Abstract
A autofagia é um processo celular crítica necessária para a manutenção da homeostase celular nos estados de saúde e doença, mas os mecanismos moleculares e impacto da autofagia sobre o câncer não é totalmente compreendido. Aqui, descobrimos que Sox2, um fator de transcrição chave na regulação do “stemness” de células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas por, fortemente induzido fenômenos autofágicos, incluindo a formação de vacúolo intracelular e ativação lisossômico em células de câncer de cólon. A ativação ocorreu através de
a expressão do gene ATG10
mediada por Sox2 e resultou na inibição da proliferação celular e o crescimento da colônia independente de ancoragem
ex vivo
e tumor de crescimento
in vivo.
Além disso, descobrimos que induzida por Sox2-autofagia reforçada senescência celular por up-regulação supressores de tumor ou fatores de senescência, incluindo p16
INK4a, p21 e p53 fosforilada (Ser15). Notavelmente, knockdown de
ATG10
em
Sox2
células cancerígenas do cólon -expressing restaurados propriedades de células de câncer. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que a regulação da autofagia mediada por Sox2 é uma nova estratégia-driven mecanismo para tratar cancros do cólon humanos
Citation:. Cho YY, Kim DJ, Lee HS, Jeong CH, Cho EJ, Kim MO, et ai. (2013) Autophagy e Celular Senescence Mediada por Sox2 Repressão malignidade das células cancerosas. PLoS ONE 8 (2): e57172. doi: 10.1371 /journal.pone.0057172
editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de outubro de 2012; Aceito: 18 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Cho et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Hormel Fundação e Institutos Nacionais de Saúde concede CA111536, CA120388, CA077646, R37CA081064 e ES016548 e pelo Fundo de Investigação, M-2011-B0002-00025 da Universidade Católica da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As células cancerosas, mas não as células normais, adquirir imortalização por escapar senescência celular [1]. Em comparação com as células normais, as células cancerígenas normalmente requerem mais nutrição para produzir proteínas e enzimas para a sua proliferação mais rápida, o que resulta em dependência nutricional de células cancerosas [2]. Sobrevivência é suportado por nutrientes obtidos através do fornecimento de sangue e por auto digestão de organelas intracelulares em um processo conhecido como autofagia [3].
A autofagia é um processo catabólico conservada em eucariotos que degrada proteínas de longa duração, organelas e citoplasma em massa [4] através do sistema lisossômico para manter a homeostase durante a fome e controle de crescimento normal [3]. Autofagia promove a sobrevivência celular por purgar as células de organelas danificadas, metabólitos tóxicos e patógenos intracelulares e gerando os blocos de construção intracelulares necessários para manter as funções vitais durante condições limitadas em nutrientes [5]. No entanto, a autofagia pode também compreendem uma importante estratégia para tratar o cancro, porque a autofagia também pode promover a morte celular através da auto-digestão excessiva e degradação dos constituintes celulares essenciais [5]. Autophagy é diferente da apoptose, um processo que não tem autofagossomas e autolysosomes em células que morrem [6]. Notavelmente, o bloqueio da autofagia batendo para fora beclin induz tumor desenvolvimento [7] e induzir a autofagia por tratamento com compostos naturais, tais como o resveratrol, suprime a proliferação de células cancerosas e malignidade [2]. Autophagy é declaradamente estreitamente relacionada com a senescência celular e inibição de atrasos autophagy senescência celular em células diplóides humanas mitóticas [8]. Estas observações indicam que a autofagia pode induzir a senescência em células cancerosas, porque a inibição da autofagia aumenta propriedades tumorigénicas das células MCF-7 [9]. No entanto, os mecanismos detalhados não foram claramente elucidado.
Além disso, o tamoxifeno, um antagonista do receptor do estrogénio no tecido mamário, induz autofagia em células MCF-7 de cancro da mama humano [10] mediada através de metabolitos de Esfingolipídeos [11] . Notavelmente, o trióxido de arsénio, imatinib (Gleevec) e rapamicina são compostos conhecidos para induzir a morte celular em autophagic muitas linhas celulares de cancro humano [12], [13], [14]. Importante, cancros de ovário, mama e próstata estão associados com a perda de monoalélicos beclin1 em seres humanos. Além disso, a indução de autofagia por beclin superexpressão suprime o crescimento independente de ancoragem colônia de células MCF-7 [15] e proliferação por inibição negativa de p70S6 quinase [16], [17].
Ambos clássica e modernizado reprogramação celular são processos estressantes que ativam a apoptose e senescência celular, que são as duas principais barreiras ao desenvolvimento do câncer e reprogramação somáticas [18]. As ações via de sinalização mTOR na reprogramação de células somáticas, senescência celular e formação de autofagia [18]. Por exemplo, bem caracterizada inibidores de mTOR e ativadores autofagia, incluindo PP242, rapamicina e resveratrol, nomeadamente melhorar a velocidade ea eficiência da geração de células iPS [19]. Sox2, um factor de transcrição que pertence à superfamília HMG (Grupo alta mobilidade), tem um papel na determinação do destino das células, a diferenciação e a proliferação [20]. Também é um regulador chave da célula de auto-renovação e reprogramação das células terminalmente diferenciadas estaminais embrionárias (ES) de células iPS [21]. Embora o potencial oncogénico dos factores de células estaminais, como Sox2, foi levantada a hipótese de ser baseada na semelhança “stemness” entre as células estaminais e células cancerosas, a função de Sox2 em células de cancro não está claramente entendido. Além disso, estudos recentes demonstraram que o nível de proteína Sox2 corresponde fortemente com menos diferenciadas basais de células de carcinomas da mama, do [22], e a proteína é frequentemente encontrada Sox2 ser regulada para baixo em carcinomas gástricos [23]. Estes tipos de estudos têm causado mais controvérsia sobre a função normal e potencial oncogénico de fatores de células-tronco. Aqui, nós fornecemos evidências que mostram que a expressão de Sox2 em células cancerosas induz a autofagia de células cancerosas pelo up-regulação da
ATG10
expressão gênica e indução de senescência celular, resultando em malignidade reduzida das células cancerosas e inibição do crescimento do tumor
ex vivo
e
in vivo
.
resultados
a expressão ectópica de
Sox2
Induz Autophagy
estudos recentes indicaram que a expressão ectópica de
Sox2
por infecção retroviral em células MCF-7 de cancro da mama aumentou o tamanho e número de colónias formadas em agar mole [24]. No entanto, Sox2 é frequentemente regulados negativamente em cancros gástricos e inibe o crescimento celular através da paragem do ciclo celular e apoptose [23]. Portanto, o papel de Sox2 no cancro é controverso. Para explorar o papel de Sox2 e outros fatores iPS em câncer, que ectopicamente expressa esses fatores em células de câncer colorretal humano HCT116 e descobriu que Sox2, mas não Nanog, Lin28 ou Oct4, induziu a formação de vacúolo grave no citoplasma, que é um importante marcador de macroautofagia [25] (Fig. 1A). Descobrimos que mais de 90% de células infectadas formados diferentes vacúolos porte em seu citoplasma e mata-borrão e ensaio immunocytofluorescence ocidentais resultados indicaram que todas as células expressa a proteína Sox2 ectópica (Fig. 1B). Além disso, constatou-se que a formação de vacúolo grave coincidiu com a activação ácida lisossomal em células cancerígenas do cólon HCT116 (Fig. 1C). Mais importante, a sobre-expressão induzida Sox2 LC3 (também conhecido como ATG8b) formação de focos, que é um biomarcador chave de autofagia (Fig. 1D). Estes resultados indicaram que Sox2 superexpressão induzida autofagia.
(
A
) Comparação das alterações morfológicas induzidas pela expressão ectópica de fatores iPS.
(painéis superiores)
células HCT116 foram transduzidas individualmente com fatores iPS, incluindo Sox2, Nanog, Lin28 e Oct4. As células foram cultivadas durante 5 dias e foram observadas alterações sob um microscópio de luz (X200).
(painéis inferiores)
células HCT116 foram colhidas em 5 dias após a transdução com fatores de iPS e proteínas extraídas. Os níveis de proteína do Sox2, Nanog, Oct4 Lin28 e foram analisadas por transferência de Western com anticorpos específicos como indicado. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. (
B
) células HCT116 formando vacúolos em 5 dias após a transdução foram observados em microscopia de luz, contados e comparados. superexpressão sox2 foi analisado por transferência de Western e o ensaio de immunocytofluorescence (X200) utilizando anticorpos específicos como indicado. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. As células foram visualizadas por microscopia de luz (L.M .; X200). (
C
) análise por ativação Lisossomal. células HCT116 infectadas com
simulada
ou
Sox2
foram coradas pela adição de Lysotracker (50 nM) para o meio de cultura durante 5 minutos num banho a 37
oC, 5% de CO
2 incubadora. As células foram fixadas com formalina a 4%, lavadas com PBS e activação lisossomal foi observado sob um microscópio de fluorescência (X200). (
D
) imunofluorescência de LC3b (isto é, ATG8b). células HCT116 que expressam estavelmente
simulada ou
Sox2
foram submetidos a um ensaio de fluorescência para detectar LC3b. As células foram observadas ao microscópio de fluorescência (X200). Os núcleos foram corados com DAPI; LM indica microscopia de luz (X200).
Sox2 Induz autofagia em células cancerosas, mas não em células normais
Para investigar se Sox2 superexpressão pode induzir a formação de vacúolo em diferentes linhas celulares de cancro do cólon , nós transduzidas partículas virais lenti-Sox2 em CCD-18Co células do cólon normal, e HCT116, HT29 e WiDr células cancerígenas do cólon humano. Verificou-se que todas as linhas celulares de cancro do cólon formado vacúolos no citoplasma (Fig. 2A, setas). No entanto, embora CCD8-18Co células de cólon normal apresentou boa expressão de Sox2 após transdução com lenti-Sox2, as células não formar vacúolos ou exibir alterações morfológicas (Fig. 2A, B). Além disso, os resultados adicionais confirmaram que a formação de vacúolo e activação ácida lisossomal foram observados em células de cancro do cólon HCT116, mas não em CCD-18Co células normais de cólon (Fig. 2C). Além disso, a expressão ectópica de Sox2 no ratinho normal fibroblastos embrionários (MEFs) ou fibroblastos primários humanos (NFDH e Bj) não causar a formação de vacúolo (dados não mostrados), o que demonstra que a formação de vacúolo induzida por Sox2 sobreexpressão em células HCT116 é realmente célula cancerosa autofagia espec�ico.
(
a
) CCD-18Co (CRL-1459) células do cólon normais e HCT116, as células cancerígenas do cólon HT29 e WiDr foram cultivadas em meio apropriado e transduzidas com
Sox2
partículas virais. As células foram cultivadas com meio de crescimento completo durante 5 dias após a transdução. As células foram observadas sob um microscópio de luz. vacúolos celulares são marcadas com uma ponta de seta em
Sox2
-expressing células cancerígenas do cólon. (
B
) CCD-18Co células do cólon normal, foram cultivadas, transduzidas com
simulada
ou
Sox2
partículas virais e cultivadas com meio de crescimento completo durante 5 dias. As células foram então fixadas, permeabilizadas e hibridou-se com um anticorpo específico Sox2 e, em seguida, com um anticorpo secundário conjugado com Alexa 568-, e visualizadas com um microscópio de fluorescência (X200). Os núcleos foram corados com DAPI. As áreas de microscopia de luz são as áreas combinados com Sox2 e DAPI fluorescência. A área de box em baixa potência é ampliada para comparar a morfologia entre HCT116-
simulada
e –
Sox2
células -expressing. (
C
) activação Lisossomal, um marcador autofagia, foi comparado adicionando Lysotracker-Red (50 nM) em 5 dias após a transdução de CCD-18Co células do cólon normais e células cancerosas colorectal HCT116 infectadas com o
simulada
ou
Sox2
. As células foram observadas ao microscópio de fluorescência. LM indica a mesma área de microscopia de luz correspondente a microscopia de fluorescência (X200).
Metas Sox2 ATG10 para induzir autofagia
Para explorar o mecanismo (s) de autofagia induzida por Sox2, utilizou-se uma primeira análise de microarray de um total de 30.968 genes a partir de ADNc isoladas a partir de células infectadas com o
simulada ou
Sox2
para identificar gene (s) alvo de Sox2 para induzir autofagia. Os resultados revelaram 11.245 genes que foram analisados utilizando a análise significativa do programa de Microarray (SAM) (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Descobrimos que 2,153 genes induzida por Sox2 poderia ser classificada como sobre-regulada e 1575 genes foram regulados negativamente em células HCT116 (Fig. 3A e Tabela S1). Utilizou-se o banco de dados para anotação, visualização e integrado Discovery (v6.7 DAVID; http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) para classificar ainda mais os genes de acordo com as suas funções biológicas ou moleculares e descobriu que os níveis de expressão de genes associados com a autofagia , proliferação e regulação do ciclo celular foram substancialmente alteradas pela expressão ectópica de
Sox2. expressão do gene
Altered incluiu mudanças em genes de reparo de DNA, 33 genes de replicação de ADN, 25 genes relacionados com o crescimento de 20 células, 26 células tamanho relacionada- 191 genes, os genes relacionados com a transcrição e de sinalização de insulina 17 genes relacionados com a via (fig. 3A e Tabelas S1, S2 e S3). Importante,
Sox2
expressão induzida a expressão aumentada de
ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D Comprar e
ATG8b
genes em cerca de 2-4 vezes (Fig. 3A). Em contraste,
Sox2
expressão foi associada com a diminuição da expressão do
ATG12, ATG16L2
e
ATG9B
genes (Fig. 3A). Ao pesquisar um banco de dados contendo o motivo de ligação de consenso Sox2 na região promotora no genoma [26], descobrimos que o
ATG10
e
ATG12
promotores conter uma ligação motivo de consenso nucleotídios Sox2 abrigando identidade de 63% (Tabela S4). Comparando o nosso microarray e os resultados da pesquisa de banco de dados, concluímos que ATG10 pode ser um alvo de Sox2 na indução de autofagia. Nossos resultados de RT-PCR dependente do ciclo demonstrou que o
ATG10
nível de mRNA de
Sox2-
células transfectadas foi aumentado em cerca de 2,5 vezes, em comparação com o
simulada
(Fig. 3B ). Notavelmente, os resultados de transferência de Western (Fig. 3C) e immunocytofluorescence contra ATG10 (Fig. 3D) indicou que os níveis de proteína e ATG10 LC3 foram aumentadas por sobre-expressão de Sox2. Para determinar se o
ATG10
promotor é ativado por Sox2, construímos dois
plasmídeos luciferase
repórter contendo -1522 a -1 (
pGL3-ATG10-1522
) e – 711 para -1 (
pGL3-ATG10-711
) (Fig 3E.), pesquisando e analisando o
ATG10
regiões promotoras, que contêm putativos Sox e SRY motivos de ligação ao -1327 e – 1473 a partir do local de iniciação da transcrição (Fig. 3E). Verificou-se que que a supressão da região de ligação putativo Sox2 suprimiu significativamente a actividade da luciferase (Fig. 3F). Notavelmente,
ATG10
atividade do promotor foi aumentado em superexpressão de Sox2 (Fig. 3G), indicando que induz Sox2
AT10
expressão genética e provoca a autofagia.
(
A
) Microarray.
Painel superior
, HCT116 células cancerosas colorectal expressando estavelmente
simulada
ou
Sox2
foram submetidos à análise microarray conforme descrito em “Materiais e Métodos”. A cor amarela indica o número de genes que não mostrou uma diferença significativa entre
simulada e
expressão Sox2
. As cores vermelhas e verdes indicam o número de genes para cima ou para baixo-reguladas, respectivamente, em células HCT116 que expressam estavelmente
Sox2
comparação com células que expressam o
controle
simulada.
tabela inferior
, resumo de genes relacionados com a autofagia obtidos a partir da análise de microarray. Cima e para baixo-regulação são indicadas nos valores LOG2. (
B
) A expressão do
ATG10
induzida por Sox2. RNA total (1 mg) a partir de células HCT116 infectadas com o
simulada
ou
Sox2
foi transcrito de forma inversa e
ATG10
foi amplificado por PCR dependente de ciclo e o
ATG10
nível de expressão foi visualizado por eletroforese em gel de agarose no ciclo de 21
st. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a igualdade da utilização de cDNA para a PCR. (
C
) Up-regulação dos níveis de proteína ATG10 e LC3b induzidas pela
expressão Sox2
. As proteínas foram extraídas de células HCT116 que expressam estavelmente
simulada
ou
Sox2 Comprar e proteínas ATG10 e LC3b foram visualizados por transferência de Western utilizando anticorpos específicos. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. (
D
) Confirmação do nível de proteína ATG10 induzida por Sox2. células de câncer colorretal HCT116 foram infectadas com o
simulada
ou
Sox2 Comprar e cultivadas 5 dias. As células foram fixadas, hibridada com um anticorpo primário específico ATG10 e anticorpo secundário conjugado com Alexa-488. Os níveis de proteína ATG10 foram observadas por microscopia de fluorescência. L. M. indica a mesma área de microscopia de luz correspondente a microscopia de fluorescência (X200). (
E
) Construção do
ATG10
promotor
luciferase
repórter plasmídeo. As sequências de nucleótidos do ser humano
ATG10 e região promotora foram baixados do Ensemble (https://uswest.ensemble.org). A análise do promotor putativo foi conduzida utilizando TFSEARCH (v1.3) (https://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). As sequências de consenso de ligação putativos SRY e Sox são indicados em vermelho e o local de ligação da polimerase III é encaixotado. (
F
) O clone de BAC (RP11-111B20) foi adquirido a partir de Império Genomics (Buffalo, NY), e 1528 e 711 pb da região do promotor
ATG10
foram amplificados por PCR. O fragmento de PCR foi recombinado com os
pGL3
vector fundamental para a construção de pGL3-AT10-1582 e pGL3-ATG10-711
luciferase
plasmídeos repórter. O
pGL3-ATG10-luc
plasmídeos repórter foram confirmadas por sequenciação de ADN. O promotor
ATG10
luciferase
plasmídeos repórter,
pGL3-AT10-1582
e
pGL3-ATG10-71-
luc, foram transitoriamente transfectados em HCT116 e a actividade da luciferase do pirilampo foi analisada após 24 horas. O
phRL-SV40 Renilla
plasmídeo repórter de luciferase foi co-transfectado como um controlo interno para verificar a igualdade de transfecção e normalização da actividade da luciferase do pirilampo (* p 0,001). (
G
) O
pGL3-ATG10-1528
plasmídeo repórter luciferase foi co-transfectadas transientemente com um
simulada
ou
Sox2
vector de expressão viral em as células HCT-116 e a actividade da luciferase do pirilampo foi analisada após 24 horas. O
phRL-SV40 Renilla
plasmídeo repórter de luciferase foi co-transfectado como um controlo interno para verificar a igualdade de transfecção e normalização da actividade da luciferase de pirilampo (* p 0,001).
Sox2- induzida autophagy é mediada através da sub-regulação da via de sinalização de Akt, mas não através de Classe III de PI3-K Sinalização
o jejum ou esgotamento de factores de crescimento tais como a insulina induz a autofagia [27]. Os nossos resultados demonstraram que a expressão de microarray gene associado com a via de sinalização de insulina foi suprimida (Tabela S3). Portanto, examinámos as alterações nos níveis de proteína associados com autofagia insulina e sinalização através de Western blotting. Descobrimos que a Classe III de PI3-K (Vps34p) e beclin não foram alterados, o que indica que a Classe III de PI3-K /beclin via de sinalização não está envolvido na autofagia induzida por Sox2 (Fig. 4A). Ao investigar a via de sinalização de PI3-K-Akt, descobrimos que Akt fosforilação (Ser308) foi substancialmente inibida e os níveis de proteína total de Akt, mTOR e p70S6K foram diminuídos em
Sox2
células infectados em comparação com
simulada
células infectados (Fig. 4B). Para confirmar a sinalização relacionada com a inibição da via de sinalização de PI3-K-Akt, analisamos GSK3α /SS e PTEN. Os resultados indicaram que a fosforilação de GSK3α /ß na Ser9 /Ser21 foi suprimida e os níveis de proteína /SS totais GSK3α foram ligeiramente aumentada em
Sox2
células infectados em comparação com
células
infectados trocistas (Fig . 4C). Notavelmente, verificou-se que a fosforilação de PTEN também aumentou (Fig. 4C), que resulta na supressão da sinalização de PI3-K por fosforilação de-[28]. Estes resultados indicaram que Sox2 altera a via de sinalização de PI3-K-Akt através GSK3α /SS e sinalização PTEN, embora a quinase a montante específico responsável pela fosforilação de PTEN não é conhecido neste exemplo. Nós tratada células HCT116 que expressam
Sox2
ou
simulada com insulina ou LY294002, um inibidor de PI3-K. Os resultados indicaram que
Sox2
formação de vacúolo induzida foi marcadamente inibida por tratamento com insulina (Fig. 4D
painel esquerdo
s,
E). No entanto, as células
simulada
infectados não mostrou formação de vacúolo ou não tratados com insulina em condições de cultura de células normal (10% de FBS) ou a formação de vacúolo suprimida na condição de fome (0% de FBS) (Fig. 4D
painéis esquerdo e médio,
e, F). Descobrimos também que
infectados células simulados exibiram aumento da formação de vacúolo após o tratamento com LY294002, enquanto que
Sox2
superexpressão causou a formação de mais vacúolo induzida pelo tratamento LY294002 em comparação com
simulada
( Fig. 4D
painel direito
s,
E, F). fenômenos semelhantes foram observados em condições de fome (Fig. 4E, F). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que a sub-regulação da via de PI3-K-Akt por PTEN possa cooperar para induzir autofagia associado com expressão Sox2.
(
in-C A
) Os níveis de proteína de classe I moléculas sinalizadoras incluindo Akt, mTOR e p70S6K e classe III PI3-K moléculas sinalizadoras incluindo Vps34p e beclin foram analisados em células HCT116 estavelmente expressando
simulada ou
Sox2
. As proteínas individuais foram visualizados por Western blotting utilizando anticorpos específicos. p-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. (
D
) Envolvimento da sinalização Classe I PI3-K na autofagia induzida por Sox2. (
D, painéis esquerdos
) células HCT116 que expressam estavelmente
simulada ou
Sox2
foram tratados com insulina ou LY294002 menos de 10% Condições de FBS contendo a 2 dias após a infecção. formação de vacúolo foi observada por microscopia de luz (X200). As áreas em caixa são ampliados individualmente mais 2 vezes (
painéis inferiores para simulados e Sox2
) vacúolos para melhor visualizar.
(d, painéis à direita)
As células foram transduzidas com
Sox2
partículas virais e cultivadas 2 dias. O meio de cultura celular foi substituído com 5a de McCoy sem suplementação de FBS, mas incluindo a 5 ug /ml de insulina ou 5 ug células LY294002 e, em seguida, foram cultivadas durante 5 dias. As células foram observadas sob microscopia de luz (X200). (
E
) comparação quantitativa da formação de autofagia induzida pela classe I sinalização de PI3-K. O vacúolo células de D e F formando foram contados e comparados em um gráfico numerate (* p 0,001).
Autophagy suprime a proliferação e Crescimento Colony Anchorage independente induzindo Cellular senescência em HCT116 induzida por Sox2 células
supressão da actividade de PI3-K por PTEN desempenha um papel importante na proliferação celular e no desenvolvimento do cancro no cólon [29], [30], [31]. inibição de PI3-K por PTEN ou vortmanina tem um efeito inverso comparação com necrose tumoral α factor sobre o equilíbrio entre os p50 e p65 subunidades do factor nuclear
k
B [31]. GM3, um gangliósido, tratamento aumenta drasticamente a quinase dependente de ciclina (CDK) inibidor (CKI) p21
expressão WAF1 através da acumulação da proteína p53 pela inibição mediada por PTEN de sobrevivência de PI3-K-Akt-MDM2 de sinalização em HCT116 células cancerígenas do cólon [29]. No cancro colorectal humano, uma correlação negativa entre os níveis de proteína PTEN e Akt fosforilação foi observado [30]. Os nossos resultados indicam que a sub-regulação de PI3-K-Akt sinalização através de PTEN possa estar envolvido em autofagia induzida por Sox2 (Fig. 4). Nossa proliferação celular e ciclo celular análises indicaram que
Sox2
infecção em células HCT116 proliferação suprimidos através da indução de acúmulo de células em G0 /G1 e sub-G1 e redução das fases do ciclo celular S em comparação com
simulada
células infectados (Fig. 5A). A atenuação da proliferação celular foi associada com aproximadamente 90% de inibição do crescimento de cancro independente de ancoragem em ágar mole, uma característica das propriedades celulares de cancro [32] (Fig. 5B). Para explorar o responsável de sinalização para induzir a perda de propriedades de células de cancro tais como a supressão da proliferação e crescimento em agar mole, examinámos vários supressores de tumor com um papel conhecido na regulação do ciclo celular. Observou-se um aumento da fosforilação de p53 (Ser15) e aumentos nos níveis de proteína total de p16
INK4a e p21 (Fig. 5C), que são bem conhecidas para ser fortemente envolvido na senescência celular [33]. Em seguida, examinaram a senescência usando um ensaio SA-ß-galactosidase e descobriram que a expressão ectópica de (painéis Fig. 5D,
esquerdo e meio
)
Sox2
actividade aumentada ß-galactosidase e nível de proteína e suprimida Ki-67 nível de proteína, um marcador de proliferação celular (Fig. 5D,
direito painel
). Notavelmente, mais de 90% de células contendo vacúolos manchado ß-gal positiva (Fig. 5D,
gráfico
), Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que a autofagia induzida Sox2 provoca uma perda de propriedades de tumor em células de cancro colo-rectal HCT116 .
(
A
)
painel esquerdo
, efeito da
expressão Sox2
sobre a proliferação celular. células HCT116 (2 × 10
3) que expressam estavelmente
simulada
ou
Sox2
foram semeadas em placas de 96 poços e a proliferação foi analisada pelo ensaio de MTS em intervalos de 24 h até 96 h (*, p 0,001).
Médio e painéis à direita
, efeito da
expressão Sox2
sobre a distribuição do ciclo celular. células HCT116 (4 × 10
5) expressando estavelmente
simulada
ou
Sox2
foram semeadas, culta e, em seguida, a distribuição do ciclo celular (
painel do meio
) e sub- acumulação G1 (
painel direito
) foram analisadas por FACS (*, p 0,001). (
B
) Efeito da
expressão Sox2
sobre o crescimento da colônia independente de ancoragem. células HCT116 (8 × 10
3) expressando estavelmente
simulada
ou
Sox2
foram submetidos a um ensaio de crescimento de colónias em agar mole por 5-7 dias. As colónias de células foram registados com um a mais (v.6) programa Pro Image-software de computador (* p 0,001) microscópio e. (
C
) profiling proteína relacionada com a regulação do ciclo celular. As proteínas foram extraídas a partir de células HCT116 que expressam estavelmente
simulada ou
Sox2
e submetidas a transferência de Western para detectar o nível de várias proteínas que se sabe estarem envolvidos na regulação do ciclo celular. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. (
D
) Ensaio A senescência celular.
Painel esquerdo
, as células HCT116 que expressam estavelmente
simulada
ou
Sox2
foram analisadas para a senescência usando um senescência ß-galactosidase kit de coloração. As células foram observadas sob um microscópio de luz (X200).
Oriente e
painéis direitos
, o nível de proteína de ß-galactosidase ou Ki-67 foi detectada em células HCT116 que expressam estavelmente
simulada
ou
Sox2
utilizando anticorpos primários específicos como indicado, e um anticorpo secundário conjugado com HRP. detecção imunocitoquímica foi realizada utilizando o Sigma FASTTM 3,3′-diaminobenzidina Terahyfrochloride com conjuntos metálicos Enhancer Tablet (DAB substrato peroxidase). Os níveis de proteína foram visualizadas utilizando um microscópio de luz (X200).
Graph
, indica uma comparação da população de células positiva ß-galactosidase em células HCT116 que expressam estavelmente
simulada
ou
Sox2
(* p 0,001).
Knockdown de
ATG10
Restaura
Sox2
induzida por autofagia, Cellular Senescence e proliferação celular
Os nossos resultados anteriores demonstraram que
Sox2
mediada autofagia é mediada através
ATG10
expressão (Fig. 3). Para examinar se knockdown de
ATG10
pode suprimir a autofagia induzida por Sox2 superexpressão, foi selecionada uma
psh-ATG10-1755
knockdown vector (Fig. 6A). O
sh-ATG10
partículas virais foram infectadas em
Sox2
células -preinfected e expressão de Sox2 (Fig. 6B,
painéis superiores
) e knockdown de
ATG10
(Fig. 6B,
painéis de fundo
) foram confirmados por um teste de imunofluorescência. Muito importante, as morfologias celulares de autofagia induzida por Sox2, incluindo achatamento celular, tamanho do núcleo e a formação de vacúolo, foram totalmente convertidos aos observados em
simulada
infectados células HCT116 (Fig. 6B, L. M.). Além disso, confirmou-se que a recuperação morfológica correspondeu com restauração de Ki-67, ß-galactosidase, p16
níveis INK4a e proteína p21 no
simulada
infectados células HCT116 (Fig. 6C). Notavelmente, confirmamos que knockdown de
ATG10
em HCT116 estavelmente expressando Sox2 recuperou a proliferação celular, que foi inibida por Sox2 superexpressão, eo crescimento foi ainda mais rápido do que a de células HCT116 que expressam estavelmente
simulada
controlo (Fig. 6D). Estes resultados indicaram que ATG10 desempenha um papel importante na formação de autofagia induzida pela expressão Sox2 em células de cancro colo-rectal HCT116.
(
A
) Confirmação da eficiência knockdown de ATG10. Knockdown de ATG10 usando
pLKO-shATG10
. O
pLKO-shATG10
partículas lenti-virais knockdown foram infectados em células HCT116 que expressam estavelmente
Sox2 Comprar e células cultivadas durante 36 horas. As proteínas foram extraídas e eficiência knockdown foi determinada por transferência de Western utilizando um anticorpo específico ATG10. ß-actina foi utilizado como um controlo interno para verificar a carga de proteína igual. (
B
) As alterações morfológicas induzidas pela
ATG10
knockdown em células HCT116 que expressam estavelmente
Sox2
. HCT116-simulada, células -Sox2 e -Sox2 /sh-ATG10 foram analisadas para alterações morfológicas e níveis de proteína de Sox2 (vermelho) e ATG10 (verde) foram determinados por um ensaio de imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. As células foram observados sob uma fluorescência ou microscópio de luz (X200). L. M. indica microscopia de luz. (
C
) Restauração de ciclo celular, proliferação celular e marcadores de senescência ao derrubar
ATG10
em células HCT116 que expressam estavelmente
Sox2
. HCT116-simulada, células -Sox2 e -Sox2 /SH-ATG10 foram semeadas em um slide 4 câmaras, fixadas e permeabilizadas. Marcadores de proliferação celular, a senescência celular e regulação do ciclo celular incluído Ki-67, ß-galactosidase, p16
INK4a e p21. Estes marcadores foram analisados por imunocitoquímica com anticorpos específicos como indicado utilizando a Sigma FASTTM 3,3′-diaminobenzidina Terahyfrochloride com conjuntos metálicos Enhancer Tablet (DAB substrato de peroxidase). As células foram observados sob uma fluorescência ou microscópio de luz (X200). (
D
) Restauração da proliferação por derrubar
ATG10
em células HCT116 que expressam estavelmente
Sox2
.