Abstract

Fundo

Os fosfatase atos PTEN em fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato resultantes de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) ativação. PTEN expressão tem sido mostrado para ser diminuída em cancro colo-rectal. Pouco se conhece no entanto quanto à função celular específica de PTEN em células epiteliais intestinais humanas. O objetivo deste estudo foi investigar o papel da PTEN em células de câncer colorretal em humanos.

Metodologia /Principais Achados

Caco-2/15, células HCT116 e CT26 foram infectadas com lentivírus recombinantes expressando um shRNA especificamente concebido para knock-down PTEN. O impacto de PTEN downregulation foi analisada em polarização e diferenciação celular, a integridade das junções intercelulares (expressão de proteínas de adesão célula-célula, a função de barreira), a migração (ensaio de feridas), invasão (transwells revestidos por matrigel) e na formação de tumores e metástases em ratinhos . análise de microscopia eletrônica mostrou que a infecção lentiviral de shRNA PTEN inibiu significativamente polarização celular Caco-2/15, diferenciação funcional e desenvolvimento borda em escova. Uma forte redução em claudina 1, 3, 4 e 8, também foi observada, bem como uma diminuição da resistência transepitelial. Perda de expressão de PTEN aumentou a difusão, migração e invasão capacidades das células de câncer colorretal

in vitro

. PTEN downregulation também o aumento do tamanho do tumor após injecção subcutânea de células de cancro colorectal em ratos nus. Por último, a perda de expressão de PTEN em HCT116 e CT26, mas não em células Caco-2/15, que levou a um aumento no seu potencial metastático, após as injecções na veia da cauda-em ratinhos.

Conclusões /Significado

Em conjunto, esses resultados indicam que PTEN controla a polaridade celular, a criação de junções célula-célula, a permeabilidade paracelular, migração e potencial tumorigénico /metastático de células de câncer colorretal em humanos

Citation:. Langlois MJ, Bergeron S, Bernatchez G , Boudreau F, Saucier C, Perreault, N. et al. (2010) A fosfatase PTEN Controles intestinal epitelial Polaridade celular e função de barreira: Papel no cancro colorectal progressão. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10.1371 /journal.pone.0015742

editor: Pendure Thi Thu Nguyen, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de agosto de 2010; Aceito: 22 de novembro de 2010; Publicação: 23 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Langlois et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82942) e MT-14405 (NR). N.R. é um destinatário de uma cadeira da pesquisa de Canadá em Sinalização e Digestivo Fisiopatologia. J. C., C. S. e F.B. são estudiosos do Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S. B. é um beneficiário de uma bolsa de pós-doutoramento da Associação Canadense de Gastroenterologia /CIHR /CCFC. N. R., J. C., C. S., N.P., e F.B. são membros da FRSQ-financiado “Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. Uma característica marcante do câncer colorretal é a perda da organização celular. O grau histológico de carcinomas colorrectais é uma variável importante de prognóstico e é dependente do grau de diferenciação glandular e a polaridade celular. Alto grau, neoplasias colorretais pouco diferenciados são geralmente mais agressivo do que o seu baixo grau, homólogos bem diferenciados [1].

Em células epiteliais, adesão celular e polaridade apical-basal são mantidos através da formação de vários sistemas de adesão intercelular tais como junções apertadas (TJS). O TJ regula a difusão paracelular e funcionalmente segrega da membrana plasmática em dois compartimentos, o que é um requisito para o pleno polarização de células epiteliais [2]. As células neoplásicas freqüentemente apresentam deficiências estruturais e funcionais em ambas as junções apertadas e aderentes [3] – [5]. Tal como revisto por Martin e Jiang [4], a expressão de muitas proteínas de junções apertadas é desregulada em cancros colo-rectais. O adherens junção proteína caderina-E é também diminuiu nos cancros colo invasivos [6]. Além disso, o padrão de expressão de hDlg e hScribble, conhecido para controlar o estabelecimento da polaridade apical-basal das células epiteliais [7], marcadamente muda durante a progressão do tumor colorrectal com a sub-regulação de ambas as proteínas a ser associado com a falta de polaridade celular epitelial e desorganizado arquitetura do tecido [8].

Fosfoinositídeos também surgiram nos últimos anos como determinantes gerais, tanto polaridade e identidade de várias membranas. Dados recentes indicam que PtdIns (4,5) P2 é um factor determinante da superfície apical das células epiteliais [9]. De facto, em células MDCK não polarizado, ambos PtdIns (4,5) P2 e PtdIns (3,4,5) P3 colocalize na célula-célula e os contactos célula-matriz extracelular. No entanto, durante as fases iniciais de polarização, PtdIns (4,5) P2 torna-se concentrado principalmente na membrana apical das células enquanto que PtdIns (3,4,5) P3 permanece localizada na membrana basolateral e excluídos da membrana apical. A fosfatase PTEN lípido localiza no domínio apical e é essencial para a segregação de PtdIns (4,5) P2 para a superfície apical devido à sua acção de desfosforilação no grupo D3-fosfato de PtdIns (3,4,5) P3 [10 ]. Além disso, PTEN actua como um regulador negativo do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /via de sinalização de Akt e foi mostrado para influenciar vários processos desregulados na tumorigénese, tais como a proliferação, a sobrevivência celular, migração e invasão [11], [12] .

PTEN é codificada pelo

fosfatase e tensina homólogo excluída no cromossomo 10

(

PTEN

) gene supressor de tumor, que é o segundo gene mais frequentemente mutado em cancros humanos seguinte

TP53

[12]. Além disso, a perda de PTEN imunocoloração em tecidos cancros colo-rectais tem sido associada com doença avançada, a metástase do fígado e a sobrevivência do paciente pobre [13] – [16], o que sugere o seu potencial papel protector contra a progressão da carcinogénese colorectal humano. Uma vez que controla a polaridade de PTEN em células epiteliais normais, pode-se especular que a perda desta proteína pode ser suficiente para disparar a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um evento crítico no início da invasão e metástase de vários tipos de cancro, incluindo o CRC. Em estudos anteriores, os efeitos da perda de PTEN principalmente foram medidos em linhas celulares de cancro que abrigam numerosos outros transformadora e mutações oncogénicas e que perderam o seu fenótipo epitelial [17] – [19]. Tal abordagem torna difícil determinar qual fenótipos são directamente conferido pela perda de PTEN e para definir as fases de tumorigénese que são especificamente alterados em células com perda de PTEN. De modo a caracterizar ainda mais a ligação entre a perda de PTEN, perda de polaridade e progressão do cancro colo-rectal, utilizou-se a linha de células Caco-2/15 derivada de um adenocarcinoma colorretal humano relativamente bem diferenciada. Este clone do pai linha de células Caco-2 tem sido amplamente caracterizada pela sua capacidade de empreender um processo de diferenciação completa morfológica e funcional intestinal epitelial que ocorre espontaneamente uma vez confluência foi atingido e que é completada após 15-20 dias de pós-confluência . Mais especificamente, essas células do cólon formar complexos juncionais apertados e aderentes apical e formar uma monocamada polarizada após vários dias de pós-confluência, exibindo resistência elétrica transepitelial (TEER) semelhante ao

in vivo

observações [20] – [22 ]. Os seguintes “de diferenciadas” linhas celulares de CRC também foram analisados: o HCT116, uma linha celular humana CRC microsatélite instável e CT26, um de cólon metastático linha de células de carcinoma mouse. Os resultados mostram que PTEN pode agir como uma barreira para o desenvolvimento do câncer, controlando a polaridade celular, a criação de junções célula-célula, a permeabilidade paracelular, migração e potencial metastático de células de câncer colorretal em humanos.

Materiais e Métodos

material e anticorpos

Os anticorpos para a detecção de PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) e HNF4α (C-19) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos produzidos contra a E-caderina e vilina eram da BD Biosciences (Mississauga, ON, Canadá). Os anticorpos para a detecção de fosfo-AKT (Ser473) e AKT foram de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). O anticorpo β-actina foi de Chemicon (Temecula, CA). O ocludina, claudinas e os anticorpos ZO-1 foram todos de Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). Anticorpo monoclonal HSI-14 contra sacarase-isomaltase foi gentilmente cedido pelo Dr. Andrea Quaroni (Universidade de Cornell, Ithaca, NY). CDX2 imunotransferência foi realizada com um anticorpo policlonal de coelho contra CDX2 caracterizada anteriormente [23]. Todos os outros materiais foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (Oakville, ON), a menos que indicado de outra forma

cultura celular

Três linhas de células de cancro do cólon foram usadas no presente estudo:.

1-A linha celular de adenocarcinoma colo-rectal Caco-2/15 foi obtido a partir de A. Quaroni (Cornell University, Ithaca, NY). Esta linha celular proporciona um modelo único e bem caracterizado para o estudo de diferenciação intestinal epitelial uma vez que estas células sofrem diferenciação funcional e morfológica para um fenótipo enterócito com microvilosidades, formação de cúpula, e a expressão de sacarase-isomaltase, vários dias após atingir confluência [20] – [22]. Estas células expressam truncado

APC Comprar e mutado

p53

mas exibem tipo selvagem

K-Ras

,

β-catenina

e reparação incompatibilidade (MMR) proteínas; eles são, portanto, estável microssatélite (MSS) [24], [25]. Estas células foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM, Invitrogen ™) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS). 2- As células HCT116 foram obtidas de ATCC (CCL-247). Estas células crescem em multi-camadas e são incapazes de polarização ou a diferenciação epitelial intestinal [20]. Estas células são hMLH1 deficiente, expressar o tipo selvagem

p53

, do tipo selvagem

APC

e realizar a ativação

K-Ras

,

pi3kca

, e

β-catenina

mutações [26]. Estas células são metastático [27], [28] o que nos permite analisar o impacto da PTEN perda de expressão em estágios avançados de câncer colorretal. Estas células foram cultivadas em meio de McCoy (Wisent, St-Bruno, Quebec, Canadá) que contém 10% de FBS. 3- CT26 células (gentilmente cedidas pelo Pr Nicole Beauchemin, Université McGill, Canadá) foram obtidos a partir de um adenocarcinoma murino indiferenciada que foi induzida pela injeção rectal de

N

-nitroso-

N

-methylurethane em ratinhos Balb /c. Estas células carregam ativando

K-Ras

mutações [29], do tipo selvagem

p53

e não expressam E-caderina ou ZO-1 [30]. células CT26 foram mantidas em meio RPMI (Invitrogen ™) contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina.

O plasmídeo construções e lentivírus produção

O vector de expressão de lentivírus shRNA (pLenti6-U6) foi construído como se previamente descrito [31]. shRNA oligonucleótidos contra PTEN humano foram concebidos de acordo com as orientações Ambion (Technical Bulletin # 506) utilizando o siRNA sequências gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (# 2), gccagctaaaggtgaagatat (# 3) com ttcaagaga como a sequência cíclica. Os produtos recozido com oligonucleótidos foram subclonados em pLenti6-U6 entre o

Bam

HI e

Xho

Eu sites. Um irrelevante plenti-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) ou um mutante plenti-shPTEN (shMUT) foi utilizado como controlo negativo. O mutante plenti-shPTEN foi gerado mudando 3 nucleótidos na sequência do shRNA mais eficiente contra PTEN (# 2), resultando na sequência de gcacaagataacctagatttc siARN. O shRNA contra a forma murina de Pten (TRCN0000028992) e um correspondente controlo shRNA (shTGFP) contra TurboGFP ™ (SHC004) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich. Os lentivírus produzidos em células 293T foram usados ​​para infecção de células de acordo com as recomendações da Invitrogen (ViraPower Lentivirus Expression System). Sem indução de

OAS1

expressão do gene foi detectado por análise de Q-PCR nas experiências envolvendo infecção por lentivírus (dados não mostrados).

OAS1

(2050-oligoadenilato sintetase) é um gene alvo interferon clássico e tem sido recomendada como um teste chave para a indução de interferão antes de atribuir uma determinada resposta ao gene alvo [32].

Protein extracção e análise Western blot

extracções de proteínas e análise de transferência de Western foram realizados como previamente descrito [22].

microscopia Electrónica de Transmissão

As amostras foram processadas como anteriormente descrito [22] e observadas em um microscópio eletrônico de transmissão Hitachi H-7500.

microscopia eletrônica de varredura

O Caco-2/15 células foram semeadas em pequenas lamelas de 12 mm de diâmetro e fixado como descrito anteriormente para microscopia de transmissão electrónica [22] acima para o passo de desidratação em etanol. As amostras foram então crítico de ponto seco com CO

2 e coberto com ouro-paládio com um revestidor por crepitação. As células revestidas foram posteriormente observados com um microscópio eletrônico de varredura JEOL (modelo: JSM-840).

Determinação da resistência elétrica transepitelial

Caco-2/15 células foram semeadas em membranas permeáveis ​​TRANSWELL® ( Corning, Acton, MA). TEER foram medidos 3 e 9 dias após as células atingiram confluência com um epitelial Voltommeter (World Precision Instrument, modelo Evom-G).

análise de RNA

total isolamento do RNA, RT-PCR e Q-PCR foram realizados como previamente descrito [31]. expressão do alvo foi quantificado relativamente a expressão PDGB. Os iniciadores para cada gene foram concebidos nas junções exão-exão utilizando o software Primer3 [33]. As sequências dos iniciadores e condições Q-PCR estão disponíveis mediante pedido.

ensaios de migração

Os ensaios foram realizados de acordo com a técnica de lâmina afiada conforme relatado anteriormente [34].

ensaios de Rac e actividades CDC42

GTP-bound níveis de Rac e Cdc42 foram analisadas com um estojo de ensaio de activação bioquímica L-LISA (Cytoskeleton, Denver, CO) de acordo com as instruções do fabricante.

ensaios de invasão

ensaios de invasão foram realizadas utilizando BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasão Câmaras com 8 mícrons filtros polycarbonated (BD Biosciences). As células foram semeadas em meio sem soro na presença de 2 mM de hidroxiureia, um inibidor da redutase farmacológica ribonucleósido celular para parar o ciclo celular em G1 /fase S [35]. Meios contendo 20% de FBS foi usado como quimioatractor. Após uma incubação de 48 h a 37 ° C, as células não-invasivos foram removidas de acordo com o procedimento do fabricante e as células invasoras foram fixadas com metanol 100%. As células foram então coradas em cristal violeta 1%.

Os modelos animais

ratinhos Nu fêmea CD1

nu /nu Comprar e ratos Fox Chase SCID bege foram adquiridos de Charles River (Wilmington , MA). Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Sherbrooke.

O crescimento do tumor

: Um total de 2 x 10

6 células em suspensão em 100 ul de DMEM foram injectados no tecido subcutâneo dorsal dos ratos fêmeas com 5 semanas de idade CD1

nu /nu

. Os ratos foram sacrificados após 42 dias após a injecção de Caco-2/15 e 30 dias após a injecção de HCT116. Os tumores foram excisados ​​e pesados.

ensaios na veia da cauda experimentais:

A cauda-veia de 5 semanas de idade do sexo feminino CD1

nu /nu

ratos ou camundongos Fox Chase SCID bege foi injectado com 10

6 Caco-2 /15, ou HCT 116 células CT26 suspensas em 100 ul de DMEM. Os animais foram sacrificados em qualquer sinal de sofrimento ou perda de peso respiratória, ou depois de 14 dias após a injecção de CT26, 75 e 35 dias após a injecção de HCT116 injetados, respectivamente, no CD1

nu /nu Comprar e Fox Chase SCID bege camundongos e 60 dias após a injecção de 2-Caco /15 células injetadas em ratos Fox Chase SCID bege. Os pulmões foram mantidos em fixador de Bouin durante 24 h. lóbulos individuais foram, em seguida, foi separado e foi determinado o número total de metástases de superfície visível.

tumores humanos

Exemplos de cancros do cólon e os tecidos normais de cólon emparelhados (pelo menos 10 cm do tumor) têm foram obtidas a partir de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica. Pacientes não receberam quimioterapia neoadjuvante ou radioterapia. Os tecidos foram obtidos após consentimento informado do paciente, de acordo com o protocolo aprovado pelo Assunto Institucional Humano Review Board do Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. informações clínicas e patológicas foram obtidos a partir de registros médicos. Adenoma amostras foram endoscopicamente não operável e definido como avançado por causa de seu tamanho maior do que 1 centímetro ou pela presença de displasia de alto grau ou componente viloso. cancros do paciente foram histologicamente classificados e classificados de acordo com critérios gerais de estadiamento TNM (com base no tumor-, linfa Nó- e Metastatic- status). Todos os tecidos foram congelados em azoto líquido dentro de 15 min a partir de ressecção como recomendado pelo tumor canadense Repositório de rede (www.ctrnet.ca). Para a extracção de proteínas, tecidos emparelhados foram lisadas em tampão de amostra de Triton (NaCl 100 mM, EDTA 5 mM [pH 8,0], Tris-HCl 50 [pH 7,5], 1% de Triton X-100, 5% de glicerol, 1 mM de PMSF, ortovanadato 0,2 mM, β-glicerofosfato 40, NaF 50 mM, 2% e mistura de inibidores de protease [P 8340, Sigma-Aldrich]) e imunotransferidas como previamente descrito [22].

a apresentação dos dados

Os resultados típicos apresentados são representativos de 3 expericias independentes. As estatísticas foram calculadas usando Student dois t-teste cauda. As diferenças foram consideradas significativas para * p≤0.05 ou *** p≤0.005. análises densitométricos foram realizadas utilizando o software Image J..

Resultados

PTEN controla a polarização de células epiteliais do cólon e diferenciação

Para investigar o impacto da PTEN perda de expressão na diferenciação e polarização da células de câncer colorretal, lentivírus recombinantes que codificam hairpin RNAs curtos (shRNA) foram inicialmente desenvolvidos para suprimir de forma estável níveis de mRNA PTEN em Caco-2/15 células. Várias construções lentivirais foram testados quanto à sua capacidade de knock-down PTEN. O shRNA mais eficiente foi designado shPTEN (dados não mostrados). /15 células 2 Caco-se, doravante, infectadas com lentivírus shPTEN ou com lentivírus shGFP irrelevantes ou lentivírus que expressam um shPTEN com 3 nucleotídeos não corresponde (shMUT) como controles negativos. O vector lentiviral pLenti6-U6, que coexpresses um gene de resistência à blasticidina S, permitiu a selecção de populações puras de células transduzidas no prazo de 7 dias. Como mostrado na Figura 1A, os níveis de proteína PTEN foram quase completamente batido para baixo em 2 Caco-células /15 que expressam o shPTEN ( 90%); esta redução foi mantida durante a pós-confluência. De nota, PTEN regulação negativa foi também associada a um aumento da fosforilação de AKT, o principal efector a jusante de PI3K, confirmando que a via PI3K foi activada em células que expressam-shPTEN.

Caco-2/15 células eram infectadas com lentivírus recombinante que codifica um shRNA que bate-down especificamente PTEN (shPTEN) ou controle negativo shRNAs (shGFP ou shMUT). A e C. Após a seleção de células infectadas, Caco-2/15 foram lisadas em -2, 0, 3, 6, 9 e 12 dias pós-confluência. As proteínas foram então analisados ​​por transferência de Western. painéis B. Esquerda: Recém-confluentes Caco-2/15 células que expressam shGFP ou shPTEN foram observados por microscopia óptica. Barras de escala = 100 pm. painéis Média: Recém-confluentes Caco-2 células /15 que expressam shGFP ou shPTEN foram fixados e observada por microscopia eletrônica de transmissão. Barras de escala = 2 uM. painéis da direita: as células que expressam shGFP ou shPTEN recentemente confluentes foram observados por microscopia eletrônica de varredura. Barras de escala = 1 m.

Para analisar se PTEN tem um impacto sobre a polarização de células Caco-2/15, a morfologia das células foi examinada pela primeira vez em dias diferentes de confluência. Tal como observado por microscopia óptica, superficy celular foi significativamente aumentada em 5,3 vezes (p 0,005 analisados ​​pelo software Metamorph) em células Caco-2/15 células recentemente confluentes que expressam shPTEN em comparação com células de controlo (Figura 1B, painéis esquerdos). Além disso, a análise de microscopia eletrônica de transmissão mostraram que as células de controle recém-confluentes já tinha começado a polarizar enquanto que as células PTEN com deficiência ainda manteve uma aparência achatada (Figura 1B, painéis de média). Aos 3 dias pós-confluência, as células com expressão reduzida de PTEN só começou a polarizar, enquanto as células de controlo já tinha adquirido a sua forma cilíndrica (dados não mostrados). Down-regulação da PTEN também resultou em uma diminuição do número de microvilosidades na membrana apical da célula como observado por microscopia eletrônica de varredura (Figura 1B, painéis à direita). De nota, os níveis dos marcadores de diferenciação funcional de sacarase-isomaltase e Villin expressão foram também significativamente diminuída em células com depleção de PTEN (Figura 1C).

A seguir verificado se PTEN silenciamento altera a expressão de Hepatócito fatores nucleares 1a ( HNF1α) e 4 (HNF4α), bem como o factor relacionado com caudal homeobox transcrição 2 (Cdx2) que são conhecidos para controlar a diferenciação celular epitelial intestinal [36]. Como mostrado na Figura 1C, enquanto que os níveis de expressão foram HNF4α modestamente reduzidos em confluentes PTEN com deficiência de células Caco-2/15 células, expressão de HNF1α e Cdx2 foi marcadamente diminuída (Figura 1C). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que PTEN é importante para a polarização de células epiteliais, bem como a diferenciação morfológica e funcional de células epiteliais intestinais. É de notar que estes efeitos não parece ser uma consequência indirecta da alteração na proliferação celular desde-2 Caco /15 células que expressam shPTEN exibiu a mesma taxa de proliferação de células de controlo e parar a proliferar mais rapidamente à medida que atingiram a confluência (dados não mostrados) .

PTEN infra-regulação prejudica a integridade da junção apertada nas células epiteliais do cólon

Desde junções intercelulares são reguladores de polaridade celular [2], [5], o próximo verificados se a expressão de shPTEN teve um efeito sobre junções celulares. Sob microscopia eletrônica de transmissão, adherens junções apareceu inalterada (Figura 2A, setas) em células Caco-2/15 PTEN com deficiência enquanto junções apertadas parecia menos organizada aos 3 dias pós-confluência (Figura 2A, suportes). Por uma questão de facto, a massa não estruturada de proteínas foram sistematicamente observada sem o aperto da membrana na posição usual de junções apertadas. Por conseguinte, a função de barreira de junções apertadas também foi comprometida, como testemunhado pela diminuição da TEER medido em células que expressam shPTEN em comparação com células de controlo às 3 e 9 dias pós-confluência (Figura 2B). A fim de obter mais conhecimentos sobre a maneira pela qual PTEN controla a integridade da junção, os níveis de várias proteínas juncionais chave, tais como ocludina expressão, ZO-1 e claudinas [2] foram analisadas. a expressão da proteína de claudinas 1, 3, 4 e 8 diminuiu significativamente em ambas as células shPTEN pós-confluentes (Figura 2C) subconfluentes e. De nota, a expressão do adherens junção proteína E-caderina também foi atenuada em células shPTEN pós-confluentes (Figura 2C).

A. células Caco-2/15 que expressam shMUT ou shPTEN foram fixados após 3 dias de pós-confluência e observado por microscopia eletrônica de transmissão. Barras de escala = 500 nm. As setas indicam junções aderentes enquanto parênteses indicam junções apertadas. B. /15 células foram cultivadas em membranas porosas Caco-2, após o que a resistência transepitelial foi medida em triplicado de 3 e 9 dias após as células atingiram a confluência. *** Significativamente diferente em p≤0.005 (teste t de Student). C. Caco-2/15 células que expressam shGFP ou shPTEN foram lisadas em -2, 0, 3, 6, 9 e 12 dias pós-confluência seguido por análise de Western blot de proteínas juncionais.

Loss de expressão de PTEN em 2-Caco /15 células estimula a migração /invasão, promove o crescimento do tumor, mas não é suficiente para conferir potencial metastático

in vivo

Perda de junções intercelulares é bem conhecida por estar associada com o aumento das capacidades de migração celular e invasão [4]. Além disso, PTEN foi mostrado para controlar tais processos em outros tipos de células [11]. Utilizando os ensaios de ferida de fechamento, a migração de células de controlo recentemente confluentes foi comparada com a de populações shPTEN-expressam. Como mostrado na Figura 3A, a capacidade de expressar shPTEN-2-Caco /15 células para migrar foi marcadamente aumentada em comparação com células de controlo, tal como determinado por medição da área relativa coberta por células migrantes. Observou-se também que a sub-regulação de PTEN estimulado notadamente desprendimento de células Caco-2/15 após tripsinização (dados não mostrados). Estes dados indicam que a transcrição do gene PTEN silenciamento em células de CRC aumenta a sua capacidade de se espalhar e migrar. Desde PTEN foi mostrado para influenciar a migração através da activação das GTPases pequenas Rac1 e Cdc42 [37], que se analisou lado a respectiva expressão e a actividade foi afectada pela perda de expressão de PTEN. Tal como mostrado na Figura 3B, ambos Rac e Cdc42 apresentaram níveis ligada a GTP mais elevados em células subconfluentes e confluente shPTEN-expressam em comparação com células de controlo.

. painéis esquerdos: morfologia celular foi analisada por microscopia de contraste de fase a subconfluência. painéis direito: células recentemente confluentes expressando estavelmente shMUT ou shPTEN foram feridos e tratados com hidroxiureia 2 mM. Após 48 h, o movimento da folha coerente em toda a margem da ferida linear (linha branca) foi avaliada por microscopia de contraste de fase. O gráfico à direita ilustra a área relativa coberta por células migrantes, avaliada em 5 diferentes experiências ferida por condição usando o software Image J.. Barras de escala = 100 pm. B. níveis activados de cloridrato de rac-GTP ligado ou Cdc42 foram analisados ​​com a activação de G-LISA kits de ensaio em bioquímica subconfluentes (SC) e recentemente confluentes (C) Caco-2/15 células. C. invasão das células foi estudada usando Transwells Matrigel-revestidas. Após 48 h, as células invasoras foram fixadas, coradas com violeta de cristal a 1% e contadas. D. subconfluentes shMUT e shPTEN-expressando Caco-2/15 células foram lisadas e o ARN total isolado para expressão do gene analisado por Q-PCR. O nível relativo de cada ARN foi calculado utilizando o método de curva padrão e normalizados para o nível PDGB ARN correspondente. E. 2 × 10

6 proliferando Caco-2/15 células que expressam shMUT ou shPTEN foram injectados por via subcutânea em 5 ratinhos nus por condição. O peso do tumor foi avaliada 42 dias após a injecção. * P ≤ 0,05, *** p≤0.005, diferenças estatísticas determinada utilizando o teste t de Student.

O efeito da deficiência de PTEN na invasão também foi determinada utilizando câmaras de invasão BD Biocoat Matrigel. Como mostrado na Figura 3C, Caco-2/15 células que expressam o shPTEN claramente exibiram um aumento das capacidades invasivas em comparação com células que expressam shMUT. A invasão não só envolve repartição das junções célula-célula e aumento da motilidade de células tumorais, mas também proteólise focal da matriz extracelular. Tal como mostrado na Figura 3D, Q-PCR, análises revelaram que os níveis de metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP2 e MMP9), osteopontina (OPN) e uPA (urocinase de tipo activador do plasminogénio) de expressão foi significativamente regulada para cima no shPTEN-expressando Caco- 2/15 células.

a tumorigenicidade de Caco 2-populações de células /15 foi próxima avaliada após injecção subcutânea no flanco de ratinhos nus. Como se mostra na Figura 3E, a infra-regulação da expressão de PTEN em células Caco-2/15 células aumentou gravemente a sua capacidade de induzir tumores in vivo.

Finalmente, nós investigamos se a redução de PTEN em 2-Caco /15 células é suficiente para induzir metástases tumorais

in vivo

, através do uso de ensaio de veia da cauda metástases experimentais. ratinhos Fox Chase SCID bege injectados com controlo ou PTEN com deficiência de células Caco-2/15 células na veia da cauda não conseguiu desenvolver metástases até aos 60 dias após a injecção (dados não mostrados), indicando que PTEN regulação negativa não é suficiente para conferir um potencial metastático às células CRC bem diferenciados.

Perda de expressão de PTEN estimula a migração /invasão, aumenta o crescimento do tumor e induz potencial metastático de células HCT116

in vivo

O impacto da PTEN silenciamento também foi avaliada na linha de células desdiferenciado microssatélite instável HCT116. Nestas células, PTEN silenciamento também resultou num aumento de fosfo-Akt (Figura 4A), a capacidade melhorada de tanto a migração sobre o ferimento (Figura 4B) e invasão (Figura 4C), além de estar associada a um aumento significativo da actividade de RAC (1,5 fold, p 0,005) e expressão do OPN (1,9 vezes, p 0,005) (dados não mostrados). É de notar que os níveis de expressão de MMP-2, MMP-9 e uPA em células HCT116 de controlo já foram marcadamente elevada e PTEN silenciamento não aumentar ainda mais os níveis de mRNA de estas moléculas (dados não mostrados). A tumorigenicidade das populações de células HCT116, também foi avaliada a seguir à injecção subcutânea no flanco de ratinhos nude. Como mostrado na Figura 4D, down-regulação da expressão de PTEN em células HCT116 aumentaram a sua capacidade para induzir tumores

in vivo

.

A. As células HCT116 foram infectadas quer com lentivírus ou recombinantes que codificam shMUT shPTEN. Após selecção das células infectadas, as células em proliferação foram lisadas e a expressão da proteína foi analisada por Western blot. B. deixou painéis: A morfologia foi analisada por microscopia de contraste de fase a subconfluência. painéis direito: células recentemente confluentes foram feridos e tratados com hidroxiureia 2 mM. Após 48 h, o movimento da folha coerente em toda a margem da ferida linear (linha branca) foi avaliada por microscopia de contraste de fase. O gráfico à direita ilustra a área relativa coberta por células migrando avaliada em 5 diferentes experiências ferida por condição usando o software Image J.. Barras de escala = 100 pm. C. invasão das células foi estudada usando Transwells Matrigel-revestidas. Após 48 h, as células invasoras foram fixadas, coradas com violeta de cristal a 1% e contadas. D. 2 × 10

6 células HCT116 proliferam expressando shMUT ou shPTEN foram injectados por via subcutânea em 5 ratinhos nus por condição. O peso do tumor foi avaliada 30 dias após a injecção. * Significativamente diferente em p £ 0,05.

Finalmente, nós investigamos se a redução de PTEN em células HCT116 é suficiente para induzir metástases tumorais

In vivo

, através do uso de ensaio de veia da cauda.