Abstract

epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT), a mudança fenotípica de a partir de células epiteliais de um para um tipo mesenquimal, é pensado para ser um evento chave na invasão e metástase de adenocarcinomas. Estas modificações envolvem a perda de expressão da queratina, bem como perda de polaridade e adesão celulares. Nós, aqui destinadas a determinar se a perda de expressão em si queratina unidades aumentou invasão e metástase em adenocarcinomas e se a perda de queratina conduz às mudanças fenotípicas associadas com EMT. Portanto, empregamos um modelo murino recentemente descrito, no qual a eliminação condicional do conjunto queratina II por Cre-recombinase conduz à perda de toda a família keratinmultiprotein. Estes ratinhos foram cruzados em um modelo de cancro recém-gerado Cre-recombinase indutível-driven KRAS pulmão de murino para examinar o efeito de perda de queratina na morfologia, invasão e metástase, assim como a expressão de genes relacionados EMT nos tumores resultantes. Nós aqui mostram claramente que a perda de um citoesqueleto queratina funcional não alterou significativamente a morfologia do tumor ou biologia em termos de invasão, metástase, proliferação ou a carga tumoral e não levou à indução de EMT. Além disso, as células tumorais não induziu de forma síncrona expressão de vimentina, que é muitas vezes visto na TEM, para compensar a perda de queratina. Em resumo, os nossos dados sugerem que as mudanças na forma das células e a migração que fundamentam EMT são dependentes de mudanças nas vias de sinalização que provocam alterações secundárias na expressão da queratina e organização. Assim, podemos concluir que a perda da queratina citoesqueleto por si só não é suficiente para causalmente EMT unidade neste modelo de tumor

Citation:. König K, Meder L, Kröger C, Diehl L, Florin A, Rommerscheidt-Fuss L, et ai. (2013) Perda da queratina citoesqueleto não é suficiente para induzir epitelial mesenquimal Transição em uma esporádica Lung Cancer Modelo rato Novel KRAS conduzido. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10.1371 /journal.pone.0057996

editor: Victoria Lawson, da Universidade de Melbourne, Austrália |

Recebido: 24 de setembro de 2012; Aceito: 30 de janeiro de 2013; Publicação: 11 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 König et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa Alemão via SFB 832, Projekt A5 e Z1 e da ajuda do cancro alemães através do CIO Cologne /Bonn. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mudanças fenotípicas de uma epiteliais para um tipo de célula mesenquimal, referidos como epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT), são passos fundamentais para a invasão e metástase de câncer. Uma característica da EMT é pensado para ser a remodelação do citoesqueleto, como a regulação para baixo dos queratinas epiteliais, o que leva a alterações na adesões célula-célula e as mudanças na polaridade celular e motilidade [1]. Estas alterações têm sido descritas na maior parte dos tipos de adenocarcinomas e são acreditados para suportar capacidade de invasão de tumores e formação de metástases [2], e a resistência à quimioterapia [3].

O cancro do pulmão, a causa mais comum de mortes por cancro em todo o mundo, tem sido tradicionalmente divididos em carcinomas de pulmão de células pequenas (SCLC) e carcinomas do pulmão de células não pequenas (NSCLC). CPPC formam 20% dos cancros do pulmão [4]. CPNPC estão subdivididos em três subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas, o adenocarcinoma e neuroendócrinas tumores. CPNPC formar grandes tumores primários coesas que diferem do CPPC, que são clinicamente muito agressivo e revelam uma taxa de mortalidade de 95% [5]. CPPC metástase muito cedo, não são coesa e mostrar uma difusa e padrão de crescimento infiltrativo. Histologicamente, eles são caracterizados por uma citoesqueleto queratina incompleta e condensado exibindo uma distribuição pontuada e perinuclear.

Com o aumento da aplicação do EGFR alvo inibidor da tirosina quinase terapia (TKI) em adenocarcinomas do pulmão, vários mecanismos de resistência contra este terapia têm surgido. Por um lado, foram observadas mutações que causam mudanças estéricos na proteína alvo ou a evasão do alvo inibido através do recrutamento de um segundo transdutor receptor ou sinal. Por outro lado, a transformação da linhagem epitelial-se submetendo-a transição mesenquimal (EMT) [6] ou a recidiva de TKI tratada NSCLS como o cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) foram descritos [7], [8]. Assim, estas observações clínicas suportam a hipótese de que a progressão de CPNPC a CPPC pode ser desencadeada por EMT.

Expressão

Desde que a perda de expressão de queratina é pensado para ser central para EMT, detectando reduzida ou perdida de queratinas

em vivo

é utilizado como um marcador de EMT em muitos

in vivo

sistemas modelo, bem como em humanos secções histológicas. Perda de queratinas leva à perda de junções celulares, tais como collants e desmosomas funcionais junções, e, portanto, adesão forte célula-célula [9], [10]. Em particular, a expressão de junções aderentes é regulada por genes EMT tanto nos adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas do pulmão [11].

No entanto, o papel funcional preciso de perda de queratina no crescimento do tumor, metástase e invasão e seu papel na EMT não está claramente estabelecida em qualquer modelo de tumor. Por conseguinte, investigado se a perda completa de expressão de queratina induz EMT, invasão e metástase. Para este fim, foi desenvolvido um novo modelo de rato inducible de adenocarcinoma de pulmão com defeito em todo o tipo de queratina causando falha de cluster II para formar quaisquer filamentos de queratina funcionais. Utilizando este modelo, que aqui mostram que a perda completa de queratina em KRAS tumores pulmonares mutante não afecta a morfologia do tumor, invasão ou metástase, indicando que a perda do citoesqueleto queratina não está a conduzir a transição de tumores pulmonares em carcinoma do pulmão de células pequenas ou um fenótipo sarcomatoide . Além disso, os marcadores EMT não foram-se regulamentada em adenocarcinomas de queratina deficiente.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do FELASA. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Bonn. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Geração de RASLO transgênicas Mice

Para induzir tumores de pulmão, geramos um vector de expressão que expressa um KRAS mutado

VAL12, bem como uma molécula de fusão que consiste de ovalbumina, um S-tag e uma molécula de luciferase dirigido por um promotor de 1,8 kb de frango ß-actina [4], após remoção mediada por Cre de um codão de paragem. RASLO ratinhos foram gerados por injecção pronúcleo de C57BL /6 x FVB embriões F1 com as KRAS oncogénicos constructo descrito na Figura 1A. Os ratos foram criados no Biotério Central da Universidade de Bonn de acordo com a Federação das diretrizes da Sociedade Europeia da Ciência Animais de Laboratório. A Comissão Animal Care de Nordrhein-Westfalen aprovado todos os experimentos do mouse.

(A) construção esquema que mostra a estratégia usada para gerar o modelo inducible KRAS pulmão impulsionado câncer (RASLO). (B) imagem Bio-luminescência tirada com uma câmera IVIS-200 (Xenogen) de fibroblastos da cauda culturas dos ratinhos fundadores RASLO após o tratamento com a proteína 2? M TAT-CRE e adição de luciferina direita antes de imagem, mostrando sinais fortes em 5 ratinhos fundadores . (C) da luciferase de imagem (IVIS-200) durante 1 min a forma sensibilidade de ratinhos RASLO 6 semanas após a indução com 2 × 10

7 UFP de adeno-CRE i.n (+) ou controlos de reprodução. (-). Os ratinhos foram injectados i.p. com luciferina em 200 ul de PBS e anestesiados por inalação de isoflurano. (D) imagem macroscópica do pulmão de um rato RASLO 6 semanas após a administração de AdCre, e (E) HE manchado seção com múltiplos tumores em 100x e 400x de ampliação. Análise (F) por PCR do ADN isolado a partir de linhas celulares derivadas de tumores de ratinhos e d RASLO RASLO × KIIf /mostrar um produto de PCR de 240 pb o que indica que a cassete de paragem ter sido removidos com sucesso por recombinase CRE no tumor. O vector utilizado para gerar a estirpe de ratinho (pRASLO) antes do tratamento CRE mostra um fragmento de 1200 pb. O mesmo vector após o tratamento Cre in vitro serve como um controle positivo para a excisão mediada CRE e mostra a banda de 240 pb esperado após recombinação.

Triagem para Ratos transgénicos RASLO

recortes de cauda dos fundadores foram usadas para criar culturas de fibroblastos e análise de PCR. Portanto pontas da cauda foram esterilizados com etanol a 70%, cortado em pequenos pedaços e digerido com colagenase durante quatro horas a 37 ° C. Elas foram cultivadas em meio DMEM fornecido com 8% de FCS, glutamina 2 mM e penicilina /estreptomicina. Após cinco dias, os fibroblastos da cauda foram tratados com 2 uM proteína Tat-Cre durante sete horas e analisadas no dia seguinte sob a câmara de bioluminescência IVIS 200, após a adição de luciferina para o meio de cultura. PCR e ensaio de luciferase fundadores positivos foram utilizados para estabelecer várias estirpes RASLO. A genotipagem foi realizada pela cauda PCR usando a frente (5′-CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 ‘) e reverter iniciadores (5′- CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3’).

Produção e Administração de adenoviral CRE

HEK 293 As células foram infectadas com adenovírus recombinante que expressa Cre-recombinase (AdCre) [12] com (MOI = 5). Depois de cinco dias, as células foram colhidas e vírus foi liberado por ciclos de descongelamento e congelamento rápido. O vírus foi purificado por ultracentrifugação num gradiente de cloreto de césio [13] Depois disso, os lotes de vírus foram gerados através de concentração, utilizando cassetes Slidalyzer (Thermo Fisher Scientific).

foram anestesiados Antes da aplicação nasal de ratos AdCre com uma combinação de 10 mg /ml de cetamina /0,1% Rompun em PBS. Dependendo do peso do corpo do rato entre 150 ul e 200 ul foi injectado i.p. 2 × 10

7 UFP de AdCre foi pipetada sobre o nariz dos ratinhos para ser inalado. Os animais foram observados até estar totalmente acordado e confortável. Não foram observados sinais de estresse e desconforto. Após a indução de tumor, os animais foram monitorizados diariamente para sinais de desconforto ou dificuldade respiratória. Os ratos foram excluídos por análises posteriores, quando os ratos apresentaram sintomas de stress respiratório. Os ratos foram fotografadas em uma base regular sob IVIS 200 câmera de bioluminescência (PerkinElmer). Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados por inalação de isoflurano e, em seguida, receberam 2,8 mg de D-luciferina pirilampo (calibre) em 200 ul de PBS i.p. e fotografada em um palco aquecida. Os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical depois de 6 semanas de administração AdCre. Os pulmões foram fixados em formalina 4% PBS-tamponado por 24 horas para inclusão em parafina, ou congelados em nitrogênio líquido por crio-preservação.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

DNA foi isolado a partir de linhas de células geradas a partir de tumores do pulmão do rato transgénicos ou a partir de tecido congelado (FF) de pulmão fresco com DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng de ADN molde foi utilizado por reacção. Cada reacção de PCR continha tampão 1 x, dNTP 0,2 mM, MgCl 2 mM de

2, 0,2 U de Taq polimerase e 0,2 uM de iniciadores. Para mostrar a excisão bem sucedida dos locais loxP 5 ‘Lox5 forward: 5′-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3’ e 3 ‘Ras5 reversa: 5′-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3′ foram utilizados obtendo-se um produto de 240 pb. Sem a excisão do codão STOP estes iniciadores dar um produto de 1,2 kb. Para confirmar a excisão locus de queratina foram utilizados os seguintes iniciadores: DEL (para a frente TGAACCCAGGAGGTTGAGAC 5’-3 ‘e 5′-TGGCGTCGTGATTAGTGATGA reversa) e FLOX (para a frente GATAACCGTATTACCGCCTTTG 5′-3′ e reverso 5’- CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 ‘).

linhas celulares

foram utilizadas as seguintes linhas de células de origem humana: A549, H1975, H460, HCC827, DMS114, SW1271 e foram obtidas da American Type Culture Collection. [14] N417, PC9 [15]: R. Thomas (University of Cologne) gentilmente cedido. GLC1, GLC2 [16], e GLC36 [17] foram um presente amável do Dr. L. de Leij (Universidade de Groningen, Groningen, Holanda). linhas de células NSCLC e SCLC foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 8% de FCS incubadas a 37 ° C e 5% de CO

2

linhas celulares de rato pulmonares foram gerados a partir RASLO KII + /+ e KIIf /. – ratos. Os tumores foram excisados ​​com um bisturi e digerido durante pelo menos 3 horas a 37 ° C em meio DMEM /meio F12 de Ham com L-glutamina, suplementado com albumina de bovino a 2%, 0,5 ug /ml de hidrocortisona, de 600 U /colagenase ml, 5 ug /ml de insulina humana, 200 U /ml de hialuronidase, tampão Hepes 10 mM, e penicilina /estreptomicina. A suspensão celular foi filtrado duas vezes e as células vermelhas do sangue lisadas com tampão de lise ACK. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com murinos EGF 20 ng /ml, Factores de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) a 20 ng /ml, sal de heparina de sódio de porcinos Mucosa Intestinal 4 ug /ml, B-27, suplemento de soro-livre, Penicilina /Estreptomicina e gentamicina 35 ug /ml.

qRT-PCR

O ARN total foi isolado a partir de linhas celulares de cancro do pulmão humano ou tecido de pulmão de rato crio-preservados (5 vezes 10 ^ M) desliza por RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng de RNA total foi transcrito em ADNc utilizando SuperScript ™ III H

– Transcriptase Reversa e oligo (dT) 12-18 Primer (Life Technologies). qRT-PCR foi realizada com SYBR Green (Qiagen) com os iniciadores dirigidos contra queratina 8 (directo 5′-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 ‘e inverso 5′-CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3′). Como controlo utilizou-se o serviço de limpeza 28 s ARN (directo 5’-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 ‘e inverso 5′-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3′). primers luciferase tinha a seguinte sequência: frente 5’-TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 ‘e reverso 5′- TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3’; e como um controle de limpeza 18 s:. forward 5’ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3 ‘e reverso 5′- TGACCGCGGACAGAAGGCCC-3’

Todos os qRT-PCR foram executados no rápido Real-Time PCR System 7900HT (Applied Biosystems ), e analisados ​​com o software SDS2.2 (Applied Biosystems). Todas as amostras foram analisadas em triplicado e nível de expressão foi calculada usando o método ΔΔCT.

Imunofluorescência de linhas celulares de cancro do pulmão

As células foram semeadas em lamínulas durante a noite e fixadas em metanol gelado durante 5 minutos , em seguida, coradas com Pan-queratina (1:100, MNF116, Dako) e DP-1 (1:100, DP-1, Progen) diluído em TBS /BSA a 1% /5% NGS durante 1 hora à temperatura ambiente. anticorpos secundários correspondentes cabra anti-gp

Alexa488 (1:800, Life Technologies), de cabra anti-rato

TexasRed (1:800, Life Technologies) e DAPI (1:1000, Life Technologies) diluídos em TBS /BSA a 1% /5% de NGS foram adicionados às células durante 45 minutos à temperatura ambiente. As imagens foram tiradas com um microscópio invertido equipado com um ApoTome (Zeiss).

Imunohistoquímica

Os tecidos foram fixados em formalina 4% PBS-tamponada, embebidos em parafina (FFPE). 3 mm lâminas foram usadas para manchas histológicas. A imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [18]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: Ki67 (01:25, TEC-3, Dako), K8 /18 (1:100, GP11, Progen), Vimentin (1:100, EPR3776, Abcam), E-caderina (1:50 , SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), SS-catenina (1:100, # 4270, Cell Signaling), CD56 (1:50, RNL-1, Abcam), Caracol (1:200, Abcam), Sinaptofisina (1 :200, SY38, Abcam), cromogranina A (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), vantagens (1:50, Cell Signaling), CD44 (1:50, Abcam). Todas as lâminas foram digitalizadas com um scanner de slides Pannoramic 250 (Histech.com 3D).

Estatísticas

Estatísticas foram calculadas com o Excel, Prism e SPSS. As barras de erro indicam o erro padrão da média. O teste t de Student foi utilizado para analisar os dados para diferenças significativas. P-valores 0,05 foram considerados significativos e indicado nas figuras da seguinte forma:. * P≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

Resultados

Geração de RASLO modelo cancro do pulmão murino

Geramos um romance modelo murino transgénico (RASLO) para o adenocarcinoma do pulmão, que após CRE remoção induzida por recombinase de um códon de parada é impulsionado por um KRAS oncogênicos constitutivamente activados

Val12 sob o controlo de um promotor de 1,8 kb de frango ß-actina. O construto também expressa um gene de fusão que consiste de um S-tag (para imuno-histoquímica), luciferase (para a detecção in vivo de tumores) e ovalbumina de galinha (como um antigénio modelo de tumor) por meio de um vírus de polioma local ribossómico reentrada interno ( Fig. 1A). RASLO ratinhos foram gerados por injecção embriões pró-núcleo de C57BL /6 x FVB F1. Os animais resultantes foram rastreados para a integração bem sucedida de uma construção funcional, através da incubação de cauda cultura de fibroblastos com a proteína Tat-Cre recombinante [19] para excisar a cassete parada e ativar a construção

in vitro

. Subsequentemente, estes fibroblastos foram fotografadas com uma câmara de bioluminescência IVIS 200 após a adição de luciferina para o meio de cultura (Fig. 1B) para identificar os animais com uma integração totalmente funcional do construto RASLO. Cinco fundadores foram identificados com base na PCR e luciferase ensaios, um dos quais mostravam transmissão de linha germinal.

Foi aplicado um adenovírus expressando CRE recombinase (AdCre) por via intranasal (i.n.) para RASLO ratos. Os tumores de pulmão desenvolvidas nestes ratinhos após 6 a 8 semanas que podem ser visualizadas

In vivo

por detecção de bioluminescência após injecção i.p. injeção de luciferina (Fig. 1C) e foram macroscopicamente detectável

ex vivo

como numerosos nódulos brancos que cobrem os pulmões (Fig. 1D). Os tumores que surgem nos ratinhos tratados com RASLO AdCre composto adenomas múltiplos papilar e adenocarcinomas papilares invasivos (Fig. 1E), o que é consistente com modelos de cancro do pulmão conduzida KRAS descritos anteriormente [4], [20]. a formação do tumor foi exclusivamente criada no pulmão, como não observamos a formação de tumores em qualquer outro órgão dos ratos RASLO tratados AdCre. análise genômica PCR de linhas celulares estabelecidas de tumores pulmonares RASLO revelou remoção bem sucedida da cassete parada (Fig. 1F).

Redução Expressão queratina em SCLC

A perda da expressão da queratina é comumente observada durante EMT , bem como a transformação de um adenocarcinoma de um carcinoma de células pequenas (SCLC) [8]. Portanto, coradas adenocarcinomas pulmonares humanos e espécimes de cancro do pulmão de células pequenas de queratinas e observada apenas coloração da queratina perinuclearly condensado nas amostras de SCLC em comparação com forte coloração citoplasmática nos adenocarcinomas do pulmão coesa em crescimento (Fig. 2A painéis superiores). Um padrão de coloração semelhante de queratina foi observada em culturas de células de adenocarcinoma e linhas de células SCLC por imunofluorescência (Fig. 2A, painéis inferiores). Além disso, nós desmoplaquina coradas para que, quando ausente, leva a um crescimento do tumor mais invasiva e está ausente ou é reduzida em muitos cancros epiteliais humanos [21]. Em SCLC, desmoplaquina estava ausente, enquanto que NSCLC desmoplaquina expresso (Fig. 2A). Nós investigou também se queratinas são diferencialmente expressos em NSCLC e linhas de células SCLC. De fato, linhas de células SCLC expressa pouca ou nenhuma mRNA para a queratina 8, enquanto que as linhas de NSCLC expressa altos níveis de queratina 8 mRNA (Fig. 2B).

A imuno-histoquímica de amostras tumorais FFPE (A) para pan queratina de adenocarcinoma de pulmão e uma SCLC típico (painéis superiores de a). Imunofluorescência de um adenocarcinoma (HCC827) e linha de células SCLC (GLC36) corada para pan queratina (vermelho) e desmoplaquina (DSP em verde) (A, painéis inferiores). (B) O ARN total foi isolado a partir de um painel de SCLC humano e as linhas celulares de NSCLC. a expressão de ARNm de queratina Relativa 8 foi medida por qRT-PCR média da expressão relativa de análises quadruplicado para cada linhas celulares são descritos e a MEV é indicado. A significância estatística foi calculada utilizando um teste t de Student: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representativos de três experiências independentes.

queratina Loss in vivo não leva a EMT ou mais agressivo Tumor Biology

Para investigar se a perda de expressão de queratina em adenocarcinomas do pulmão funcionalmente leads a biologia do tumor pior através da indução de EMT ou um fenótipo de células pequenas, atravessamos ratos RASLO com a linha KO queratina inducible (KII). camundongos RASLO com um cluster de tipo selvagem tipo de queratina II (KII + /+) ou abrigar um tipo selvagem e um alelo knock-out (KII +/-) ou um floxed e um alelo knock-out (KII f /-) foram tratados com AdCre intranasalmente. Todos os três grupos de ratos desenvolveram tumores que eram detectáveis ​​

in vivo

por imagem de bioluminescência no prazo de 6 semanas (Fig. 3a). Seis semanas após o tratamento AdCre, os ratinhos foram sacrificados e a carga tumoral e morfologia foi avaliada. Para confirmar o genótipo dos ratinhos e os tumores de pulmão, foi realizada reacções de PCR em DNA extraído de todo o pulmão de ratos com os iniciadores específicos para a construção RASLO, o eliminado e o aglomerado floxed queratina tipo dois (Fig. 3B). Todos os ratinhos mostrou a presença de RASLO construir, e como esperado, apenas KII +/- e KII f /- mostraram inserção do locus DEL, e exclusivamente os ratos com o KII f /- alelo deu a banda prevista de PCR (Fig. 3B) . Nós usamos três diferentes medidas para quantificar a carga tumoral de KII + /+, KII +/- e KII f /- animais. Em primeiro lugar, nós quantificada a carga do tumor pela medição da quantidade de ARNm de luciferase em portadores de tumor nos pulmões meio de qRT-PCR (Fig. 3C). a expressão de luciferase pode ser correlacionada com a carga tumoral, uma vez que é co-expressa pela construção RASLO. Não foi observada diferença estatisticamente significativa nos níveis de mRNA luciferase entre os grupos. Isso indica que uma expressão de queratina reduzida não leva a uma carga de tumor aumentou.

(A) Grupos de RASLO camundongos transgênicos cruzou para diferentes alelos de cluster queratina II foram anestesiados com cetamina /Rompun e 2 × 10

∧7 pfu AdCre foram administrados em seis semanas anteriormente. Para a detecção do tumor, os ratinhos foram injectados i.p. com luciferina em 200 ul de PBS e fotografada com uma câmara IVIS-200 (Xenogen). Bioluminescense comparando representante do tipo selvagem (ctrl), transgénico RASLO com o tipo selvagem queratina loco (KII + /+), transgénico RASLO com heterozigotos queratina grupo II expressão (KII +/-) e camundongos transgênicos RASLO com um knock-out e um floxed queratina grupo II alelo (KII f /-) são mostrados aqui. Os diferentes grupos mostraram sinais de bioluminescência com uma intensidade comparável. analisa (B) PCR específica para o alelo de DNA isolado a partir de tumores de pulmão conservada-crio de ratinhos RASLO para detectar a FLOX, DEL, e alelos RASLO foram realizadas. nível de expressão (C) ARNm de luciferase foram determinadas nos pulmões conservada-crio por qRT-PCR para avaliar a carga tumoral. nível de expressão foi normalizado para o RNA 18 s. (D) Quantificação da carga tumoral pela área em três secções por pulmão. Três secções HE representante de cada pulmão foram analisados ​​com respeito a percentagem da área do tumor (painel superior) e o tamanho do tumor (painel inferior). seções FFPE foram coradas para K8 /18 e fotografada com Pannoramic250 (3DHistech) scanner de slides. diâmetro do tumor máximo de até trinta tumores tumor representante de cada lâmina foi medido com o 3DHistech Pannoramic Viewer e o diâmetro máximo médio comparar entre os diferentes genótipos. (F) coloração imuno-histoquímica para queratinas 8 e 18 em tumores de RASLO KII f /- ratos. (G). A barra de escala representa 100 m. tumores tipo RASLO selvagens (à esquerda) em comparação com KII – /- tumores do lado direito são mostrados como HE manchas (painéis superiores) e queratina 8 e 18 (painéis inferiores) valores são representados como média +/- SEM. A significância estatística foi calculada utilizando um teste t de Student: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representativos de três experiências independentes.

Além disso, estima a carga tumoral, avaliando a% da área de pulmão coberta por tumor em três seções sagital dos pulmões por dois observadores independentes, cegos. Isto revelou que os tumores de tamanho comparável desenvolvidos nos ratinhos RASLO que transportam os diferentes genótipos de queratina (Fig. 3D). Além disso, o tamanho do tumor foi avaliada medindo o diâmetro do tumor utilizando imagens de lâminas histológicas digitalizadas. A comparação entre os diferentes genótipos não revelou diferenças significativas (Fig. 3E). Estes dados sugerem que a ausência de pelo menos um alelo do cluster queratina tipo II não tem um impacto significativo na biologia do tumor neste modelo baseado em KRAS de adenocarcinoma de pulmão.

A activação do construto KRAS requer o cri- remoção mediada de um fragmento grande de DNA de 800 pb, incluindo um codão de paragem (Fig. 1A). Para excluir todo o cluster queratina tipo II, um fragmento de ADN de 0,68 Mbs precisa ser removido [10], [22]. Portanto, nós não esperamos que todos os tumores em RASLO × KIIf /- camundongos seria completamente desprovida de queratina. Para visualizar os tumores nos pulmões de RASLO × KIIf /- ratos nos quais o floxed KII-alelo foi removida com sucesso, se secções de parafina coradas para queratina 8/18. Cerca de 30% dos tumores carecia completamente expressão queratina, indicando que a deleção de facto mediada por Cre do cluster KII não foi tão eficiente como a activação do construto KRAS (Fig. 3F). Morfologicamente, os tumores de queratina com deficiência eram adenomas papilares típicas e adenocarcinomas indistinguíveis dos vizinhos tumores positivos de queratina na mesma lâmina (Fig. 3F) ou de tumores do pulmão induzidos KRAS-de queratina animais de tipo selvagem (Fig. 3G). Para examinar se a perda de queratina teve uma influência sobre a proliferação ou a taxa de apoptose em tumores de pulmão impulsionado KRAS, determinamos as taxas de proliferação e as taxas de apoptose por Ki67 e caspase 3 coloração, respectivamente, mas não observaram diferenças significativas (Fig. 4A, B) . Em resumo, estes dados fornecem evidência de que a perda de expressão da queratina não afecta o tamanho da célula do tumor de KRAS conduzido adenocarcinomas do pulmão de murino e que a presença de 30% de tumores negativos de queratina não alterou a carga global do tumor, o que sugere que a perda de expressão da queratina não está directamente envolvida no estabelecimento do fenótipo de células pequenas e agressivo de SCLC

(a) Ki-67 de um imuno-histoquímica KII -. /- tumor deficiente (comparar com a figura 5 a partir de uma mesma série de secções em série). (B) Análise Formal de 6 áreas por pulmão de seis queratina do tipo selvagem e KII – /- tumores revela semelhante Ki-67 índice de proliferação. Caspase 3 coloração só mostrou células positivas individuais (seta vermelha) em em queratina deficiente (- /-). E queratina tumores que expressam (KII)

queratina Loss não influenciar a expressão de EMT e neuroendócrino marcadores em tumores de pulmão

A redução da expressão da queratina e condensação em um padrão perinuclear pontuar é uma característica do cancro do pulmão de pequenas células neuroendócrinas e é amplamente usado como um marcador para EMT em adenocarcinomas. Embora os tumores negativos queratina provenientes do tratado AdCre KRAS × KIIf /- ratos não diferiram morfologicamente de seus tumores positivos queratina vizinhos, nós investigamos se os tumores negativos queratina expressa marcadores adicionais associados com EMT e do fenótipo SCLC

imuno-histoquímica revelou que o tipo III intermediário vimentina proteína de filamento, que é frequentemente sobre-regulada durante epitelial para mesenquimal (EMT) após a perda de expressão da queratina (Mani UA, 2008), não foi nem expresso em tumores de queratina-positivas nem -negativas do KRAS × KIIf /- camundongos (Fig. 5). Além disso, cromogranina A, CD56, e sinaptofisina, são marcadores de imunohistoquímica normalmente expressos em pequenos carcinomas neuroendócrinos células do pulmão [23], [24]. No entanto, ambos os tumores queratina positivos e negativos no KRAS × KIIf /- ratos não expressam qualquer um destes marcadores (Fig. 5). Os controlos positivos para a especificidade de colorações são mostrados na figura S1. Em seguida, analisamos os marcadores associados com a perda de contactos célula-célula durante EMT. Em particular, a perda de E-caderina induzida por vários repressores transcricionais como caracol, e Slug [25] é típico para EMT. No entanto, não encontramos que os tumores de queratina com deficiência ao longo expressou os repressores de transcrição Snail, Slug ou perdeu expressão de E-caderina (Fig. 6).

Os ratinhos foram anestesiados e 2 × 10

7 UFP adeno -CRE vírus foi pipetada sobre o nariz do rato para ser inalado. Os ratinhos foram sacrificados após 6 semanas e os pulmões dos ratinhos foram removidos e fixados em formalina e embebidos em parafina. IHCS para K8 /18, vimentina, cromogranina A (cromo), CD56 e sinaptofisina (synapto) são mostrados. Uma maior ampliação de um tumor negativo queratina é mostrado na coluna da direita e a área de caixas do lado esquerdo.

Seis semanas após a administração adeno-Cre, os ratinhos foram sacrificados e os pulmões dos ratinhos foram removidos e fixadas em formalina e embebidas em parafina. Uma maior ampliação de um tumor negativo queratina é mostrado na coluna da direita e a área de caixas do lado esquerdo. Colorações da seção de série para os marcadores de EMT, ou seja, E-caderina, Caracol, Lesma, e β-catenina são mostrados.

Desenvolvimento e manutenção de junções aderentes depende de um complexo multiprotein de β-catenina, α -catenina e e-caderina. Após a activação da sinalização de Wnt, uma considerável proporção de beta-catenina em ser translocado para o núcleo para activar a expressão do gene associado com EMT [26]. Nós coradas para SS-catenina, mas não foi possível detectar qualquer expressão de beta-catenina nuclear na queratina do tipo selvagem ou deficientes em tumores (Fig. 6). Nós não têm anteriormente demonstrado em linhas de células que não possuem o cluster KII, ZO1 e desmoplakin estão localizados na membrana [22] Tentámos para corar e para desmoplakin ZO1 em material de FFPE murino. Na Figura S2 a coloração da pele de murino de tipo selvagem e KII + /+ para ZO1 são mostrados. Poderíamos detectar alguma coloração membranosa na amostra de pele que serviu como um controlo positivo. No entanto, nós não ver qualquer coloração membranoso no tipo selvagem ou KII – /- tumores. Além disso, manchado RASLO wild-tip e tumores deficientes queratina para pMAPK e CD44 e não observamos ea diferença (Fig. S2). Em resumo, a perda de queratina no nosso modelo de tumor de pulmão KRAS não conduziu ao desenvolvimento de tumores com um fenótipo de célula pequena ou expressão dos marcadores associados com EMT. Estes dados indicam que a perda de queratina, por si só não é responsável pelo aparecimento de EMT ou o desenvolvimento de uma pequena fenótipo celular em adenocarcinomas do pulmão no rato modelo aqui apresentado.

Discussão

Perda de expressão da queratina é uma característica tanto de cancro do pulmão de pequenas células e de EMT e tem sido sugerida para aumentar a invasão e metástase. Além disso, em adenocarcinomas do pulmão que foram tratados com inibidores de tirosina quinase de EGFR, a conversão para um fenótipo de células pequenas e EMT tem sido identificada como um dos vários mecanismos de resistência a evadir terapia [8].