Abstract

A indução de poliploidia é considerado o fim de reprodução de células, mas há evidências de que as células cancerosas gigante poliplóides (PGCCs) contribuir para o repovoamento celular durante a reincidência do tumor. No entanto, o papel destas células no desenvolvimento, progressão e resposta à terapia no cancro do cólon permanece indefinida. Portanto, o principal objetivo deste estudo foi investigar a geração de PGCCs em células de câncer de cólon e identificar mecanismos de formação. O tratamento de células Caco-2 do cancro do cólon com a hipóxia HCT-116 e imitar CoCl

2 induziu a formação de células com maior tamanho celular e nuclear (PGCCs), enquanto que as células com morfologia normal foram eliminados selectivamente. análise de citometria mostrou que CoCl

2 tratamento G2 induzida paragem do ciclo celular e a geração de uma subpopulação de células poliplóides com aumento do conteúdo de ADN celular. Poliploidia de PGCCs induzida por hipoxia foi confirmada por análise de FISH. Além disso, CoCl

2 tratamento eficazmente induzida a estabilização de HIF-1α, a expressão diferencial de uma forma truncada de p53 (p47) e diminuição dos níveis de ciclina D1, que indica mecanismos moleculares associados a paragem do ciclo celular em G2. Geração de PGCCs também contribuiu para a expansão de uma subpopulação de células com cancro de células estaminais características (CSCs), como indicado por ensaios de formação de colonosphere, e reforçada quimiorresistência de 5-fluorouracil e oxaliplatina. Em conclusão, a indução farmacológica de hipoxia em células de cancro do cólon provoca a formação de PGCCs, a expansão de uma subpopulação de células com características CSC e quimioresistência. Os mecanismos moleculares envolvidos, incluindo a estabilização de HIF-1 α, o envolvimento de p53 isoforma /p47 e parada do ciclo celular em G2, sugerem novos alvos para evitar a reincidência do tumor e falha do tratamento de câncer de cólon

Citation.: Lopez-Sanchez LM, Jimenez C, Valverde A, Hernandez V, Peñarando J, Martinez A, et al. (2014) CoCl

2, um mímico de hipóxia, Formação Induz de células poliplóides gigantes com Características-tronco no câncer de cólon. PLoS ONE 9 (6): e99143. doi: 10.1371 /journal.pone.0099143

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de março de 2014; Aceito: 09 de maio de 2014; Publicação: 16 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lopez-Sánchez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos no manuscrito

Financiamento:. Apoiado por subsídios para A.R.-A. do Programa de Promoción de la Investigación en Salud del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00428 e PI13 /00553) (https://www.isciii.es/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o segundo câncer mais comum com 1,234,000 casos em todo o mundo em 2008, de acordo com GLOBOCAN [1]. CRC é responsável por 13% de todos os cancros e quase 1000 novos casos de CRC foram diagnosticados em 2012 na Europa [2], onde é o terceiro tipo de câncer mais frequente e depois do câncer de pulmão é a segunda causa mais frequente de morte [3]. Embora as taxas de mortalidade por CRC diminuíram ligeiramente desde 1990 até ao presente, e apesar dos avanços na detecção e tratamento cirúrgico, não há nenhuma cura conhecida para câncer colorretal metastático, ea taxa de sobrevida em 5 anos desses pacientes é extremamente reduzida (cerca de 8%) . A existência de um relativamente raro lentamente proliferando ou descansando subpopulação de células, altamente resistente a drogas, com propriedades semelhantes às células-tronco e conhecidas como células-tronco cancerosas (CSCs), tem sido proposto como uma das principais causas da ineficiência alarmante de terapias contra o câncer padrão [ ,,,0],4], [5]. Durante a última década, tem sido demonstrado que estes CSCs são capazes de proliferar e produzir toda a massa tumoral. Isto levou a propor o modelo de CSCs, ou modelo hierárquico do tumor, em que as células tumorais são heterogéneas, e somente uma população de células pequenas, que está no topo da pirâmide hierárquica, é responsável por iniciar e manter o crescimento tumoral [5] . No entanto, estudos mais recentes sugerem que stemness câncer pode ser adquirida por mudar de programa de expressão gênica e, portanto, CSC biologia deve mudar a partir de uma hierárquica rígida para um modelo mais flexível [6], [7]. CSCs são muito mais resistentes do que as células de tumor diferenciado ao terapias que são usados ​​em clínica [4], [8] e, embora o tratamento é capaz de remover eficazmente a maioria das células tumorais e o volume do tumor diminui, CSCs são não afectados e uma vez a terapia pára eles são capazes de retomar o crescimento do tumor e diferenciação, explicando eventos a recidiva do tumor. Assim, foi demonstrado que o risco de recorrência de CRC é proporcional à expressão no tumor primário de genes específicos para as células-tronco intestinais que também identificar uma população de CSC no tumor [9]. Além disso, os CSCs parecem desempenhar um papel importante no processo de difusão, dormência tumoral e metástase [10].

A hipoxia é uma das características patológicas mais importantes dos tumores sólidos, uma vez que é o resultado de um desequilíbrio entre a proliferação de células tumorais e o fornecimento de oxigénio [11]. Hipoxia tumor não só representa um problema grave que afecta os esforços terapêuticos, mas não há evidências experimentais que constitui uma pressão selectiva fisiológico promover a agressividade do tumor [12]. Importante, a hipóxia está associado com a manutenção e a formação de CSCs [11], [13], promovendo o seu fenótipo e tumorigénese [14]. Muitas das respostas celulares a hipóxia são mediadas através de mudanças na expressão gênica regulados pelo fator de hipóxia indutível (HIF-1α), que se tornou um alvo muito atraente para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer [11]. Sob condições de normóxia proteína HIF-1α é continuamente degradados após hidroxilação por hidroxilases prolil de dois resíduos de prolina-chave no seu domínio de degradação dependente de oxigénio [15]. No entanto, sob condições de hipoxia HIF-1α é estabilizado, se transloca para o núcleo e, após ligação a subunidade HIF-1β, constitui um factor de transcrição activa capaz de activar a expressão de genes alvo facilitar a adaptação à hipoxia celular [13]. cloreto de cobalto (CoCl

2) é utilizado um agente mimético

In vitro

para induzir respostas celulares mediadas por hipoxia. Acredita-se que CoCl

2 estabiliza HIF-1α pela inibição de enzimas prolil-hidroxilase [16].

tem sido sugerido que, de forma semelhante às células estaminais normais, o microambiente local é crítico para a manutenção da sobrevivência de CSCs em seu “nicho” onde a recepção dos sinais moleculares específicos regular a sua proliferação e diferenciação [17]. Surpreendentemente, apesar de vários estudos demonstraram recentemente um papel importante de células endoteliais (ECS) e nicho perivascular na regulação das células-tronco normais e CSCs, outros estudos indicam que a hipóxia também desempenha um papel fundamental [17]. A importância de um nicho perivascular na regulação CSCs por um lado, eo papel da hipóxia na outra pode parecer à primeira vista paradoxal. No entanto, a ECS no microambiente tumoral pode sofrer alterações funcionais que levam à geração de um ambiente hipóxico. Assim, os CSCs glioblastoma são encontrados em contacto íntimo com a vasculatura do tumor aberrante [18]. Recentemente, foi relatado que a hipóxia pode seleccionar células poliplóides cancerosas gigante, (PGCCs) que contribuem activamente para o crescimento do tumor por CSCs gerando [19]. Na verdade, a maioria dos tumores humanos são celular heterogénea [20], e para mais de um século, os patologistas observaram tumores de células gigantes, significativamente mais frequentemente após algum tipo de intervenção terapêutica [19]. Estas células contribuir para a heterogeneidade do tumor, mas a maioria das suas funções ainda não está definida. Embora a indução de poliploidia tem sido tradicionalmente considerado o fim de reprodução das células, há evidências de que as células gigantes contribuir para repovoamento celular durante a recorrência do tumor [21], [22].

Embora não existem dados sobre a geração de PGCCs em cancro do ovário e da mama, do papel destas células no desenvolvimento, progressão e resposta a terapia em CRC ainda permanece indefinida. Portanto, o principal objetivo deste estudo foi investigar a

in vitro

geração PGCCs em células cancerígenas do cólon e identificar mecanismos de formação.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e colonosphere ensaio de formação de

Caco-2 células (ECACC, Salisbury, Reino Unido) foram cultivadas em MEM com sais de Earle (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) contendo soro fetal bovino a 15%. HCT-116 células (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Biowest, Nuaillé, França) contendo 10% de soro bovino fetal (PAA Laboratories). Os meios de cultura foram suplementados com glutamina 2 mM, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml) e anfotericina B (2,5 ug /ml). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2. Uma solução fresca de estoque 0,4 M de cloreto de cobalto (CoCl

2) foi preparada em água e adicionado ao meio para se obter as concentrações finais desejadas.

Para o ensaio de formação de colonosphere, após tratamento com diferentes doses de CoCl

2 durante 48 h, as células foram tripsinized, contadas e re-semeadas a uma densidade clonal (1 célula /ul) em 96 poços da placa com a superfície de ultra-baixo de fixação (Costar, Corning, NY, EUA) com soro livre de MEM de Dulbecco Nutrient Mixture F + 12 meio de Ham suplementado com 10 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico ml, 20 factor de ng /mL de crescimento epidérmico e 1% v /v de metilcelulose (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) para impedir a agregação de células. Os suplementos foram adicionado de fresco a cada 2-3 dias e o número e tamanho de colonospheres formados foram avaliadas por microscopia óptica no dia 7 após a sementeira. colonospheres secundários foram formadas a partir da população de células obtidas após a desagregação tripsina-EDTA de esferas primárias e semeadas a uma densidade clonal e cultivadas como descrito acima. Para obter um número de células suficientes para a formação de colonosphere secundário, colonospheres primárias foram semeadas durante 7 dias em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação.

Western Blotting

Depois de 6 e 48 h de tratamento, As células cultivadas foram recolhidas com PBS frio e centrifugadas a 300 x g, 4 ° C durante 5 minutos. O sedimento de células foi incubada durante 15 minutos em gelo com 1 ml de tampão de lise (Tris-HCl a 50 (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM etilenoglicol ácido tetraacético (EGTA), 1,5 mM MgCl

2, 10% de glicerol, 1% de NP40, 0,1 M de ditiotreitol (DTT), 0,1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1% v /v de cocktail inibidor de protease (serva, Heidelberg, Alemanha) e 1% v /v cocktail inibidor de fosfatase 2 e 3 (Sigma-Aldrich) e centrifugou-se a 15000 × g durante 15 minutos a 4 ° C. a concentração total de proteína foi quantificado por um ensaio de Bradford padrão usando o reagente colorimétrico de BioRad Laboratories (Hercules, CA, EUA). proteínas (12,5 ug) foram separadas em géis de poliacrilamida com SDS, utilizando um gradiente de 4-12% de gel de Bis-Tris no Sistema Critério BioRad e transferido para uma membrana de nitrocelulose (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA). em seguida, as membranas foram bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente com leite magro a 5% em solução salina Tris-tamponada com 0,2% de Tween-20, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre, e a detecção por reacção quimioluminescente com o sistema de detecção ECL Além disso Western Blotting ou ECL antecedência Ocidental Kit Blotting Detection (GE Healthcare Life Sciences, fonte Pouco desa-, UK). As imagens foram capturadas num XRS ChemiDoc Imaging System (BioRad Hercules, CA, EUA) e análise densitométrica das bandas de proteína detectadas foram realizadas com o software de imagem-J (NIH)

Os anticorpos utilizados foram como se segue:. Monoclonal anti HIF-1a, policlonal anti-p53 e anti-actina policlonal e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Monoclonal anti-ciclina D1 foi de Cell Signaling (Beverly, MA, EUA).

proliferação celular

As células foram semeadas em placas de 96 poços (4.000 células /poço) e tratou-se com CoCl

2 tal como descrito acima. Depois de 48 h de tratamento, as células foram então expostas durante 72 horas a diferentes doses de 5-fluorouracilo ou a proliferação e oxaliplatina celular foi ensaiada utilizando o kit XTT Ensaio de Proliferação celular (Roche, Basileia Suiça.) Seguindo as instruções do fabricante. Durante o ensaio, XTT sal de tetrazólio é reduzida para um corante de cor laranja formazano por desidrogenases e enzimas redutases em células metabolicamente activas, que foi detectado espectrophotometrically (450 a 655 nm) utilizando um leitor de microplacas ImarkTM (Biorad, Hercules, CA, EUA). Em cada ensaio, a proliferação de células foi expresso como a percentagem de células não tratadas.

análise do ciclo celular

Células (0,5-1 × 10

6 células) foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS. Arrefecida com gelo de 100% de etanol foi adicionada de um modo gota a gota, enquanto suavemente vórtex e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 100 x g durante 5 minutos, ressuspendidas em PBS contendo /ml de iodeto de propídio 50 ug, mais 100 ug /ml de RNase A e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Análise e medição de fluorescência de iodeto de propidio foram realizadas num FACSCalibur (BD Biosciences) de fluxo FACSCalibur.

Imunofluorescência análise

Para a coloração DAPI, as células foram permeabilizated e fixadas por incubação com 50% de metanol durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de metanol a 100% durante 20 minutos a -20 ° C. Em seguida, as células foram novamente incubadas com 50% de metanol durante 5 minutos à temperatura ambiente e, finalmente, mantidos em PBS. Neste ponto, as células foram incubadas com 2 uM de 4 ‘, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente para a coloração fluorescente de teor de ADN. As células foram mantidas em PBS e observados sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Tokyo, Japão). imagens obtidas foram digitalizadas e área nuclear foi quantificada utilizando software image-J (National Institutes of Health).

A análise dos polyploidy por Fluorescent Hibridização In Situ (FISH) foi realizada no laboratório de Genética Molecular do Hospital Reina Sofia usando o kit AneuVysion (Abbott Molecular, Inc./Vysis, Downers Grove, IL) seguindo o protocolo recomendado padrão. As células foram centrifugadas a 100 x g durante 10 minutos e incubou-se em tripsina-EDTA durante 20 minutos num banho de água a 37 ° C. Em seguida, sedimento celular foi novamente centrifugado durante 5 minutos, e incubou-se em 0,56% de KCl durante 20 minutos a 37 ° C. Após a adição de algumas gotas de solução de Carnoy (ácido acético methanol:glacial [03:01]), as amostras foram centrifugadas, ressuspendidas e mantidas em solução de Carnoy a 4 ° C durante pelo menos 30 minutos ou até estar pronto para executar FISH. O sobrenadante foi rejeitado e as células foram diluídas em 200 ul de solução de Carnoy. As células foram manchadas em duas áreas da mesma lâmina, uma área para a hibridação com sondas LSI (21 e 13), e a outra área para a hibridação com sondas de CEP (X /Y e 18). As lâminas foram cobertos por uma tampa de vidro e introduzida em um sistema HYBrite (Abbott) durante a noite, com uma temperatura de fusão de 74 ° C durante 5 minutos seguido de hibridação a 27 ° C durante 20 h. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com uma solução de lavagem (0,4 x SSC /03% de NP-40) a 70 ° C durante 2 minutos, seguido de 2 x SSC /0,1% de NP-40 à temperatura ambiente durante 1 minuto. Finalmente, as lâminas foram secas ao ar, contrastadas com DAPI, e analisada sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Tokyo, Japan).

A análise estatística

Os resultados são expressos como média como média ± SD e são representativos de três experiências separadas. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando um teste t de Student de duas caudas. As diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

CoCl

2 tratamento induz a formação de PGCCs em células de cancro do cólon

Quando HCT-116 e Caco- 2 linhas de células de câncer de cólon foram cultivadas sob condições normais de algumas grandes células com núcleos aumentados (PGCCs) foram esporadicamente observadas. No entanto, quando as células foram tratadas com CoCl

2 estes PGCCs claramente aumentado em número, enquanto que as células com morfologia normal foram eliminados selectivamente (Figura 1A). Os PGCCs induzidas por CoCl

2 tratamento eram 3-10 vezes maior do que as células normais, e com uma morfologia distinta dependendo da linha celular (Figura 1A). Assim, no HCT-116 células a tratamento com CoCl

2 PGCCs gerados com extensões citoplasmáticos que lembram células do tipo neuronal (Figura 1A), enquanto que em células Caco-2 os PGCCs induzidas foram arredondados e não tinha filiais (Fig. 1A) . O aumento no tamanho nuclear após o tratamento também variar entre as duas linhas de células, e, apesar de um aumento claro foi observado em ambas as linhas celulares, o alargamento nuclear foi mais pronunciado no caso de células Caco-2 (Figura 1B).

a) Ambos HCT-116 e células Caco-2 linhas foram tratadas com 300 uM CoCl

2 durante 48 horas. Todas as fotomicrografias foram obtidas usando a mesma ampliação final (200 ×). Barra de escala corresponde a 20 microns. A coloração de núcleos de células com DAPI foi realizada para avaliar o tamanho do núcleo médio (ampliação final, 200x). As barras de escala correspondem a 20 microns. B) mudanças no tamanho nuclear após CoCl

2 tratamento. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes (* P 0,05, em comparação com o controlo)

formação

PGCCs em células de cancro do cólon está associada a alterações do ciclo celular e polyploidy

para explorar melhor os mecanismos responsáveis ​​pela indução da PGCCs, do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. Em ambas as linhas celulares CoCl

2 tratamento causou alterações claras em várias fases do ciclo celular (Figura 2). Observou-se uma redução clara do número de células em fase G1, juntamente com um aumento de células em fases S e G2. Além disso, a análise de citometria de fluxo confirmou que o tratamento com CoCl

2 que mimetiza hipoxia é capaz de gerar uma sub-população de células com um elevado aumento do teor de ADN e, por conseguinte, correspondente a PGCCs. A natureza poliplóide destas células foi confirmada por hibridação in situ fluorescente (FISH) para detectar a presença de múltiplas cópias de DNA em PGCCs individuais. No caso de células Caco-2 As análises PEIXES resultados inconclusivos, possivelmente porque esta linha celular já tem um cariótipo gravemente alteradas. No entanto, como pode ser visto na Figura 3, enquanto HCT-116 células de controlo apresentaram tamanho nuclear normal e marcadores indicados dissomia normal para cromossomas X (verde), 18 (azul) e 21 (vermelho), o tratamento com CoCl

2, PGCCs induzidas que mostram um tamanho nuclear aumento acompanhado por poliploidia para os três marcadores cromossómicos utilizados.

Ambos HCT-116 (a) e células Caco-2 (B) foram tratadas com as doses indicadas de CoCl

2 para 6 ou 48 horas. Em seguida, uma análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. Os gráficos de barras do lado direito mostram as mudanças relativas às células de controlo na percentagem de células em diferentes fases do ciclo celular. Os dados representam a média ± desvio padrão de três culturas independentes.

HCT-116 células foram cultivadas na presença de 300 uM CoCl

2 e em seguida uma análise por FISH utilizando sondas para os cromossomas X (verde) , 18 (azul) e 21 (vermelho) foi realizada.

mecanismos moleculares envolvidos na formação de PGCCs no câncer de cólon

Uma série de experimentos foram próxima realizados para analisar a possível mecanismos moleculares envolvidos na geração de PGCCs em células de cancro do cólon. Em primeiro lugar, a expressão da proteína HIF-1α foi analisada para confirmar que o tratamento com CoCl

2 pode efectivamente induzir a sua estabilização. Como mostrado na Figura 4, embora a expressão de HIF-1α não foi detectada em células de controlo, o tratamento com CoCl

2 induzida em ambas as linhas celulares, e de uma forma dependente da dose, um aumento nos níveis desta proteína expressão . Portanto, o mímico de hipóxia em células de cancro do cólon está associada com alterações no ciclo celular e na geração de PGCCs.

) HCT-116 e células A Caco-2 foram tratados com as doses indicadas de CoCl

2, durante 6 horas e, em seguida, a expressão de proteínas D1 HIF-1α, p53 e ciclina foi avaliada utilizando anticorpos específicos. B) A análise de densitometria correspondente as bandas de proteína detectadas nas imunomarcações e normalizado para o sinal de β-actina também são mostrados. Os dados são médias ± DP de três experiências independentes. (* P 0,05, comparado com o controlo)

Por outro lado, a expressão de ciclina D1 é essencial para o ciclo celular para o progresso da fase G1 para a fase S, a um ponto onde a célula. já se comprometeu a completar um novo ciclo de divisão celular. Uma vez que a célula “decide” para iniciar esta fase S, altos níveis de ciclina D1 são regulados negativamente para permitir a síntese de ADN. Se as condições de continuar a permitir o crescimento celular, níveis de ciclina D1 aumentar novamente durante a fase G2. No entanto, se o ciclo celular é comprometida, neste ponto, os níveis de ciclina D1 permanecem baixos. Como mostrado na Figura 4, os níveis mais baixos de ciclina D1 observadas após tratamento de HCT-116 ou as células Caco-2 com CoCl

2 também sugeriram uma paragem do ciclo celular em G2, confirmando os resultados obtidos na análise de citometria de fluxo.

sabe-se que a p53 desempenha um papel importante na regulação da progressão do ciclo celular em G1 e G2 pontos de verificação. Especificamente, em resposta ao dano no DNA, activação de vias moleculares regulados por p53, conduz a paragem do ciclo celular em G1 [23]. Além disso, mais recentemente, tem sido relatado que a expressão de uma isoforma p53 faltam os primeiros 39 aminoácidos e denominado p47, está envolvida na paragem do ciclo celular em G2 em resposta a diferentes condições de stress celular, incluindo o stress do retículo endoplasmático, a resposta a proteína desdobrada e hipoxia [24]. Portanto, o próximo analisaram a expressão de ambas as isoformas de p53 em células cancerígenas do cólon após o tratamento com CoCl

2. Como mostrado na Figura 4, o tratamento com CoCl

2 não alterou a expressão de proteína p53 de comprimento completo (p53FL) mas induzida a expressão da isoforma truncada (p53 /p47). Estes resultados sugerem que a mímica de hipoxia em células cancerígenas do cólon induz a expressão da isoforma p53 /p47 regula negativamente a evolução do ciclo celular em G2. Portanto, o papel de p53 /p47 foi explorado por tratamento de células cancerígenas do cólon com pifithrin-α (TFP-α), que suprimem especificamente a transactivação mediada por p53. Tratamento de Caco-2 células com PFT-α causou uma citotoxicidade inesperada que impediu análises subsequentes ciclo morfológica e celular. No entanto, e como mostrado na Figura 5A, o tratamento de HCT-116 células com 10 uM PFT-α reduziu o impacto de CoCl

2 no ciclo celular Além disso, este pré-tratamento, que bloqueia especificamente a actividade de transcrição de p53, anulou a formação de PGCCs induzidas por CoCl

2 em células HCT-116 (Figura 5B). Portanto, p53 transcricionalmente ativo /p47 é necessário para as alterações do ciclo celular induzida por hipóxia e a formação de PGCCs em células cancerígenas do cólon.

HCT-116 células foram tratadas com 300? M CoCl

2 na presença ou na ausência de 10 uM pifithrin-α (TFP-α), que é um inibidor específico da actividade de transcrição de p53. Em seguida, uma análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. (A) Os dados representam a média ± desvio padrão de três culturas independentes. (* P 0,05, comparado com as células expostas a CoCl

2 na ausência de PFT-α), e (b) as alterações na morfologia celular foram examinadas utilizando microscopia visível. As barras de escala correspondem a 50 microns.

geração

PGCCs no cancro do cólon está associada com um aumento na subpopulação de células-tronco cancerosas

Tem sido sugerido que a hipoxia gerado PGCCs podem contribuir activamente para o crescimento do tumor por geração de CSCs [19]. Por isso decidimos analisar, em seguida, formação de colonospheres

in vitro

, que é um ensaio funcional do capbility auto-renovação das CSCs. Para este fim, após enriquecimento em PGCCs por tratamento com CoCl

2 durante 48 h, as células sobreviventes foram cultivadas a uma densidade clonal por meio isento de soro em placas de baixa aderência que impedem a adesão celular. Sob estas condições, as células tumorais epiteliais diferenciadas morrer por anoikis e apenas uma subpopulação de células tumorais indiferenciadas com características estaminais (CCC) sobrevive, o qual é capaz de gerar tumorospheres (colonospheres) em suspensão por auto-renovação. Experiências anteriores usando manchas fluorescentes lipofílicos foram realizados para confirmar que colonospheres individuais foram obtidos a partir de células individuais. Assim, misturando um número igual de DII (vermelho) – ou DiO (verde) marcado com células antes de realizar o ensaio de formação de colonosphere resultou na formação de esferas contendo apenas uma ou a outra etiqueta (Figura S1)

Como se mostra na Figura 6, o pré-tratamento com CoCl

2 e enriquecimento posterior em PGGCs aumentou em ambos HCT-116 e células Caco-2 de células a capacidade para formar colonospheres, sugerindo que a geração de PGCCs contribui para a expansão da subpopulação CSC em ambas as linhas celulares. Em seguida, os colonospheres formados foram desagregadas e a população de células resultante foi novamente cultivadas a uma densidade clonal para a formação de colonospheres secundárias. (Figura 6). Células derivadas de colonospheres primários formados por CoCl

2-tratados células cancerígenas do cólon manteve uma maior capacidade para formar colonospheres, confirmando uma capacidade de auto-renovação superior. Além disso, colonospheres secundários derivados de colonospheres formados por células submetidas à hipoxia foram significativamente maiores em tamanho em comparação com os que derivam de células de controlo (Figura 7). Este aumento no tamanho corroborada que CSCs gerados em uma população de células enriquecidas em PGCCs também possuía uma maior capacidade de auto-renovação, e, portanto, eles tinham mais acentuadas características stemness [25].

Depois de enriquecimento em PGCCs por tratamento para 48 uM CoCl

2, as células sobreviventes foram cultivadas a uma densidade clonal por meio isento de soro em placas de baixa aderência e o número de colonospheres formados primários foi avaliada após sete dias. colonospheres primários foram desagregadas e a população de células resultante foi novamente cultivadas a uma densidade clonal para a formação de colonospheres secundárias. Gráficos mostram os números de (barras cinza) primária e secundária (barras pretas) colonospheres formadas por HCT-116 e células Caco-2 depois de cada tratamento. Os dados representam a média ± desvio padrão de três culturas independentes. (* P 0,05, comparado com o controlo)

O ensaio de formação de colonosphere secundária foi realizada como descrito na Figura 6 e individualidades sob Materiais e Métodos. (Ampliação final, × 200). Barra de escala corresponde a 10 microns.

A geração de PGCCs em células cancerígenas do cólon está associada à resistência a 5-fluorouracil e oxaliplatin

Em comparação com tumores mais norm�icas, os tumores com maior fracção hipóxica são mais resistentes a radioterapia e quimioterapia [12]. Além disso, ambos os PGCCs [19] como CSCs [5] tem sido associada com a resistência à quimioterapia. Portanto, próxima decidimos analisar em culturas de células de cancro do cólon enriquecidas em PGCCs a actividade antiproliferativa de 5-fluorouracil e oxaliplatina, dois fármacos comumente utilizados na quimioterapia de cancro colo-rectal. Como mostrado na Figura 8, as culturas de células que tinham sido enriquecidas em PGCCs por tratamento com CoCl

2, mostrou um aumento da resistência ao efeito antiproliferativo de ambas as drogas.

Ambos HCT-116 e células Caco-2 as células foram pré-incubadas durante 48 horas na presença ou ausência de CoCl

2 para o enriquecimento PGCC e, em seguida, eles foram expostos durante 72 h a diferentes doses de 5-fluorouracilo (a) ou oxaliplatina (B). A proliferação celular é apresentado como percentagem das células de controlo não expostas a drogas quimioterapêuticas. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes (* P 0,05, em comparação com células sem CoCl

2 tratamento)

Discussão

A hipoxia em tumores tem muito tempo. foi associado com o aumento da agressividade do tumor, pior prognóstico e maior resistência à radioterapia e quimioterapia [26]. Neste estudo foi demonstrado que imita hipoxia in vitro usando CoCl

2, que estabiliza a proteína HIF-1α inibindo a sua degradação, é capaz de gerar PGCCs em cultura de células do cancro do cólon. PGCCs induzidas por tratamento com CoCl

2 são estáveis ​​e possuía morfologia distinta, mas sua geração sob fisiológico

in vivo

condições de hipóxia continua a ser determinado. Nas nossas experiências, a morfologia de PGCCs induzidas por hipoxia variou entre HCT-116 e células Caco-2 (Figura 1). Esta dependência de linha de células coincide com o estudo de Zhang et al [19], onde PGCCs derivadas linhas celulares tumorais HEY (ovário) e MDA -MB-231 (mama) tinham uma morfologia neuronal-like, enquanto PGGCs derivadas de células SKOV3 (ovário ), mostrou uma morfologia arredondada, sem extensões citoplasmáticas ou ramos. No nosso estudo, a morfologia dos PGCCs derivadas de células HCT-116 coincide com os de HEY e MDA–MB 231 células, enquanto que os gerados na Caco- 2 foram mais semelhantes aos descritos para células SKOV3. Deve ser enfatizado que HEY, MDA -MB- 231 e HCT-116 são marcadamente linhas de células invasivas, sendo representativa da transição epitelial mesenquimal processo (EMT) que sofrem algumas sub-populações de células tumorais [27]. Portanto, ou resultados sugerem que o programa genético que controla EMT em células tumorais também pode ser um factor importante para a geração de PGCCs com maior capacidade de infiltração e espalhamento.

Os nossos resultados também demonstraram que a formação de PGCCs em células cancerosas do cólon está associada com alterações no ciclo celular e subsequente poliploidia (Figuras 2 e 3). células procariotas e eucariotas unicelulares dividir por processos amitótico. Em células eucarióticas complexos, embora a mitose prevalece, modificações bem documentadas no ciclo celular mitótico ocorre para alcançar o crescimento celular e desenvolvimento em circunstâncias estressantes. Entre estas variações é o processo endoreplication, uma variação do ciclo celular mitótica normal, que envolve múltiplos ciclos de replicação de ADN sem a participação do passo da mitose [28]. tumor de células gigantes observada por patologistas têm sido tradicionalmente considerado como inerte do ponto de vista de repovoamento do tumor. No entanto, novos dados indicam que estas células são capazes de gerar descendência clonogénicas por divisão assimétrica e brotamento [19]. Assim, um processo tenha sido descrito no qual as células escapar da morte celular induzida por catástrofe mitótica, tornando-se PGCCs que, antes de morrer, dão origem a várias células através de brotamento nuclear e citocinese assimétrica. Este modo de divisão celular em cancro tem sido denominado neosis, e tem sido relacionada com a origem das células estaminais do cancro [29], [30].