Abstract

Fundo

A identificação de biomarcadores preditivos é essencial para o desenvolvimento bem sucedido da terapia-alvo. receptor de insulina-like growth factor 1 (IGF1R) foi analisado como um alvo terapêutico potencial para vários cancros. No entanto, os ensaios clínicos recentes mostraram que o anticorpo anti-IGF1R e quimioterapia não são eficazes para o tratamento de câncer de pulmão.

Metodologia /Principais Achados

Para definir biomarcadores para prever a terapia IGF1R alvo bem sucedida, avaliado o efeito anti-proliferação de figitumumab (CP-751,871), um anticorpo anti-IGF1R humanizado, contra nove gástrica e oito linhas de células de cancro hepatocelular. Fora de 17 linhas celulares de cancro, figitumumab efetivamente inibiu o crescimento de três linhas celulares (SNU719, HepG2, e SNU368), diminuiu os níveis de p-AKT e p-STAT3, e induzida por L 1 detenção de um modo dependente da dose. Interessantemente, estas células mostraram co-sobre-expressão e a mobilidade alterada do receptor de IGF1R e insulina (RI). Immunoprecipitaion ensaios (IP) e ELISA confirmou a presença de receptores heterodiméricos do IGF1R /IR em células sensíveis à figitumumab. O tratamento com figitumumab levou à dissociação de receptores heterodiméricos dependente de IGF1 e inibiu o crescimento de tumores com níveis reduzidos de receptores heterodiméricos em um modelo de murganho de xenoenxerto. A seguir, constatou que tanto IGF1R e IR foram N-linked glyosylated em células sensíveis à figitumumab. Em particular, a espectrometria de massa mostrou que tinha IGF1R glicanos N-ligados em N913 em três linhas de células sensíveis ao figitumumab. Observou-se que a ausência de glicosilação ligado a N na N913 levou a uma falta de localização membranosa do IGF1R e insensibilidade figitumumab.

Conclusão e Significado

Os dados sugerem que o nível de N-ligados receptor heterodimérico glicosilada IGF1R /IR é altamente associado com sensibilidade ao anticorpo anti-IGF1R em células cancerosas

Citation:. Kim JG, Kang MJ, Yoon YK, Kim HP, Parque J, Song SH, et al. (2012) A heterodimerização de glicosilada insulin-like growth factor-1 e receptores de insulina em células cancerosas sensíveis a anti-IGF1R anticorpo. PLoS ONE 7 (3): e33322. doi: 10.1371 /journal.pone.0033322

editor: Frank T. Kolligs, Universidade de Munique, Alemanha |

Recebido: 29 de outubro de 2011; Aceito: 07 de fevereiro de 2012; Publicado: 16 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela saúde Korean 21 e R projeto D, Ministério da Saúde, Bem-estar Assuntos da Família, República da Coreia (A091081) e apoiado pela concessão No. R31-2008-000-10103-0 do programa Universidade World Class da MEST ea NRF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com seus ligantes secretados, IGF1 e IGF2, receptor Insulin-like growth factor 1 (IGF1R) é altamente expresso em muitas células cancerosas humanas, incluindo gástrica (GC) e carcinoma hepatocelular (HCC) [1] – [ ,,,0],5]. Como resultado, uma variedade de estratégias que inibem a via de sinalização do IGF1R foram desenvolvidos ao longo das últimas duas décadas [6]. Entre estes, uma estratégia terapêutica anticancerígena usando anticorpos totalmente humanizados tornou-se um foco de pesquisa importante [7], porque ele tem um grande potencial para se tornar a terapêutica anti-câncer de sucesso que pode efetivamente inibir a proliferação de células do cancro com baixa toxicidade e proporcionar benefícios clínicos quando administrado em combinação com quimioterapia [8] – [14]. Um anticorpo monoclonal anti-IGF1R completamente humanizado (figitumumab) foi testado na Fase III de ensaios clínicos; No entanto, nenhuma melhoria estatisticamente significativa foi demonstrada pela administração de figitumumab juntamente com quimioterapia padrão para pacientes com cancro avançado não pequenas do pulmão (NSCLC) [15].

Muitos estudos têm demonstrado que a isoforma A do receptor da insulina ( IV) é anormalmente sobre-expressos em vários tipos de cancro e pode promover o crescimento tumoral [16] – [19]. Este partes IV uma elevada homologia de sequência com o IGF1R, particularmente dentro do domínio quinase intracelular [7], [20]. IR pró-receptores podem formar receptores heterodiméricos (h) com pro-IGF1R receptores pós-tradução, antes da clivagem para gerar duas subunidades alfa e duas subunidades extracelulares beta que contêm extracelular, transmembrana, e domínios de tirosina-quinase [21]. Portanto, quando as células IGF1R co-express e IR, os pró-receptores podem heterodimerizar para criar IGF1R /IR RHs [22] – [24]. Estes HRs também pode ser sobre-expresso em várias células tumorais e de amostras, como resultado de tanto a sobre-expressão do IGF1R e IV [2], [25], [26]. Por conseguinte, a abundância relativa de RIs afecta a activação do sistema do IGF através HRs, que reage tanto à insulina e IGF [27] – [29]. Em células cancerosas com altos níveis de IGF1R /IR RHs, IGF1 e IGF2 ativar várias vias de sinalização a jusante através de receptores heterodiméricos em vez de através IGF1Rs homodim�icas [30].

Uma série de estudos têm tentado identificar biomarcadores preditivos com pré-clínico e relevância clínica [15], [31], [32]. Identificação de biomarcadores preditivos para a monitorização da eficácia de IGF1R, a terapia dirigida para os pacientes apropriados, no entanto, ainda é necessário. No presente estudo, foi demonstrado que figitumumab possui uma elevada afinidade para receptores heterodiméricos IGF1R /IR, bem como receptores de homodímero de IGF1 e inibe o IGF /IGF1R sinalização eixo no cancro gástrico e células de carcinoma hepatocelular. Além disso, os nossos dados mostraram que os receptores heterodiméricos do IGF1R ligado à membrana funcional /IR desempenhar um papel importante na sinalização IGF1 [26], [33] e, portanto, podem servir como biomarcadores para prever a sensibilidade ao anticorpo anti-IGF1R.

resultados

efeito anti-proliferativo de figitumumab

Como um primeiro passo, avaliou-se o efeito anti-proliferativo de figitumumab, um anticorpo monoclonal que impede a ligação a ligandos de IGF1R, [12], sobre 17 linhas celulares de cancro (Figura 1A). Algumas células consideradas sensíveis à figitumumab, tais como SNU719, HepG2, e SNU368, mostraram um decréscimo dependente da dose de viabilidade das células; IC

30 valor de figitumumab (inibição de crescimento de ~ 30%) para cada linha celular foram 0,063 ug /mL, 0,062 ug /mL e 0,047 ug /ml, respectivamente (Tabela 1).

A ) Análise do efeito anti-proliferativo em células de figitumumab carcinoma gástrico e hepatocelulares. Dois grupos de células cancerosas, incluindo nove linhas celulares de cancro gástrico e oito linhas celulares de carcinoma hepatocelular, foram tratadas com concentrações crescentes de figitumumab (0, 0,1, 1, e 10 ug /ml) durante 120 horas para inibir o crescimento das células de controlo por 30%. A proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTT. Seis cavidades replicadas foram usadas para cada análise, e pelo menos três experiências independentes foram realizados. Dados a partir de poços em duplicado estão apresentados como a média das restantes células. Bares = ± SE. B) Efeito do figitumumab na via de sinalização do IGF1R. A análise de imunotransferência foi realizada para observar o efeito dose-resposta de figitumumab (0,1-10 ug /mL) sobre a sinalização do IGF1R. SNU638, SNU719, SNU354, HepG2, e SNU368 células foram expostas a concentrações crescentes de figitumumab durante 72 h. Analisaram-se os níveis de proteínas associadas com a via de IGF1R e suas formas activadas. Diferenças em relação ao controle são mostrados. Em cada painel, blots representativos de três experiências independentes são apresentados. C) Efeito de figitumumab sobre a distribuição do ciclo celular. As células sensíveis ao Figitumumab (SNU719, HepG2, e SNU368) foram tratados com concentrações crescentes do fármaco [0 ug /ml (barra preta sólida), 0,1 ug /ml (sólido cinzento bar), 1 ug /mL (barra branca), e 10 ug /ml (barra cinzento-escuro eclodidos)] durante 48 h e depois coradas com iodeto de propidio, e analisados ​​por citometria de fluxo. A percentagem de células em G

0 /L

1, S e G

2 /H fases são mostrados. As colunas representam a média de três experiências independentes; Bares = ± SE. *

P-

valores 0,05, **

P-

valores 0,01. D) Efeito de figitumumab no crescimento do tumor em ratinhos portadores de xenoenxertos HepG2. As células HepG2 (1 × 10

7) foram injectadas no flanco direito de ratinhos nus (n = 5). O tratamento com figitumumab (125 ug /ml [6,3 mg /kg de peso corporal], uma vez por semana durante 3 semanas) foi iniciado quando o volume do tumor tinha atingido 200 mm

3. Sem perda de peso corporal significativa foi observada durante o curso do estudo. Os tumores foram medidos com compassos em intervalos regulares. círculos sólidos = tratamento com o controle do veículo sozinho (controle), triângulos abertos = tratamento com figitumumab. As diferenças entre os dois grupos (tamanhos dos tumores dos ratos de controlo e os de ratinhos tratados com figitumumab) foram comparados a partir do dia 17 até ao final do período de tratamento (dia 21), utilizando

t

um teste de Student dos dois lados . *

P-

valores 0,05; **

P-

valores. 0,01 versus controlo

Figitumumab perturba IGF1R sinalização principalmente através de AKT e STAT3 percursos e induz G

1 prisão

Para examinar o mecanismo através do qual figitumumab inibe a proliferação celular, examinamos se havia diferenças na sinalização a jusante entre as células sensíveis e resistentes na presença de soro após o tratamento a longo prazo com doses seriadas de figitumumab (Figura 1B). Nesta experiência, apenas as células sensíveis figitumumab-exibiram acentuadamente diminuição dos níveis de p-AKT e p-STAT3 de uma maneira dependente da dose; no entanto, não houve alterações nos níveis de p-ERK. Observou-se também que figitumumab diminuiu o nível de IGF1R celular total em SNU719 células, sugerindo que a infra-regulação deste receptor pode representar um processo de degradação mediada por anticorpos [8]. Investigou-se se figitumumab induzida infra-regulação da expressão de IV, bem como os níveis de IGF1R em outras células em vários pontos de tempo diferentes. Curiosamente, figitumumab causado a rápida diminuição de níveis totais de IGF1R, após três horas em SNU668 e SNU739 células (células ir-negativa), mas não significativamente regular negativamente a expressão quer de IR ou de IGF1R nas outras linhas de células (Figura S1). Em contraste, figitumumab não regular negativamente pAKT, vantagens, ou pSTAT3 em células resistentes.

Para determinar a dependência do sinal IGF1R em células sensíveis, nós próxima realizados experimentos com siRNA para silenciar a expressão de IGF1R (Figura S2A). Os resultados indicaram que os siRNAs específicos da sequência IGF1R induzida IGF1R profunda sub-regulação sem influenciar a expressão de IR e mostrou uma clara correlação entre a capacidade de siRNA e figitumumab para inibir a fosforilação de sinais específicos a jusante, tais como p-AKT e P- STAT3, apenas em células sensíveis. Investigou-se também os efeitos do IGF1R knockdown sobre a proliferação de células sensíveis e confirmou que o silenciamento de expressão do IGF1R resultou num efeito anti-proliferativo em células sensíveis (Figura S2B). Em suma, estes resultados mostraram que os efeitos anti-proliferativos de figitumumab são especificamente mediado pela regulação negativa da Akt e STAT3 vias de sinalização, em vez de através da via de sinalização de ERK em células sensíveis que têm uma dependência de sinalização do IGF1R forte.

Para analisar melhor os mecanismos através dos quais figitumumab inibiram a proliferação e sobrevivência de células cancerosas, realizamos uma análise de citometria de fluxo (Figura 1C). Figitumumab induziu um aumento dependente da dose semelhante à percentagem de células em SNU719, HepG2, e SNU368 na fase G1. No entanto, não houve aumento da taxa de apoptose (por cento de células sub-G1; dados não mostrados). Esta análise mostrou que figitumumab diminuiu a viabilidade celular através da inibição do ciclo celular sem induzir apoptose.

A actividade antitumoral de figitumumab em um modelo de tumor xenoenxerto

A seguir, procurou mais uma evidência da atividade figitumumab

in vivo

usando HepG2 para estabelecer xenotransplantes devido à sua sensibilidade aos figitumumab

in vitro

. Para avaliar o efeito de figitumumab no crescimento do tumor

In vivo

, tumores de xenoenxerto foram crescidos em ratinhos nus atímicos. Como mostrado como mostrado na Figura 1D, a administração semanal repetida de uma dose única de figitumumab (6,3 mg /kg de peso corporal) a animais portadores de tumores de HepG2, resultou na inibição do crescimento do tumor substancial para 21 d de dosagem figitumumab e crescimento tumoral significativamente inibido pelo dia 17 ( P 0,01). Além disso, testou-se o efeito de figitumumab em moléculas relacionadas com o IGF1R após um tratamento de d figitumumab. Figitumumab reduziu eficazmente os níveis de IGF1R fosforilada e IRS1 (Figura S3A). Tomados em conjunto, estes dados mostram que o tratamento com uma dose única de figitumumab efetivamente inibiu o crescimento de tumores através da inibição do IGF1R e IRS1 activação.

IGF1R sobrexpresso e IR forma IGF1R /IR receptores heterodiméricos em células sensíveis à figitumumab

para identificar um alvo para prever a sensibilidade figitumumab, expressão de IGF1R relacionados-proteínas e moléculas de sinalização a jusante foram analisadas em paralelo por Western blotting. Curiosamente, descobrimos que células cancerígenas sensíveis a figitumumab todos overexpressed IGF1R; os níveis basais de expressão de RI também foram muito maior comparada com a de outras células resistentes (Figura 2A). Com base em um estudo recente [31], que se espera que figitumumab seria especificamente inibir o crescimento de células que sobre-expressam o IGF1R ou a sua forma fosforilada, mas não aqueles que sobre-expressam RI figitumumab porque não se liga aos IRs [12]. No entanto, os níveis de proteína de IV foram mais sensíveis às figitumumab do que qualquer outra proteína. Como mostrado na Figura 1A, o efeito anti-proliferativo de figitumumab foi mais fraca em células que sobre-expressam única IGF1R, tais como SNU668 e SNU739, do que em células que sobre-expressam tanto IGF1R e IR. Esse achado sugere que diferentes

in vitro

sensibilidades de células para figitumumab está associado a ambos os níveis IGF1R e IR que por sua vez pode afetar o nível de IGF1R /receptores heterodiméricos IR [2].

A ) A análise de imunotransferência de IGF1Rβ total e os níveis de proteína IRβ. Dois tipos de células de carcinoma gástrico e hepatocelulares foram colhidas 24 h após o plaqueamento e imunotransferência com o anticorpo anti-IGF1Rβ, anticorpo anti-IRβ, e anticorpo anti-tubulina α foi realizada. Para ambos os tipos de células, blots representativos de três experiências independentes são apresentados. B) Análise da presença de /receptor heterodimérico do IGF1R IR (hrs) usando imunoprecipitação. proteínas celulares totais (1 mg) a partir de células foram utilizadas para imunoprecipitação com anticorpo anti-IGF1R, separadas por SDS-PAGE a uma voltagem constante (80 V), e Western blotted com um anticorpo anti-IRβ. O blot foi então retirado e sondado com anti-anticorpo IGF1Rβ C) análise quantitativa do IGF1R homodímero, homodímero de IR, e o IGF1R /IR níveis heterodímero utilizando um ELISA. O tampão de lise (100 uL) contendo a mesma quantidade de proteínas (50 ^ g /poço) a partir de 11 linhas celulares de cancro, incluindo células MCF7 (controlo positivo) foram plaqueadas em poços revestidos com anticorpo anti-IGF1R e detectada com um anticorpo de detecção anti-IR. Anti-IR poços revestidas com anticorpo, os padrões de proteína de IR, e o anticorpo de detecção anti-IR foram utilizados como padrões em o receptor heterodimérico de ELISA. A absorvância foi medida a 450 nm. Os valores são expressos como a média ± SEM nanogramas de proteína receptora por 50 ug de proteína total. As linhas celulares são listados de acordo com a sua sensibilidade à figitumumab. Bares = ± SE. D) Efeito da figitumumab em IGF1R IGF1- mediada /IR horas. As células foram, durante 24 h e, em seguida, tratada com figitumumab, IGF1, ou deixada sem tratamento privadas de soro. As células foram incubadas com SNU719 figitumumab (10 ug /mL) durante 1 h a 37 ° C, seguido de estimulação com IGF-1 (100 ng /mL) durante 30 min. A imunoprecipitação foi realizada com um anticorpo anti-IGF1R e Western blotted. Entrada = lisado celular total, sem IP.

Uma vez que é comumente conhecido que IGF1R e IR podem formar heterodímeros quando ambos são co-sobre-expressos devido às suas estruturas altamente homólogas [2], foram realizados experimentos de imunoprecipitação para determinar se IGF1R interage com IR para formar heterodímero em células sensíveis à figitumumab. Tal como mostrado na Figura 2B, as células que sobre-expressam tanto IGF1R e IV, tal como SNU719, HepG2, e SNU368, contido IGF1R /heterodímeros de IV. A linha de células SNU601, que mostrou sensibilidade modesta para figitumumab, também continha IGF1R /heterodímeros IR. Para determinar se figitumumab preferencialmente reconhece receptores heterodiméricos IGF1R /IR em células sensíveis [12], foram realizados ensaios de imunoprecipitação utilizando figitumumab como o anticorpo usado para a imunoprecipi tacão. Níveis significativos de ambos IGF1R e IV em células sensíveis à figitumumab foram detectadas em imunoprecipitados figitumumab, sugerindo que este anticorpo tem uma capacidade superior para reconhecer tanto o homodímero do IGF1R e heterodímero IGF1R /IR predominantemente em células sensíveis (Figura S4).

IGF1R também medido quantitativamente, IV, e os níveis de IGF1R /IR RH usando ELISAs específicos com anticorpos que reconhecem especificamente o IGF1R ou IR e não reagem de forma cruzada uns com os outros. Foram comparados 11 linhas celulares de cancro, incluindo MCF7 (Figura S5), que foi avaliada em um estudo anterior [2]. Os níveis de IR em 0,08 a 2,3 ng /50 ug de proteínas celulares totais, e os níveis de IGF1R variaram de 0,50 a 10,6 ng /50 ug de proteínas celulares totais (Tabela 2). Estes resultados indicaram que a expressão de IGF1R e IV foram semelhantes, e a maioria dos resultados de ELISA estreitamente correlacionado com os resultados de transferência de Western (Figura 2A). A nível celular de IGF1R /IR HRs variou 0,39-0,99 ng /50 ug de proteínas celulares totais. O nível da SHR foi mais elevada em células sensíveis do que as células resistentes (Figura 2C), o que sugere que o nível do receptor heterodimérico do IGF1R /IR expressão significativamente correlacionada com a sensibilidade ao fármaco.

Formação de IGF1 ligando-dependente IGF1R /heterodímero IR é inibida por anticorpo anti-IGF1R

para definir melhor o mecanismo da actividade anti-proliferativa figitumumab relacionada com a expressão de heterodímero IGF1R /IR, também examinámos as alterações na expressão do receptor heterodimérico dependente do ligando (Figura 2D ). Verificou-se que os heterodímeros ligados a ligandos de IGF1, mas essa formação dependente de ligando IGF-1 foi suprimida por figitumumab em células sensíveis. Em SNU368, verificou-se que não apenas figitumumab suprimida IGF1 ligandos que se ligam aos h, mas também a expressão de IGF1R /IR horas na ausência de ligando IGF-1. níveis de receptores heterodiméricos em células SNU638 e SNU354, no entanto, foram relativamente estáveis ​​na presença de figitumumab. Além disso, não houve formação de heterodímero insulino-dependente ou detectável devido à dissociação figitumumab. A fosforilação em resposta a 100 nM de insulina também não foi reduzida por figitumumab (Figura S6). Tomados em conjunto, os resultados desta experiência demonstraram que os heterodímeros de IGF1R /IR responderam bem ao IGF1, e o bloqueio de IGF1 por figitumumab induzida a sub-regulação de IGF1R IGF1 ligando-dependente /IR formação de heterodímeros nas linhas de células sensíveis a fármacos.

sobreexpressão selectiva de IR induz a formação de receptor heterodimérico e aumenta o efeito anti-proliferativo de figitumumab

para avaliar se o efeito da figitumumab foi restrito a SNU719, HepG2, ou SNU368 células, foram realizados estudos em células com baixos níveis de expressão de IR, incluindo SNU739 e SNU886 células, transfectadas com pcDNA3.1-IR que induziu alta expressão de IR. Como mostrado na Figura 3A, os níveis de expressão de IR nas células transfectadas aumentou significativamente comparado com as células transfectadas com pcDNA3.1 (-) vector vazio. Além disso, o HRS IGF1R /RI também foram formados nas células transfectadas-IR. Para examinar se a formação de IGF1R /IR HR devido ao aumento dos níveis de proteína IR poderia aumentar a sensibilidade da droga, foram realizados ensaios de MTT. O resultado mostrou que as células transfectadas IR-se mais sensíveis ao aumento do efeito anti-proliferativo de figitumumab (Figura 3B). Estes resultados indicaram que os níveis elevados de células cancerosas habilitado IR e IGF1R para formar IGF1R /IR horas e aumentaram a sua resposta anti-proliferativa para figitumumab.

A) Efeito da transfecção IR sobre IGF1R níveis /IR de RH em IR- As linhas celulares negativas. As células foram transfectadas com pcDNA3.1 (-) vector de expressão contendo ADNc de RI do tipo selvagem. Uma quantidade igual de lisados ​​a partir de células transfectadas com o vector vazio ou pcDNA3.1 (-) contendo ADNc de IR foi submetido a imunoprecipitação com um anticorpo anti-IGF1R, seguido por análises de Western blot de IRβ e IGF1Rβ. B) Efeito de IR-transfecção na sensibilidade figitumumab. As células transfectadas foram plaqueadas em placas de 96 cavidades, tratadas com figitumumab durante 5 d, e submetido a ensaios MTT. símbolo sólido triângulo com linhas tracejadas = vector vazio (pcDNA3.1-), símbolos de círculo sólidos com linhas = pcDNA3.1 (-) IR. Barra = ± SE. Os valores médios foram obtidos a partir de seis replicados. As experiências foram repetidas em triplicado.

N-glicosilação de IGF1R e IR em células sensíveis

Além da associação entre horas e sensibilidade de drogas, também descobrimos que a glicosilação N-ligados (HFL) é um importante factor adicional que influencia a resposta a figitumumab. Blotting para a subunidade anti-IGF1Rβ revelou duas isoformas cerca de 95 e 105 kDa na maioria das células; No entanto, as células sensíveis mostrou uma fraco de 105 kDa e uma banda de bandas fortes a 115 kDa (Figura 4A). Em suma, IGF1Rβ em células sensíveis à figitumumab migrou mais lentamente em SDS-PAGE do que em células resistentes. Curiosamente, blotting para a subunidade anti-IRβ produziram o mesmo padrão de bandas como a de IGF1Rβ. A fim de determinar se as diferenças na massa molecular entre as células sensíveis e resistentes foram devidas a diferenças no N-glicosilação, que IGF1R enzimaticamente desglicosilada e IR com PNGage F, que removeu todos os tipos de glicanos N-ligados. O tratamento com PNGage F aumentou a mobilidade electroforética de ambos IGF1Rβ IRβ e em todas as células sensíveis à figitumumab (Figura 4B), indicando que IGF1Rβ e IRβ nas células sensíveis foram principalmente ligada em N glicosilada

.

A) A análise de imunotransferência padrão de migração de IGF1Rβ diferente em SDS-PAGE. padrões de mobilidade eletroforética de IGF1Rβ foram analisados ​​em paralelo por bloting ocidental. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes com resultados semelhantes. B) Análise de IRβ e IGF1Rβ N-glicosilada em linhas celulares sensíveis por desglicosilação enzimática com PNGage F. Todas as amostras foram incubadas a 37 ° C durante 12 h com proteínas PNGage F. IGF1Rβ IRβ e foram analisadas em paralelo por Western blotting. Os borrões são apresentados representantes de três experimentos independentes.

Um site NLG específico de IGF1R em células sensíveis à figitumumab

A seguir, determinar se a variação do NLG da subunidade IGF1Rβ poderia ser um outro biomarcador candidato a sensibilidade figitumumab. Para identificar um local específico dentro da subunidade de florins IGF1Rβ, foi utilizada uma combinação de análise de espectrometria de massa (MS) enzimática de-glicosilação e. Depois de avaliar as amostras a partir de células tanto sensíveis e resistentes, identificamos glicosilação site-specific em Asn900 e Asn913 entre os cinco locais putativos de florins (Asn747, 756, 764, 900 e 913) da subunidade IGF1Rβ. Outros sítios de florins (Asn747, 756 e 764) eram difíceis de identificar, devido à presença de múltiplos locais de GNL e à falta de locais de clivagem proteolítica dentro da região da sequência de péptido (Figura 5A). Portanto, nós nos concentramos sobre os resíduos Asn900 e Asn913 para avaliar as diferenças NLG específicas do local entre as células figitumumab-sensíveis e resistentes. Um completo péptido padrões de fragmentação do péptido tríptico (

897NPGNYTAR

904) contidos anteriormente péptido N-glicosilada em Asn900 o (a adição de 1 Da, N + 1) observou-se a partir de ambas as células sensíveis e de resistência, que englobava o resíduo Asn do local de glicosilação em Asn900 (figura S7). Estes resultados demonstraram que a Asn900 foi glicosilado em ambas as células fármaco-resistentes e sensíveis. No entanto, foram identificados peptídeos com NLG em Asn913 apenas nas células sensíveis, mas não resistentes, sugerindo que este site NLG específica não foi glicosiladas nas células resistentes.

A) Identificação do local de ocupação NLG de subunidades IGF1Rβ . subunidades IGF1Rβ contendo locais de glicosilação ligados a N (Asn747, Asn756, Asn764, Asn900 e Asn913) foram isolados de ambas drogas sensíveis (SNU719, HepG2 e SNU368) e resistência células (SNU638 e SNU354) e identificados por conjunto MS por um aumento de 1,0 da da massa correspondente de Asn, como resultado da conversão a partir de N-ligada Asn glicosilada para Asp. Toda a NLG em Asn900 em ambas as células sensíveis e resistência foram determinados a ser ocupado com N-glicosilação (retângulo preenchido). Florins em Asn913 das linhas de células sensíveis (HepG2, SNU719, e SNU368) foram determinadas para ser ocupada com N-glicosilação (rectângulo a cheio), enquanto que N-glycosites em Asn913 das linhas de células de resistência (SNU638 e SNU354) foram consideradas desocupada com N-glicosilação. (Retângulo aberto). B) Efeito da mutação local N913Q em padrões de mobilidade eletroforética de IGF1Rβ. células Huh7 (uma linha de células do IGF1R-negativa) foram transfectadas com pcDNA3.1 vazio (-) vector de expressão (Controlo), pcDNA3.1 (-) contendo de tipo selvagem do IGF1R ADNc (IGF1R WT) ou pcDNA3.1 (- ) com cDNA tipo de mutação IGF1R (IGF1R N913Q). Uma quantidade igual de lisato de células a partir das células transfectadas, em seguida, foi submetida a análise de Western blot para IGF1Rβ. C) Efeito de mutação sítio N913Q sobre a formação de receptores heterodiméricos IR IGF1R /. Uma quantidade igual de lisado celular a partir de células transfectadas foi então submetida a imunoprecipitação (IP) com o anticorpo anti-IGF1R, seguido por análise de Western blot para IRβ e IGF1Rβ. Entrada = lisado celular total, sem IP. D) Efeito da mutação no local N913Q na localização IGF1R. Um ensaio de imunofluorescência foi realizada para se observar a localização do IGF1R. IGF1R reactividade foi visualizada por microscopia confocal de varrimento laser (Barra de escala: 30 mm). Imagens representativas são mostrados. Verde: IGF1R, Azul: núcleos. E) Efeito da mutação no local no N913Q sensibilidade figitumumab. células Huh7 transfectadas com pcDNA3.1 vazio (-) vector, o ADNc do IGF1R vector contendo de tipo selvagem, ou vector contendo ADNc de IGF1R Tipo de mutação (N913Q) foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com concentrações crescentes de figitumumab durante 120 h (esquerda ). percentagens de viabilidade celular com 1 ng /mL figitumumab (à direita). Seis cavidades replicadas foram incluídos em cada análise, e pelo menos três experiências independentes foram realizados. Dados a partir de poços em duplicado estão apresentados como a média das restantes células. *

P-

valores 0,05; **

P-

valores . 0,01

Para verificar ainda o site NLG consenso (N913) e sua importância funcional, um mutante IGF1R dirigida ao local foi construído. Asn913 foi substituído por um resíduo glutamina para se obter um mutante N913Q (Asn913 LN). Para avaliar as consequências funcionais desta mutação, de tipo selvagem e a construção do IGF1R mutantes foram expressos transitoriamente em células Huh7. Como mostrado na Figura 5B, os níveis de expressão de tipo selvagem e mutante de IGF1R em que as células transfectadas foram notavelmente aumentada em comparação com células transfectadas com pcDNA3.1 vazio (-) do vetor. No entanto, a mutação N913Q kDa apareceu como uma banda 105 que migraram mais rápido do que a proteína de tipo selvagem que produziu um padrão de migração semelhante da proteína na electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) em SNU719 células. Estas observações confirmaram que a banda ~115 kDa em células sensíveis correspondeu a IGF1R que foi florins em N913.

Curiosamente, parece que a remoção de açúcares ligados a N de N913 do IGF1R, não teve nenhum efeito aparente sobre as formações de RHs IGF1R /IR. Pelo contrário, esta mutação única afetou sobre o estado de florins do receptor, porque os níveis de RH foram notavelmente aumentada nas células transfectadas-IGF1R mutantes e o receptor mutante mostrou um aumento da taxa de migração em SDS-PAGE (Figura 5C). Este resultado sugeriu que a remoção do açúcar ligado em N a partir do site N913 alterou o perfil de SDS-PAGE bandas de IGF1Rβ mas não teve nenhum efeito sobre a heterodimerização de IGF1R e IR.

florins regula a localização do IGF1R para a membrana plasmática e determina a sensibilidade figitimumab

próxima realizado um ensaio de imunofluorescência para determinar se a mutação do local de consenso o N913 impedido expressão na superfície celular do IGF1R. As células que expressam o tipo selvagem do IGF1R tinha uma abundância de IGF1R ligada à membrana plasmática, enquanto a forma mutante foi mantida principalmente no interior das células com relativamente pouca ou nenhuma localização da membrana de plasma (figura 5D). Para avaliar a funcionalidade de GNL deficiente-IGF1Rs em comparação com a forma de tipo selvagem, foram realizados ensaios MTT. Os resultados mostraram que o efeito anti-proliferativo de figitumumab foi aumentada por sobre-expressam o tipo selvagem do IGF1R, enquanto que as células transfectadas com o IGF1R mutante não apresentaram quaisquer alterações na sensibilidade ao fármaco (Figura 5E). Estes resultados sugerem que a falta de açúcares ligados a N em N913 na IGF1R causada localização predominantemente citoplasmática do receptor de tipo selvagem enquanto que IGF1R pareceu localizar para a membrana plasmática com o aumento da sensibilidade à figitumumab. Portanto, florins em N913 parece ser essencial para o IGF1R e resultados funcional ligado à membrana em um aumento da resposta ao anticorpo anti-IGF1R em células cancerosas.

Discussão

Figitumumab (CP-751,871) tem sido testado de forma activa em doentes com mieloma múltiplo, mas a identificação de biomarcadores e mecanismos são necessários para prever as respostas ao tratamento e, assim, ajudar com a seleção dos pacientes para maximizar os benefícios clínicos. Os dados do presente estudo sugerem que o nível de HRs IGF1R /IR pode ser possível um biomarcador de diagnóstico para prever a sensibilidade ao anticorpo anti-IGF1R, particularmente no GC e células de carcinoma hepatocelular. Estudos anteriores relataram que o nível de IGF1R em si podem ter valor preditivo na mama, pulmão, cancros colo-rectais e [31], [34]. No nosso estudo, no entanto, nem a expressão do IGF1R sozinho, nem os níveis de outras moléculas associadas IGF1R, incluindo IRS1, poderia ser utilizada para prever a sensibilidade suficientemente figitumumab (dados não mostrados). Em vez disso, descobrimos que um fator importante para a resposta ao figitumumab parecia ser elevados níveis de expressão de IR, pois apenas as células sensíveis à droga mostrou altos níveis de IR, bem como IGF1R (Figura 2A). Considerando que vários estudos anteriores mostraram que a sobre-expressão de ambos IGF1R e IV pode levar a um aumento da formação de IGF1R /IR horas e expandir o grupo de sítios de ligação de IGF1 em várias malignidades humanas [2], [3], [27], [35 não.