteliais [38] [39] [40] [41]. Pelo contrário, em tumores hepáticos, o PDGF está envolvido na manutenção da EMT [42]. Além disso, Cdc42 e Rac1 também pode desempenhar um papel-chave na migração celular e invasão por meio da formação de filopodia e lamelip�ios. Deste modo, o controlo do contacto célula-célula para manter as células como um epitélio coesa e regulação da migração celular para favorece invasão pode ser considerado como dois efeitos antagonistas de Cdc42 e Rac1 na progressão tumoral. No nosso estudo, o tratamento de PDGF restaurado contactos célula-célula dependente de E-caderina-, mas não foi suficiente para prevenir a invasão, quando utilizado sozinho. De facto, o PDGF necessário para ser combinada com a inibição ROCHA para exibir um efeito forte, aditivo na invasividade. Os nossos resultados indicam, assim, que cada via exibe características independentes e que a inibição da invasão pode ser prevista através da manipulação eficaz de ambas as vias. No entanto, estes resultados estão associados com o modo amebóide de migração da linha de células SW620 usado neste estudo. Como as células cancerosas podem invadir utilizando diferentes modos de migração, não se sabe se esta estratégia modulador pode ser aplicada a outros tipos de invasão de células de cancro.

Rock, também desempenha um papel central na inibição de RhoA-dependentes de Rac1 [22], [23], [43], [44], [45]. Avanços recentes identificaram FilGAP, uma proteína de ligação a filamina dotado com uma função de Rho GTPase-activating Rac1-specfic, como um mediador fundamental da inibição induzida por ROCHA de Rac1. Após a fosforilação pela rocha, a actividade de RacGAP FilGAP é estimulada e, como consequência, FilGAP induz a formação de vesícula e suprime a propagação de células e formação de ponta, que são características de inibição de actividade Rac1 [22]. Além disso, a sinalização ROCHA também activa ARHGAP22 (RacGAP outro) que, por sua vez, inibe a activação Rac1 para evitar a supressão do movimento dependente da formação de bolhas (amebóide?) [23]. No entanto, RhoA também pode mediar a activação e a subsequente formação Rac1 lamelip�ios através do recrutamento de MDIA, que está associada com plissados ​​de membranas [43], [46]. Considerando este duplo papel, a ausência de correlação entre a activação RhoA e invasão celular relatamos aqui não é surpreendente. actividade para rocha é mais susceptível de ser associada a invasividade, enquanto a influência da RhoA oscila entre MDIA e activação ROCHA, dependendo do tipo de célula. Por conseguinte, os efeitos da exoenzima C3, um inibidor de Rho, e Y27632 de, um inibidor de ROCK, são muito diferentes. Em células LPA-estimuladas Swiss 3T3, Y27632, mas não C3, o tratamento aumento da atividade Rac1 e induziu a formação de plissado membrana [43].

Finalmente, uma das principais conclusões do nosso estudo é que ROCK, mas não RhoA , a actividade está relacionada com a capacidade de invasão na nossa colecção de linhas de células de cancro do cólon. Isto levanta a questão da via (s) de sinalização que ativa seletivamente ROCHA nas linhas celulares mais invasivos. Podemos especular que outros ativadores ROCHA pode aliviar a atividade RhoA na sua ausência. Por exemplo, RhoC, que promove principalmente invasão [47], [48], [49], [50], [51], estimula e interage com a rocha mais fortemente do que RhoA [52]. De acordo com isto, a expressão e a activação RhoC coincidir com EMT de células de cancro colorrectal que está associado com o aumento da agressividade durante a tumorigénese [53]. Tomados em conjunto estes dados sugerem que a Rho GTPases pode funcionar em um compensatória, mas distinta, a maneira [54]. No entanto, o nosso conhecimento sobre o envolvimento de Rho GTPases na invasão câncer é fortemente dependente da sobre-expressão de formas constitutivamente activados. Isso pode perturbar o equilíbrio natural dos reguladores e efetores Rho GTPase. Por exemplo, exposição de células a níveis elevados de RhoA activa deve favorecer a sinalização através da rocha, enquanto que os baixos níveis de RhoA promover a sinalização através MDIA [52]. Portanto, a sobre-expressão de uma forma constitutivamente activada do RhoA vai promover a capacidade invasiva dependente da ROCK e pode obscurecer a via antagonista MDIA. Além disso, o acúmulo de evidências indica que a GTPase sinalização resultado depende não só sobre os efetores, mas também sobre as GEFs que irão conduzir as GTPases e os efetores nas proximidades, criando micro-áreas com altas concentrações locais de efetores [55] [56] . Como consequência, a actividade de RhoA não podem totalmente explicar a activação ROCHA. Além disso, a atividade RhoA bruto também pode não ser totalmente indicativo de que via de sinalização (ou seja, GEFs e processadores de efeitos associados) está envolvida.

Em conclusão, nosso trabalho fornece insights importantes sobre como impactos de ativação GTPases Rho no tumor colorectal progressão e mais precisamente sobre a capacidade de invasão de células colorrectais blebbing. Nossa conclusão central é a interação entre o rock e as actividades Cdc42 e Rac1. Estas vias de sinalização têm efeitos opostos sobre a invasão e suas flutuações são parcialmente mutuamente relacionados, embora nossos dados também sugerem a existência de contribuições intrínsecas independentes. Isso teria consequências importantes sobre as estratégias para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer. Analisando-se apenas os níveis de expressão elevadas globais de GTPases Rho no cancro pode conduzir a desvantagens terapêuticos, se os seus efeitos opostos não são tidos em conta. Na verdade, a concepção altamente seletivo Rho GTPase sinalização moduladores e combinando seus efeitos podem oferecer maiores oportunidades terapêuticas.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

As linhas de células de cólon normais FHC , con e as linhas celulares de cancro colo-rectal HCT116, Caco2, LS174T, SW480, HT29, WiDr, LoVo, SKCo1, SW620 e Colo205 foram adquiridas a partir da ATCC e foram cultivadas como recomendado. As células foram tratadas com 40 ng /mL de PDGF-BB (Upstate) e 10 uM Y27632 (Calbiochem). Os lisados ​​de proteína foram obtidas por breve sonicação de células tratadas em 2 × tampão de Laemmli.