Abstract

timosina β

10 (Tβ

10) regula a dinâmica de actina como um citoplasma G-proteína actina sequestro. Anteriormente, mostrámos que Tβ

10 diminui o crescimento tumoral, angiogénese, proliferação e interrompendo a actina e a inibição por Ras. No entanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e função biológica. No presente estudo, estabelecer um novo modelo de terapia genética usando um adenovírus geneticamente modificado, referido como Ad.TERT.Tβ

10, que podem sobre-expressar o Tβ

10 gene em células cancerosas. Isto foi conseguido substituindo o Tβ nativa

10 promotor do gene com o promotor TERT humana em Ad.TERT.Tβ

10. Investigou-se a actividade de supressão de cancro da Tβ

10 e descobriram que Ad.TERT.Tβ expressão específica do cancro

10 induzida notavelmente de Tβ

10, assim como a apoptose num modelo de co-cultura de ovário humano primário células cancerosas e fibroblastos normais. Além disso, Ad.TERT.Tβ

10 diminuiu potencial de membrana mitocondrial e aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Estes efeitos foram amplificados por co-tratamento com drogas anti-cancro, tais como o paclitaxel e cisplatina. Estes resultados indicam que o aumento da produção de ROS devido ao rompimento de actina por Tβ

10 superexpressão aumenta a apoptose de células de cancro do ovário humanos. De facto, a sobre-expressão específico do cancro da Tβ

10 por Ad.TERT.Tβ

10 poderia ser um valioso anti-cancro terapêutico para o tratamento de cancro do ovário, sem toxicidade para as células normais.

Citation : Kim YC, Kim BG, Lee JH (2012) timosina β

10 Expressão Motivados pela apoptose TERT Humanos promotor Provoca cancro do ovário-Specific através ROS Produção. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10.1371 /journal.pone.0035399

editor: Yoshiaki Tsuji, da Universidade da Carolina do Norte, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Dezembro, 2011; Aceito: 16 de março de 2012; Publicado em: 18 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento fonte é o governo coreano. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As timosinas são uma família de pequenas proteínas que foram originalmente isoladas a partir de timo de vitela, e estão divididos em três classes (α, p e y) com base no seu ponto de [1] isoeléctrico. As p-timosinas, que têm uma massa molecular média de proteínas ácidas aproximadamente 5 kDa, que são altamente conservados são encontrados em quase todas as células eucarióticas. As p-timosinas farpado inibir a polimerização final actina por sequestrantes monómeros de actina [2], [3]. Como um dos p-timosinas mais abundantes em espécies de mamíferos, β timosina

10 (Tβ

10) afecta a metástase e proliferação de várias células cancerosas [4] – [6]. Os efeitos anti-cancro de Tβ

10 parecem estar intimamente relacionadas com a sua função como um regulador da dinâmica de actina em células tumorais [7], [8]. dinâmica de actina pode ser perturbado pela adição de fármacos estabilizadores de actina ou a introdução de mutações, causando alterações na arquitectura celular e movimento celular interna. Além disso, relatórios recentes indicam que alterações na dinâmica de actina pode resultar na liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) de mitocôndria e subsequente morte celular, enfatizando a importância de manter a regulação dinâmica do citoesqueleto de actina [9] – [14].

recentemente, a telomerase tem sido reconhecido como um marcador tumoral de amplo espectro e é agora considerado um dos mais importantes alvos terapêuticos para o tratamento do cancro. telomerase humana transcriptase reversa (hTERT), a subunidade catalítica da telomerase, é detectada em aproximadamente 90% das células de cancro a partir de tecido de tumor, mas não é detectável em tecidos normais [15] – [17]. Estudos anteriores demonstraram que o promotor de hTERT pode regular a expressão ectópica de genes de interesse em células de cancro da telomerase-positivas, o que indica que o promotor hTERT é um candidato promissor para a geração de adenovírus específicos do cancro [18] – [22].

Aqui, nós descrevemos um adenovírus recombinante, Ad.TERT.Tβ

10, que foi construído inserindo o Tβ

10 gene sob o controlo do promotor do gene hTERT no plasmídeo p-adenovírus de transporte para induzir específico do tumor expressão Tβ

10 gene. Também estabeleceu um modelo de co-cultura de células cancerosas humanas primárias ovarianos e fibroblastos normais e, posteriormente, tratados desta co-cultura com Ad.TERT.Tβ

10 para elucidar os efeitos específicos de câncer de Ad.TERT.Tβ

10. Além disso, foi investigado o mecanismo de Tβ

10-apoptose induzida em 2774 células de cancro do ovário humano que foram tratados com Ad.TERT.Tβ

10. Estas experiências revelaram evidências de que Ad.TERT.Tβ

10 induz a expressão específica do cancro da Tβ

10, resultando em apoptose específico do cancro através da produção de ROS. Em conjunto, estes resultados indicam que a sobre-expressão específico do cancro da Tβ

10 por Ad.TERT.Tβ

10 poderia de facto ser um valioso anti-cancro terapêutico para o tratamento de cancro do ovário, sem toxicidade para as células normais e, possivelmente, outras malignidades .

Resultados

β timosina

10 é expresso em níveis baixos no cancro do ovário

em nosso estudo anterior, informamos que Tβ

10 níveis de mRNA foram elevada em ovários normais, em comparação com outros tecidos, tais como baço, timo, próstata, testículos, intestino delgado, cólon e leucócitos do sangue periférico, mas os níveis de mRNA de Tβ

10 foram reduzidos em cancros do ovário [23]. Nós, por conseguinte, confirmou os níveis de mRNA e da expressão da proteína de β timosina

10 (

10 Tβ) no cancro do ovário tipo seroso e o cancro do ovário tipo mucinoso, bem como no cancro do colo do útero e imortalizadas linhas celulares de cancro do ovário, tais 2774 como, OVCAR3, e SKOV3. Nossas descobertas que o ARNm (Figura 1A) e de proteína (Figura 1B) Os níveis de Tβ

10 foram elevados no tecido do ovário normal, mas diminuiu em todos seroso Carcinoma mucinoso Carcinoma, e as linhas de células de cancro do ovário imortalizadas, foram consistentes com nosso estudo anterior. No entanto, não fomos capazes de detectar mudanças no tecido normal cervical, adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas. Notavelmente, os niveis de expressão elevados de Tβ

10 são característicos de ovários normais, mas estes níveis diminuem em cancro do ovário, o que sugere que Tβ

10 desempenha um papel no desenvolvimento do cancro do ovário.

(A) de ARNm níveis de Tβ expressão

10 foram determinadas por PCR em tempo real utilizando ARN total isolado a partir de tecidos normais e de cancro humano, incluindo linhas de células de cancro do ovário, tais como carcinoma seroso (seroso. C) e carcinoma mucinoso (mucinoso. C), imortalizada linhas humanos ovarianos de células cancerígenas (2774, OVCAR3 e SKOV3) e adenocarcinoma (adeno. C) e carcinomas de células escamosas (epidermóide celular. c) do colo do útero. Os dados são apresentados como média ± EP para n = 3 amostras separadas de cada tipo de células de agrupamento, e é expressa em termos de percentagem de ovário normal. Diferenças significativas entre os grupos são indicados por um asterisco (*), P 0,05; dois asteriscos (**), P . 0,01 (B) O nível de expressão da proteína Tβ

10 foi determinada por imuno-histoquímica no tecido ovário normal e comparada com a de tipos serosa e mucinosos de câncer de ovário, respectivamente

Expression específico do cancro da β timosina

10 por Ad.TERT.Tβ

10

Para elucidar o papel do Tβ

10 no câncer de ovário humano, estabelecemos um novo modelo fisiológico por co-cultura de células de cancro do ovário primárias com fibroblastos normais e utilizando um sistema de entrega de genes específicos de cancro compreendendo um adenovírus geneticamente modificado. Construímos adenovírus recombinante, Ad.TERT.Tβ

10, substituindo o

10 promotor do gene Tβ com o promotor hTERT, e confirmou a integridade da Ad.TERT.Tβ

10 por reação em cadeia da polimerase ( PCR), utilizando Ad-terc, Tβ

10, e E1a iniciadores (Figura 2A). Para confirmar o nível de expressão Tβ

10 genes, foram tratados com 2774 células Ad.TERT.Tβ

10 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 e, em seguida, monitorizadas alterações na Tβ

10 usando expressão imunocitoquímica (ICC) e RT-PCR. Os nossos resultados mostraram que Ad.TERT.Tβ

10 elevado Tβ

10 expressão no citosol (Figura 2B).

(A) Diagrama esquemático do adenovírus recombinante, Ad.TERT.Tβ

10, gerado por recombinação de pSuttle.TERT.Tβ

10 e do plasmídeo de esqueleto pAdEasy-1 em BJ5183. O plasmídeo pShuttle modificada, referida como pSuttle.TERT.Tβ

10, foi clonado por inserção do promotor ordenada TERT humana e Tβ

10 genes para gerar um adenovírus recombinante. A integridade da Ad.TERT.Tβ

10 foi determinado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando primers Ad-TERT, Tβ

10, e E1a. (B) subconfluentes 2774 células de câncer de ovário foram infectadas com 10 MOI de Ad.TERT.LacZ ou Ad.TERT.Tβ

10. Após 24 h, Tβ

10 proteína e níveis de ARNm foi determinada por imunocitoquímica e RT-PCR, respectivamente. (C) subconfluentes de células humanas primárias de cancro do ovário co-cultivadas com células de fibroblastos foram expostos a 10 MOI de Ad.TERT.LacZ durante 7 dias. β-galactosidase nível de expressão foi determinado por coloração com β-gal (cor azul). Seta no centro da figura indica uma massa de células de cancro do ovário primário. (D) subconfluentes de células humanas primárias de cancro do ovário co-cultivadas com células de fibroblastos foram também expostas a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ

10 durante 24 h.

nível 10 expressão Tβ foi determinada por imunocitoquímica (cor verde). Setas na parte inferior da figura indicam células de cancro do ovário primárias.

Nós indução de cancro seletivo também avaliou da expressão gênica por adenovírus recombinantes, Ad.TERT.Tβ

10 e Ad.TERT.LacZ , no nosso modelo de co-cultura de células de cancro do ovário primárias e fibroblastos normais. No dia 7 após o tratamento com 10 MOI de Ad.TERT.LacZ, observou-se que as células de cancro do ovário tinha crescido bem sobre a camada formada pelas células de fibroblastos normais como sendo observada no grupo não tratado. Além disso, as células X-gal positivos, indicando expressão β-galactosidase por Ad.TERT.LacZ, foram detectadas apenas em células de cancro do ovário primárias (Figura 2C). No dia 1 após o tratamento com Ad.TERT.Tβ

10, a fluorescência verde, indicando Tβ

10 expressão, foi detectada em células de cancro do ovário primários mas não em células normais de fibroblasto (Figura 2D), sugerindo que o promotor TERT confere expressão de genes específicos do câncer de ovário.

efeitos da timosina β

10 no ovário migração cancer Cell

relatórios anteriores demonstraram que os efeitos anti-câncer de Tβ

10 estão estreitamente relacionado com o seu papel na regulação da dinâmica de actina em células tumorais [7], [8]. Nós, portanto, examinou o papel de Tβ

10 na migração de células cancerosas e invasão. Descobrimos que tanto a migração de células de cancro e invasão foram significativamente diminuída nas células infectadas por Ad.TERT.Tβ 2774

10, em comparação com células infectadas com 2774 e 2774 Ad.TERT.LacZ células não infectadas (Figura 3A). Em relação à migração celular, movimento celular foi também avaliado pelo ensaio de cicatrização da ferida. 2774 motilidade celular em uma superfície de plástico foi significativamente reduzida por Ad.TERT.Tβ

10 tratamento (Figura 3B).

(A) subconfluentes de 2774 células de cancro do ovário humanos foram infectadas com 10 MOI de Ad.TERT .LacZ ou Ad.TERT.Tβ

10 para 12 horas. Depois de re-suspensão, as células foram ainda incubadas durante 12 horas na câmara superior de uma placa de TRANSWELL® revestida com uma monocamada de colagénio para o ensaio de migração ou com dupla camada de colagénio e Matrigel para o ensaio de invasão. Os resultados são expressos como uma percentagem do controlo de veículo e são a média ± SE (barras) de três experiências. diferenças significativas em relação ao grupo de controlo de veículo são indicados por um asterisco (*), P 0,05; um asterisco duplo (**), P 0,01 (B) As células infectadas com vírus também foram ainda incubadas em 35 milímetros μ-louça, de baixo, com uma cultura de Inserção (Ibidi) durante 12 horas, e seguido por observação de a direção ea velocidade da migração celular durante a cicatrização de feridas. Os resultados para cicatrização de feridas são expressos como uma percentagem do controlo de veículo e são a média ± SE (barras) de três experiências. diferenças significativas do grupo de controlo do veículo são indicados por um asterisco duplo (**), P . 0,01

indução de apoptose específica do cancro por Ad.TERT.Thymosin β

10

Para examinar os efeitos da superexpressão de Tβ

10 sobre a viabilidade da célula cancerosa, confluentes 2774 células de câncer de ovário foram infectados com Ad.TERT.LacZ ou Ad.TERT.Tβ

10 a uma MOI de 10, e MTT-bioensaio foi realizado diariamente durante 6 dias. Descobrimos que Tβ

10 diminuiu significativamente a viabilidade das células de cancro do ovário, quando comparado com os controles de mídia com ou sem Ad.TERT.LacZ (Figura 4A). Em seguida, para verificar se o decréscimo na viabilidade celular foi devido a apoptose, foi realizada a análise de FACS de anexina V-FITC e descobriram que a sobre-expressão de Tβ

10 induziu apoptose, mas não a necrose, na linha 2774 de células de cancro do ovário (Figura 4B). Além disso, no dia 1 após o tratamento de Ad.TERT.Tβ

10 fragmentação nuclear no modelo de co-cultura de cancro do ovário humano primário com fibroblastos normais, que claramente observado (Fluorescência azul) apenas em células de cancro do ovário que sobre-expressa Tβ

10 (fluorescência verde). Além disso, não fomos capazes de detectar a fragmentação nuclear ou Tβ

10 expressão acima dos níveis de fundo o fibroblasto normal. Estes resultados indicam que a sobre-expressão específico do cancro da Tβ

10, o que é facilitado pelo promotor TERT, estimula a fragmentação nuclear específico do cancro como uma das características morfológicas de apoptose (Figura 5A). Além disso observou-se que golpeia alterações morfológicas das células de cancro do ovário tratados com Ad.TERT.Tβ

10 para mais de 90 horas usando um microscópio de imagem em tempo real. Após 10 horas de tratamento com Ad.TERT.Tβ

10, foram observadas mudanças morfológicas apoptóticas típicas nas células de cancro do ovário, tais como formação de bolhas de membrana de plasma, perda de interacções célula-célula, vacuolização citoplasmática, e encolhimento da célula devido ao rápido desidratação. células em apoptose desapareceram gradualmente por morte celular, enquanto que as células fibroblásticas normais parecia ser afetado por Ad.TERT.Tβ

10 para mais de 90 horas (Figura 5B; Filme S1)

(A) subconfluentes 2774 ovário. as células cancerosas foram mantidas durante 5 dias em meio de cultura completo contendo Ad.TERT.LacZ ou Ad.TERT.Tβ

10, a uma MOI de 10 ou 100, e o MTT-bioensaio foi realizado diariamente. (B) No segundo dia após a infecção virai, A /iodeto de propídio ensaio FACS com Anexina V (PI) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Clontech). gráficos de dispersão representativos estão mostrando a distribuição de V- anexina e as células marcadas com PI. Em painéis de topo, o eixo X (FL1-H) indica anexina V-FITC da fluorescência detectada a 518 nm, e o eixo Y (FL2-H) indica fluorescência de PI detectado a 620 nm. Como o quadrante inferior esquerdo (LL) indica células vivas, no canto superior esquerdo (UL) quadrantes indicam células necróticas, no canto superior direito (UR) parcelas indicam células tarde apoptóticos, e inferior direito (LR) quadrante indica primeiras células em apoptose (painéis superiores) , os resultados são expressos como uma percentagem do número total de células e são a média ± sE (barras) de três experiências individuais. diferenças significativas em relação ao grupo de veículo são indicados por um asterisco (*), P 0,05; dois asteriscos (**), P . 0,01

(A) co-culturas de células confluentes primárias humanas do cancro do ovário e fibroblastos foram expostos a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ

10 durante 24 h, e, em seguida, foi realizada a imunocitoquímica para observar as alterações morfológicas nucleares induzidas por Tβ

10 expressão. contraste de interferência diferencial de imagem (DIC) foi fundido com 4,6-diamidino-2-phenylindole coloração (DAPI) (azul) e Alexa 488 coloração (verde) para avaliar a fragmentação nuclear por Tβ

10 expressão. As setas indicam as fragmentações nucleares. (B) As células co-cultivadas subconfluentes primárias humanas do cancro do ovário e fibroblastos foram expostos a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ

10 para mais de 90 horas, e, em seguida, as alterações morfológicas foram observadas utilizando um sistema de imagem em tempo real. As setas brancas indicam características selectivas morfológicas de apoptose, tais como a formação de bolhas de membrana plasmática da célula, vacuolização citoplasmática, e encolhimento da célula (após 10 h), seguido de perda de interacções célula-célula (após 15 h). E setas pretas rastreamento um dos fibroblastos indicam que os fibroblastos estão se movendo ativamente sobre o mesmo até 90 horas.

A relação entre β timosina

10 e Fas Expressão

Para examinar se ovário apoptose específica do cancro é devido à expressão de genes de promoção de apoptose e a subsequente transdução de sinal, foi avaliada a expressão Fas e caspase 3 activação utilizando células cancerosas do ovário primários co-cultivadas com fibroblastos normais, bem como a linha celular de cancro do ovário 2774. Descobrimos que Ad.TERT.Tβ

10 induzida de mRNA de Fas e a expressão da proteína em células de cancro do ovário 2774 (Figura 6A). No modelo de co-cultura primária, a expressão de Fas foi detectada em células de cancro do ovário primários mas não em fibroblastos normais. Estes resultados são consistentes com a expressão específica do cancro da Tβ

10 após a infecção com Ad.TERT.Tβ

10 (Figura 6B). Importante, Tβ

10 aumentou a actividade da caspase 3 como fizemos citocalasina D (Cit D), um potente inibidor da polimerização de actina. O aumento da actividade da caspase 3, foi também inibida pela adição do inibidor de caspases Z-VAD-FMK. Além disso, estes dados são consistentes com os resultados de viabilidade celular obtidos a partir do ensaio de azul alarmar (Figura 6C).

(A) subconfluentes de 2774 células de cancro do ovário humano foram expostas a Ad.TERT.LacZ ou Ad.TERT. Tβ

10 a uma MOI de 10 durante 48 h e seguida por experiências seguintes, tais como RT-PCR e transferência de Western para detectar a FAS (CD95) de ARNm e expressão de proteína, respectivamente. (B) células humanas primárias subconfluentes de cancro do ovário co-cultivadas com fibroblastos também foram expostos a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ

10 durante 24 h e seguida por imunocitoquímica. Específica coloração de anticorpos FAS /CD95 (Alexa 488, verde) foi fundido com contraste de interferência diferencial (DIC) imagens e imagens de coloração nuclear (DAPI, azul) usando software de imagem. Branco e setas laranja indicam fibroblastos e células de cancro do ovário, respectivamente. (C) As células foram expostas a Ad.TERT.LacZ ou Ad.TERT.Tβ

10 a uma MOI de 10 com ou sem inibidor de caspase (zVAD, 40 | iM), e inibidor da polimerização de actina (citocalasina D, 1 ug /ml) durante 48 h. Os 2774 células de câncer de ovário foram então coradas de acordo com a caspase 3 protocolo kit de ensaio comercial (Thermo) e fotografada usando um leitor de Thermo Scientific Cellomics ArrayScan alto teor de triagem (HCS). No gráfico de barras, os valores que representam uma percentagem do controlo de veículo é seguido pela razão entre a área de activação de caspase 3 e a área do núcleo. E os resultados são a média ± SE (barras) de três experiências diferentes. diferenças significativas em comparação com grupo de veículo são indicados por um asterisco duplo (**), P 0,01 (gráfico de barras à esquerda). Citotoxicidade nas mesmas condições foi determinada em células de cancro do ovário em cultura utilizando o ensaio de azul (AB) Alamar como um

In vitro

modelo alternativo. Os resultados são expressos como uma percentagem do controlo de veículo e são a média ± SE (barras) de três experiências. diferenças significativas em relação ao grupo de controlo de veículo são indicados por um asterisco (*), P 0,05; dois asteriscos (**), P 0,01 (gráfico de barras à direita)

Os Efeitos da timosina β

10 na Disfunção Mitocondrial e ROS Produção

relatórios anteriores indicaram que a ruptura do citoesqueleto de actina extracelular induz a geração de ROS, em particular S

2

-, que amplifica a apoptose Fas-dependente [13], [24]. Além disso, a diminuição da dinâmica de actina causa despolarização da membrana mitocondrial e um aumento na produção de ROS, o que resulta na morte da célula [14]. Tomados em conjunto, a hipótese de que a inibição da polimerização da actina por Tβ

10 abre poros da membrana mitocondrial ou canais durante um tempo prolongado, o que resulta na redução do potencial de membrana mitocondrial (MMP) e um aumento na libertação de ROS para o citoplasma. Portanto, medimos mudanças

10-Tβ induzidas nos níveis de MMP ROS e descobriram que inicialmente elevados níveis de MMP foram marcadamente diminuída por Tβ

10 superexpressão (Figura 7A). Além disso, a produção de ROS foi aumentada por Tβ

10 sobre-expressão, o que é consistente com o resultado do ensaio biológico de MTT.

(A) células foram expostas a Ad.TERT.LacZ (MOI 10), Ad. TERT.Tβ

10 (10 MOI), e inibidor da polimerização de actina (citocalasina D, 1 ug /ml) durante 48 h, e, em seguida, um potencial de membrana mitocondrial (MMP) ensaio foi realizado. O ensaio de MMP foi realizada utilizando o protocolo do kit de ensaio de MMP (Thermo), e os resultados foram visualizados utilizando um leitor de Thermo Scientific Cellomics ArrayScan elevado teor de triagem (HCS). (B) As células foram expostas a Ad.TERT.LacZ (MOI 10), Ad.TERT.Tβ

10 (10 MOI) com ou sem agentes anti-cancro, tais como o paclitaxel (Taxol, 5 ug /ml) e cisplatina (platina, 10 ug /ml), durante 48 h. Os resultados foram comparados com os de outros tratamentos, por exemplo, cada agente anti-cancro ou inibidor de polimerização de actina (citocalasina D, 1 ug /ml). Os níveis de espécies reactivas de oxigénio intracelulares (ROS) foi detectada por um sistema ELISA de fluorescência com a sonda fluorescente sensível a oxidação de 2, 7-diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA). Para além do ensaio de ROS, um ensaio de MTT-bio também foi realizado nas mesmas condições. Os todos os resultados são expressos como uma percentagem do controlo de veículo e são a média ± SE (barras) de três experiências. diferenças significativas em relação ao grupo de controlo de veículo são indicados por um asterisco (*), P 0,05; um asterisco duplo (**), P . 0,01

Tem sido relatado que os níveis de ROS celulares aumentar sob condições de stress, por tratamento com agentes anticancro tais como taxol (paclitaxel) e de platina (cisplatina) . Este aumento de ROS leva à indução de moléculas pró-apoptóticas, tais como p53 e proteínas quinases activadas por mitogénio (MAPKs), que conduz a apoptose celular [25] – [30]. Utilizou-se Ad.TERT.Tβ

10 como um co-tratamento com as duas classes de agentes anticancerígenos, e descobriram que o co-tratamento resultou em efeitos sinérgicos, aumentando a produção de ROS e diminuindo a viabilidade das células (Figura 7B). Estes resultados sugerem que a apoptose induzida por câncer de ovário por Tβ

10 superexpressão é devido à produção de ROS em resposta à diminuição da MMP.

Discussão

Entre os membros da família SS-timosina, timosina beta

4 (Tβ

4), ß timosina

10 (Tβ

10) e timosina

15 (Tβ

15) foram estudados na carcinogênese. Eles têm sido implicados no sequestro de actina. No entanto, a função da p-timosinas é em grande parte desconhecida, e o seu papel na progressão da doença neoplásica permanece controverso.

A expressão elevada de Tβ

4 e Tβ

10 tem sido considerada como uma característica de carcinogênese humana. A sobre-expressão de Tβ

4 ocorre numa grande variedade de carcinomas humanos. Tβ

4 afeta a migração de células angiogênese e cancro em muitos tipos de células de câncer [31] – [34]. Da mesma forma, a sobre-expressão de Tβ

10 tem sido descrita em numerosas carcinomas humanos, incluindo melanomas [1], carcinomas de rim, pâncreas [35], e estômago [36], bem como carcinomas medulares [37].

Paradoxalmente, Tβ

4 e Tβ

10 podem estar envolvidos na degeneração câncer, como os relatórios indicaram que Tβ

4 tem tumorais efeitos supressores em mieloma [38], e Tβ

10 é desregulamentado no carcinoma de células renais [39] e do ovário [40]. Além disso, Tβ

10 migração celular inibida e formação do tubo capilar-como de células endoteliais de artérias coronárias humanas [6]. Nossos resultados também implicam Tβ

10 na degeneração câncer, como o alto nível de Tβ

10 transcrições em ovário normal foi notavelmente reduzida em carcinomas ovarianos. Além disso, a expressão ectópica de Tβ

10 em linhas celulares de carcinoma do ovário, diminuição da proliferação celular e movimento, e a apoptose foi acelerada. Assim, Tβ

10 sobre-expressão em células de ovário normais parece actuar como um regulador negativo da carcinogénese, embora o mecanismo exacto é incerto. No entanto, como Tβ

4 é induzida no cancro do ovário [34] e desempenha um papel no sequestro de actina como Tβ

10, a expressão ectópica de Tβ

10 no nosso sistema experimental pode conduzir a um aumento da actividade de SS- timosinas e subsequente perturbação da dinâmica de actina. Este conceito é apoiado por relatórios que Tβ

4 e Tβ

10 agir sobre o desenvolvimento dos vasos de modo complementar in vivo [6] e que o desequilíbrio do G-actina e F-actina faz com que células arredondamento e da morte [41 ]. Assim, considerou-se uma possível estratégia para a investigação do cancro e terapia gênica com Tβ

10. Nós, portanto, fabricado um adenovírus recombinante, Ad.TERT.Tβ

10, a ser usado para a terapia genética humana e para elucidar o mecanismo de Tβ

10 na prevenção do câncer de ovário.

sistemas de adenovírus recombinante são versáteis para estudos de expressão gênica e aplicações terapêuticas, e muitos pesquisadores usaram adenovírus recombinantes com grande sucesso ao longo dos anos. No entanto, a sua baixa especificidade é uma desvantagem que limita a utilidade destes vectores como

in vivo

agentes terapêuticos. Os vectores que combinam elevada infecciosidade com a expressão específica de célula do cancro são, por conseguinte, necessário. Vários estudos têm demonstrado que a telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) é altamente expressa na maioria dos tecidos tumorais, mas não em tecidos normais. Por exemplo, a actividade do promotor hTERT é mais elevada em células de cancro humanas e de murino derivadas de pulmão, do cólon, do fígado, da mama, do ovário, do cérebro e [42] – [47]. Por outro lado, eles têm mostrado que o promotor de hTERT é inactivo em fibroblastos humanos normais [42], e células epiteliais humanas normais a partir de traqueia [42], mamaria [47], e dos ovários [45], [48]. Por isso, nós examinamos o papel de Tβ

10 em cancro do ovário usando um adenovírus recombinante (Ad.TERT.Tβ

10). Ad.TERT.Tβ

10 foi construído por inserção do

10 Tβ gene sob o controlo do promotor de hTERT no plasmídeo de adenovírus p-transporte para se obter a expressão específica do cancro, e que foi comparado com Ad.TERT .LacZ como um controlo. Em um modelo de co-cultura de células primárias humanas do cancro do ovário e fibroblastos normais, β-galactosidase dirigido pelo promotor de hTERT foi expressa em células de cancro do ovário apenas, mas não em fibroblastos normais. alterações morfológicas apoptóticas e citotóxicas estavam ausentes os fibroblastos normais tratados com 10 MOI de Ad.TERT.LacZ ao longo de um período de 7 dias, em contraste com a apoptose específica do cancro do ovário induzida por tratamento de células com 10 MOI de Ad.TERT. Tβ

10 ao longo de um período de 10 horas. Além disso, descobrimos que a expressão específica do cancro da Tβ

10 a partir Ad.TERT.Tβ

10 foi acompanhada pela expressão elevada de Fas, resultando em apoptose específica do cancro. Por conseguinte, considerou-se que o efeito anti-cancerígeno de Ad.TERT.Tβ

10 pareceu estar associado com a sobre-expressão de Tβ

10 em vez de toxicidade virai não-específica.

Estudos anteriores relataram que um nível elevado de ROS tem um efeito positivo sobre o desenvolvimento do cancro e a proliferação [49] – [56]. No entanto, descobrimos que o sequestro de actina pela superexpressão de Tβ

10 foi devido à disfunção mitocondrial e elevação ROS, pelo qual apoptose sinalização foi ativado. A ideia de que as células cancerosas são vulneráveis ​​ao ataque por ROS é suportada pela utilização terapêutica de fármacos anti-cancerígenos amplamente aceites, tais como o taxol e cisplatina. Ambas estas drogas aumentam a produção de ROS em 2774, e co-tratamento de agentes anticancerígenos com Tβ

10 resultam em um efeito aditivo da elevação ROS e posterior indução de apoptose. Portanto, o destino da célula do cancro parece ser determinada pelo equilíbrio ROS. elevação discreta de ROS pode ajudar o desenvolvimento do câncer, mas a elevação ROS excessiva em células de câncer em algumas tensões, como Tβ

10 superexpressão e tratamento de drogas anticâncer parece estimular sinais apoptóticos.

Além de indução de apoptose , Tβ

10 superexpressão potente mobilidade reduzida nas 2774 células de cancro do ovário, e este efeito foi independente da indução de apoptose. Nos 2774 células de cancro do ovário, a apoptose foi induzida muito mais tarde do que em células de cancro do ovário primários. Ad.TERT.Tβ

apoptose em células de cancro do ovário primários 10-induzida e imortalizado linhas celulares de cancro, tais como 2774, OVCAR3 e SKOV3, ocorreu de 10 e 48 horas mais tarde, respectivamente. Como os ensaios de invasão e de migração foram realizadas antes da observação de apoptose, sugerimos que Tβ

10 sobre-expressão em cancro do ovário pode ter efeitos benéficos que matam células de células de tumor primário bem como células metastáticas.

os nossos resultados indicam que a actividade anti-cancro de Tβ

10 pode ser devido a geração de ROS. Além disso, sub Tβ

10 e anti-cancro, agentes tais como o taxol e cisplatina, tiveram um efeito sinérgico sobre a morte de células de cancro. Descobrimos também que a sobre-expressão específica do cancro da Tβ

10 conduzido pelo promotor hTERT resultou em apoptose câncer seletivo através da amplificação da sinalização FAS. Este estudo fornece insights sobre o mecanismo subjacente os efeitos anti-câncer de Tβ

10 no ovário, o que pode ser útil para o desenvolvimento de terapias eficazes de câncer de ovário sem efeitos colaterais.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

os trabalhos utilizando amostras humanas foram recebidos a autorização por escrito de um paciente e aprovado pela Associação coreana de revisão Institucional Board (KAIRB).

Linhas de células e Cultura de células primárias

a linha de células de cancro do ovário humano 2774 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e células de cancro do ovário e de fibroblastos humanos primários foram isolados a partir de doentes com adenocarcinoma do grau III endometrióide (cancro) e co-cultivadas em superfícies de vidro. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nova Iorque, EUA), e 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen ).

vectores virais

o adenovírus recombinante, “Ad.TERT.Tβ

10″, foi construído de acordo com o procedimento padrão utilizado na ™ adenoviral Vector System AdEasy (Stratagene, La Jolla, CA, EUA).