Abstract

No momento do diagnóstico, a maioria dos pacientes com câncer pancreático apresentam doença avançada quando ressecção curativa há mais tratamentos terapêuticos viáveis ​​e atuais são ineficazes. Uma melhor compreensão de alvos moleculares para intervenção eficaz do câncer de pâncreas é, portanto, urgente. O Met receptor tirosina cinase é um candidato implicado no cancro pancreático. Notavelmente, Met mais é expresso em até 80% dos cânceres de pâncreas invasivos, mas não em células ductais normais correlacionados com pior sobrevida geral do paciente e aumento das taxas de recorrência após ressecção cirúrgica. No entanto, o papel funcional da Met sinalização em câncer pancreático permanece mal compreendido. Aqui usamos interferência de RNA para examinar directamente a importância pathobiological do aumento da sinalização Met para câncer de pâncreas. Mostramos que Met knockdown em células tumorais pancreáticas resulta em diminuição da sobrevivência celular, invasão celular, e migração de colágeno I

in vitro

. Usando um modelo ortotópico de câncer pancreático, nós fornecemos

in vivo

evidência de que Met knockdown reduziu a carga tumoral correlacionando com a diminuição da sobrevivência celular e angiogênese do tumor, com efeito mínimo sobre o crescimento celular. Notavelmente, relata que a sinalização Met regula a secreção da quimiocina pró-angiogénico interleucina-8 /CXCL8. Os nossos dados mostram que os interleucina 8 receptores CXCR1 e CXCR2 não são expressos em células de tumor pancreático, sugere um mecanismo parácrino pelo qual sinalização Met regula a secreção de interleucina-8 para remodelar o microambiente do tumor, uma descoberta nova que pode ter implicações clínicas importantes para melhorar a eficácia dos tratamentos para o cancro pancreático

Citation:. Colina KS, Gaziova I, Harrigal L, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et al. (2012) Met receptor da tirosina quinase de sinalização induz a secreção da Angiogênica quimiocinas Interleucina-8 /CXCL8 no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (7): e40420. doi: 10.1371 /journal.pone.0040420

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2012; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 17 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hill et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde CA-119075 para LAE, DK-052067 a CDL, e CA-118405 para SKS K.S.H. foi apoiado por uma bolsa de formação NIH Formação /NCI Multidisciplinar em Cancer Research, T32 (CA117834-03). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um câncer agressivo com uma taxa de sobrevida do paciente média de menos de um ano, tornando-se a quarta principal causa de mortes por câncer nos Estados Unidos [1]. A alta taxa de mortalidade de pacientes PDAC é devido a vários fatores. Na ausência de métodos de rastreio eficazes, 80-85% dos pacientes apresentam doença avançada, que muitas vezes se opõe a ressecção curativa [2]. Além disso, os tratamentos para a doença avançada são bastante ineficazes [3], [4]. Assim, existe uma necessidade urgente para compreender a base molecular de crescimento PDAC para identificar alvos de alto valor terapêutico. A análise genética dos tumores pancreáticos recentes identificaram várias mutações genéticas comuns para 75-90% dos casos de pacientes importantes para PDAC iniciação e o desenvolvimento subsequente de neoplasias intra-epiteliais pancreáticas pré-invasivas (PanINs 1-3) [5] – [7]. De acordo com isso, modelos de ratos geneticamente modificados para PDAC confirmaram o papel de mutações genéticas específicas no início e desenvolvimento da doença em estágio inicial. Exemplos são PanIN-1 (activação Kras, perda de Notch2) [8], [9], PanIN-2 (perda de mutações de função no gene supressor tumoral p53 e p16INK4a) [10] e PanIN-3 (inactivação de p53, SMAD4 /DPC4 e BRCA2) [8], [11], [12]. Em contraste com estas lesões pré-invasivas início de carreira, PDAC tem uma falta de mecanismos definidos.

Várias vias de sinalização provavelmente estão envolvidos no PDAC. Um candidato é o Met /fator de crescimento de hepatócito (HGF) eixo sinalização. Sob condições fisiológicas, a quinase Met tirosina do receptor e o seu ligando HGF são expressos em níveis baixos em células acinares pancreáticas e compartimento estromal, respectivamente [13] – [15]. vinculativo parácrina do HGF aos resultados reuniram-se em fosforilação do receptor levando ao aumento da sobrevivência celular e motilidade [16], [17]. Em contraste com os pulmões e adenocarcinomas gástricos em que mutações de activação prolongar Met sinalização, tais mutações Met ganho-de-função ainda têm de ser identificados em PDAC. ductos pancreáticos normais expressam baixos níveis de Met. Por outro lado Met é sobre-expresso em até 80% dos casos PDAC [18], é um forte indicador para o aumento das taxas de recorrência e, em geral pobres sobrevida do paciente PDAC [13], [19] – [22]. expressão Met está presente em até 29 linhas de células pancreáticas tumorigênicos com diferentes origens genéticas, incluindo ASPC-1, Panc-1, BxPC-3 e células Terno-2 [13], [23]. Uma excepção é a linha de células MIA PaCa-2 fracamente diferenciado, que não expressa endógena Met [13], [23]. Recentemente, o inibidor de molécula pequena SGX523 Met foi relatado para reduzir o crescimento e a infiltração de tumores pancreáticos subcutâneas [24] aumentar o interesse no Met como um alvo terapêutico potencial para a doença avançada. No entanto, o papel preciso da Met sinalização para PDAC continua por resolver.

Neste estudo, foi utilizada a interferência de RNA para reduzir Met sinalização em xenoenxertos pancreáticas humanas usando um

in vivo

rato modelo ortotópico. Met knockdown células (MetKD) manteve-se competente para a formação de tumores pancreáticos ortotópicos

in vivo

; No entanto, os xenoenxertos MetKD resultantes foram significativamente inibidos em relação ao crescimento de tumores resultantes de células de controlo que expressam um não segmentação (NT) shRNA. A análise imunohistoquímica de xenoenxertos MetKD mostraram aumento da apoptose celular acompanhada por proliferação celular reduzida e média densidade de vasos (MVD na periferia de xenoenxertos MetKD. Coerente com esse cenário, mostramos que Met knockdown reduz a secreção de interleucina-8 /CXCL8 (IL-8) , um potente quimioquina pro-angiogénico que funciona como um regulador parácrino da proliferação de células endoteliais, um activador de neutrófilos e um quimioatraente para fibroblastos e outras células do sistema imune [25]. a nossa descoberta de que o Met é um regulador a montante de IL-8 a secreção é significativa e sugere um mecanismo pelo qual a sinalização Met poderia regular o câncer de pâncreas

in vivo

, um romance descoberta que pode fornecer oportunidades únicas para a intervenção clínica.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

Todos os animais foram tratados de acordo com o Gabinete para a Protecção de Pesquisa de Riscos (OPRR) e as diretrizes animal Welfare Act no âmbito de um protocolo de animais aprovado pela Universidade do Texas MD Anderson Institutional animal Care e do Comitê Use. Este estudo foi aprovado pela Universidade do Texas MD Anderson Institutional Animal Care e do Comitê Use.

Antibodies, linhas celulares, e Manutenção

Um anticorpo contra o terminal C do Met (C-28 ) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology. Um anticorpo monoclonal de ratinho contra β-actina foi adquirido de Sigma. anticorpos anti-fosfo tirosina específicas do local para Met Y1234 /1235 eram de Upstate. Um anticorpo específico para o domínio extracelular de Met (anti-hHGFR) foi adquirido a R D Systems, Inc. Os anticorpos contra Ki67 foram adquiridos a Abcam, caspase-3 clivada, ERK1 /2, e fosfo ERK1 /2 T202 /Y204 ( pERK) anticorpos, AKT e fosfo AKT (S473) foram de Cell Signaling. anticorpos CD31 foram adquiridos da PharMingen e HGF recombinante humano e murino a partir de Pepro Tech. células ASPC-1, BxPC-3 e MIA PaCa-2 foram adquiridas a partir da ATCC e impressões digitais de ADN para cada linha verificada por PCR específica do local (SeqWright). células BxPC-3 foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco) com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1 x penicilina /estreptomicina. células ASPC-1 foram mantidas em meio de Dulbecco modificado por Eagles (DMEM: Gibco) com 10% de FBS e 1 x penicilina /estreptomicina. MIA PACA-2 células que expressam de forma estável exógena tipo selvagem Met foram descritos em outro [23]. 293FT células (Invitrogen) foram co-transfectadas com o envelope de lentivírus (pMD2G), a embalagem (psPAX2), e plasmídeos shRNA dirigidos contra Met humana (Sigma) para produzir lentivírus que codificam o shRNA constrói. Citometria de fluxo nós analisamos quatro plasmídeos lentivirais que codificam sequências de shRNA exclusivos dirigidos contra a região de codificação ou o 3’UTR de Met humana e examinaram sua capacidade de knockdown expressão Met. Foram identificados dois vírus shRNA (# 2, Sigma NM_000245.2-3702s1c1 e # 5, Sigma NM_000245.2-4462s1c1) que rotineiramente resultou em expressão reduzida de Met (não mostrado). BxPC-3 e células ASPC-1 plaqueadas em placas de cultura de tecidos foram infectadas com diluições seriadas de codificação lentivírus MetKD shRNA-2 (5′-CCGGAGACTCATAATCCAACTGTAACTCGAGTTACAGTTGGATTATGAGT CTTTTTTG-3 ‘), MetKD shRNA-5 (5′-CCGGGCACTATTATAGGACTTGTATCTCGAGATACAAGTCTTATAATAGTGCTTTG-3′) ou shRNA controlo NT (5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3 ‘), na presença de 8 ug /mL de brometo de hexadimetrina antes da selecção com 5 ug /mL de puromicina para 7 dias, e as colónias foram mantidas em meios contendo 2,5 ug /mL de puromicina para dois meses. plasmídeos pcDNA que codificam CXCR1 e CXCR2 foram um presente amável de Xavier Navarro, UTMB Galveston.

Citometria de Fluxo

1-2 × 10

6 células foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm e na sequência de adesão foram overnight privadas de soro. A citometria de fluxo para a superfície manchada Met foi realizada utilizando uma matriz de BD FACS como anteriormente descrito [23].

Anchorage ensaios de crescimento independente

uma camada inferior de agarose a 1% diluído em meio contendo 1% de FBS com ou sem 100 ng /mL de HGF (PeproTech) foi depositada sobre 4 placas de cultura de tecido. Depois de a camada inferior solidificou à temperatura ambiente durante 30 min, 5 x 10

3 células foram ressuspensas em meios contendo 1% de FBS com ou sem 100 ng /mL de HGF e uma concentração final de 0,4% de agarose. A célula e mistura de agarose foi colocado sobre as placas de cultura de tecidos contendo 1% de agarose e deixou-se solidificar a 4 ° C durante 10 min. Uma vez solidificado, foi adicionado meio contendo FBS a 1%, com ou sem HGF e as células cultivadas durante 6 semanas num banho a 37 ° C incubadora com 5% de CO

2. Meios suplementados com o HGF foi trocado a cada 2-3 dias.

invasão celular e Ensaios de Migração

Os ensaios de migração e invasão celular foram realizados como previamente descrito [26]. Os ensaios de cicatrização de feridas foram realizados como previamente descrito [23]. As imagens foram capturadas usando um microscópio invertido Eclipse TE2000-L (Nikon) e analisados ​​utilizando MetaMorph v7.3.1. (Molecular Devices). Para a migração de células vivas em colagénio I, as células foram durante a noite (1% FBS) e depois plaqueadas em placas de cultura de tecidos com fundo de vidro de 35 mm com depleção de soro pré-revestidos com 15 ug /mL de colagénio de cauda de rato I (BD Bioscience) durante a noite a 4 ° C. As células foram deixadas aderir durante 1 hora antes do tratamento com meio contendo 1% de FBS sozinho ou com 100 ng /mL de HGF. As placas foram colocadas num sistema de imagem de células vivas BioStation (Nikon) e a temperatura da câmara foi deixada a equilibrar durante 20 min, após o que as imagens de cada campo foram recolhidos cada 2 min durante pelo menos 2 h. A migração celular foi avaliado como o comprimento total caminho em micrômetros percorridos e velocidade de celular (microns /min) foi determinada utilizando NIS Elements Software (AR3.10).

Ratos e Estudos tumorais ortotópico

ASPC -1 (5 × 10

5) ou BxPC-3 (1 × 10

6) NT, MetKD-2 ou MetKD-5 linhas de células que expressam os níveis equivalentes de luciferase de pirilampo, foram injectados em 50 ul de PBS em o corpo do pâncreas de 5-6 semanas de idade murganhos atímicos nu macho (NCI-Charles River), como descrito anteriormente [26]. imagem de bioluminescência foi realizada a cada 10 dias, utilizando um criogenicamente arrefecida IVIS 100 sistema de imagens acoplado a um computador de aquisição de dados estar em execução imagem de software (Xenogen Corp) como anteriormente descrito [26]. Cada animal foi normalizada para a sua intensidade de sinal no dia 10 para ajustar as variações de sementeira inicial do tumor e é relatada como a vezes de aumento no volume do tumor medido como o número de fotões emitidos a partir do tumor por segundo por centímetro

2. Na necropsia, tumores primários foram cirurgicamente removidos e pesados, e os tecidos quer fixado com formol para avaliação histológica ou flash congelado para análise posterior.

Transcrição PCR quantitativa reversa

Flash xenotransplantes congelados foram homogeneizados em Trizol reagente (Invitrogen) e RNA total isolado de acordo com as instruções fabrica. 500 ng de ARN foi convertido em cDNA usando a síntese de ADNc iScript (BioRad) com os iniciadores de hexâmeros aleatórios. 2 uL do ADNc foi utilizado como molde para tempo real quantitativa relativa PCR utilizando SYBR Verde PCR Master Mix (Applied Biosystems). SYBR verde incorporação foi medida ao longo de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min, utilizando sequências iniciadoras para Met (para a frente 5 ‘TAAGTGCCCGAAGTGTAAGC -3′ e reverso 5’- -3 CTTGCCATCATTGTCCAACAAAGTCCC ‘) e GADPH (directo 5′-CAATGACCCCTTCATTGACCTC-3′ e inverso 5’-AGCATCGCCCCACTTGATT-3 ‘). O nível de mRNA Met foi determinada através da normalização da C

valor de T para o C

T de GAPDH humana usando o comparativo C

T (ΔΔ

C

T) método descrito pelos fabricantes (Applied Biosystems). Para os estudos utilizando linhas de células, o cDNA foi sintetizado a partir de ARN total utilizando Accuscript (Stratagene) e a PCR realizada utilizando AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems) utilizando os seguintes conjuntos de iniciadores para CXCR1 humano, 5′-TGGGAAATGACACAGCAAAA-3 ‘(para a frente) e 5’-AGTGTACGCAGGGTGAATCC-3 ‘(inverso), CXCR2 humano, 5′-ACTTTTCCGAAGGACCGTCT-3′ (directo) e 5’-GTAACAGCATCCGCCAGTTT-3 ‘(inverso), GADPH humano, 5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′ (para a frente) e 5’-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3 ‘(inverso) foram usadas. Os produtos amplificados foram resolvidos em geles de agarose a 2% contendo brometo de etídio e visualizados utilizando um sistema de documentação de gel de AlphaInnotech (AlphaInnotech).

A imuno-histoquímica.

tumores ortotópicos foram processadas para imuno-histoquímica como previamente descrito [26] [27], utilizando anticorpos contra Met (C-28), Ki67 ou caspase-3. Todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina e cegado para que pontuação foi realizada de uma maneira imparcial. A proliferação e a apoptose foi quantificada por determinação da percentagem de células que eram positivas para Ki67 e clivada da caspase-3, respectivamente. Três campos aleatórios por corte tumor onde fotografada usando um objectivo de 40 × em um Zeiss Axiovert 200 microscópio com uma câmera de cor Zeiss MRC5. O número de coradas positivamente (C

P) e células negativas para não coradas (C

N) foram contadas usando Metamorph v7.3.1 (Molecular Devices). A percentagem de células de coloração positiva (% P) foi determinada utilizando a seguinte equação:% P = (C

P /(C

P + C

N)) * 100. A percentagem de necrose (% N) foi determinada em H espécimes de tumor de xenoenxerto coradas E fotografada usando uma objectiva 5 × e analisados ​​utilizando MetaMorph v7.3.1. A percentagem de necrose (% N) para cada espécime de tumor foi calculado utilizando a seguinte equação% N = (A

N /A

T) * 100, onde A

N e A

T representam a necrótico e áreas totais, respectivamente. CD31 /plaquetas molécula de adesão celular endotelial de coloração 1 (PECAM-1) foi avaliada em tecidos pancreáticos congelados que foram seccionados (8-10 uM), montado sobre corrediças carregado positivamente e secos ao ar durante 30 minutos e coradas utilizando anticorpos CD31, tal como descrito anteriormente [28]. As amostras de controlo expostas a um anticorpo secundário sozinho não revelaram nenhuma coloração específica. Para a quantificação da densidade média do vaso (MVD) em secções coradas para CD31, 3 campos por parte do tumor foram fotografadas utilizando uma objectiva de 20 × num Zeiss Axiovert 200 microscópio e o número de vasos positivos para CD31 discretas por campo foram marcados.

a angiogénese matrizes e ELISA

3 × 10

6 as células foram semeadas numa placa de cultura de tecidos de 10 cm, e as células foram deixadas a aderir durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram lavadas em meio com FBS a 1% e soro empobrecido durante a noite antes do tratamento com DMEM contendo FBS a 1% por si só (sem ligando) ou com 100 ng /mL de HGF durante 48 h. O meio condicionado foi recolhido e centrifugado para remover quaisquer restos celulares antes da análise. Human Angiogenesis matrizes, VEGF (R D Systems, Inc) e IL-8 humana ELISA (BD Biosciences) foram realizados em meios condicionados tal como descrito pelo fabricante. Para quantificar o VEGF do tumor e os niveis de IL-8, tirar amostras de tumor congeladas foram processadas como anteriormente descrito [29]. ELISA foi executada utilizando a proteína de 10 ug diluída em 100 ul com tampão RIPA (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 0,1% de SDS, 1% de NP-40 (Igepal), 0,5% de ácido desoxicólico) contendo protease (2 mg /ml de aprotinina, inibidores de 2 mg /mL de pepstatina A, e 2 mg /ml de leupeptina) e fosfatase (NaF 10 mM, Na 2 mM de

3VO

4). os níveis de VEGF e proteína IL-8 detectados em xenoenxertos por ELISA são apresentados como pg de IL-8 ou VEGF por lisado ug de proteína (BCA Ensaio, Pierce).

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizada através do software GraphPad Prism (v4), utilizando uma análise de um ou dois de variância (ANOVA) com um Bonferroni análise post-hoc para determinar a significância estatística entre os grupos.

Resultados

Stable knockdown de Met

inibidores farmacológicos apoiar um papel oncogênico para maior Met sinalização em vários tumores sólidos. No entanto, a evidência direta apoiando o significado patológico de aumento dos níveis de Met para PDAC continua por resolver. Por conseguinte, utilizou-se RNA de interferência para knockdown Met nas linhas de células de pâncreas humano BxPC-3 e ASPC-1, uma vez que são derivadas de cancros do pâncreas primários humanos e expressam níveis elevados de Met de tipo selvagem. Enquanto que as células BxPC-3 são do tipo selvagem para Kras e p53 mutante expressa, células ASPC-1 são mutante para Kras e p53, mutações-chave importantes para a transformação celular e o início da doença em estágio inicial [30]. Duas populações policlonais de células Met knockdown (MetKD) expressando diferentes sequências shRNA específicas Met (MetKD-2 e MetKD-5) foram estabelecidos utilizando lentivírus recombinantes. populações policlonais de ASPC-1 BxPC-3 ou células que expressam um shRNA NT foram usadas como controlos. análise de Western confirmou knockdown estável do total Met e HGF activada Met em BxPC-3 e ASPC-1 MetKD-2 e MetKD-5 células em relação a células NT. pERK foi detectado apenas em células BxPC-3 tratadas com HGF, consistentes com o tipo selvagem KRAS destas células. Como esperado, os níveis mais baixos de pERK HGF-estimuladas foram detectados em células BxPC-3 MetKD quando em comparação com células que expressam NT (Figura 1A). Por outro lado, a análise ocidental detectados níveis elevados de pERK em HGF-tratadas e células ASPC-1 Met KD e NT não tratados de acordo com o estado Kras oncogénica uma destas linhas celulares (Figura 1B). níveis de pAkt comparáveis ​​foram rotineiramente detectada em resposta a HGF em células MetKD e NT. Citometria de fluxo análise confirmou reduzida expressão de superfície celular Met na MetKD BxPC-3 e células ASPC-1 quando comparado com células de controlo NT (Figura 1C 1D).

BxPC-3 (A) ou ASPC- 1 células (B) infectadas com lentivírus recombinante expressando Met knockdown shRNAs (2 ou 5) ou um não segmentação (NT) shRNA foram tratadas sem (-) ou com (+) de HGF e examinado por análise de Western para PMET (Y1234 /1235) , Met, pErk1 /2, ERK1 /2, pAKT, AKT e os níveis de p-actina (n = 3). Fluxo reduzido expressão de superfície Met citometria detectado em BxPC-3 (C) e ASPC-1 (D) em relação a células células NT MetKD. Os valores são expressos como a média +/- SEM modo (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). Reduziu o crescimento independente de ancoragem de BxPC-3 (E) e as células ASPC-1 (F) MetKD em moles em relação às células de agar NT (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). knockdown Met teve um efeito mínimo no crescimento de BxPC-3 (G) e as células ASPC-1 (H) MetKD relativamente a células NT.

Para avaliar se a sinalização Met afecta o potencial tumorigénico de BxPC- 3 e ASPC-1 células, realizamos ensaios de crescimento independente de ancoragem em agar mole. células NT e MetKD foram semeadas em 0,4% de agarose na presença ou ausência de HGF e o número de colónias resultantes, como definido como um grupo de três ou mais células foi marcado. Em linhas de células NT, HGF tratamento resultou num aumento significativo no número de colónias presentes no agar macio consistente com um papel para Met sinalização no crescimento celular independente de ancoragem. Por outro lado, as células tratadas MetKD-HGF mostrou capacidade reduzida para crescer de uma maneira independente da ancoragem em ágar mole (Figura 1E 1F). A seguir, examinado o efeito de Met knockdown sobre a proliferação celular induzida por HGF. Curiosamente, a proliferação induzida por HGF não foi afectada por Met knockdown no BxPC-3 e ASPC-1 células (Figura 1G 1H).

O efeito de Met knockdown sobre a migração celular induzida por HGF foi examinada utilizando um ferida ensaio de cura. Como mostrado nas Figs 2A B (Informações de Apoio S1), as células MetKD consistentemente mostraram redução da motilidade induzida por HGF em comparação com células NT. Utilizando um ensaio de invasão em Matrigel com base, que também mostram que a perda de Met sinalização significativamente reduziu o fenótipo invasivo de BxPC-3 MetKD células (Figura 2C). PDAC é caracterizada por um estroma desmoplástico abundante que é altamente enriquecidos em componentes da matriz extracelular, incluindo o colagénio I. Como resultado, foram realizados estudos de imagem de células vivas para medir as diferenças de migração induzida por HGF de linhas celulares ASPC-1 NT e MetKD semeadas em colagénio I (Figura 2D). As células foram deixadas aderir durante 1 hora em colagénio I antes do tratamento com HGF, após o que vivem migração celular foi examinado por medição do comprimento total do caminho de células migrantes ao longo de um período de 2 h. Na ausência de HGF, comprimentos de trajecto migratórias comparáveis ​​foram detectados por ASPC-1 e células MetKD NT (NT: 87,2 uM +/- 12,0; MetKD-2: 112,1 +/- 12,3 uM; MetKD-5: 76,5 uM +/- 7.0) (Figura 2D). O tratamento com o HGF aumentou o comprimento do percurso de células APSC NT-1 (216,7 +/- 13,1 uM), correlacionando-se com o aumento da velocidade de célula (dados não mostrados). Por outro lado, o tratamento de HGF MetKD-2 e células MetKD-5 não resultou em aumento de comprimento da trajectória (Filme S1, S2 filme, Filme S3). Consequentemente, Met knockdown resulta em diminuição da migração celular ASPC-1 em colagénio I.

de soro empobrecido, confluentes ou NT MetKD BxPC-3 (A) ou ASPC-1 células (B) foram feridas com um zero, seis regiões marcadas, e imediatamente fotografadas (0 h) antes do tratamento com HGF. regiões idênticas ao longo do arranhão foram fotografadas após 3, 9, 18, e 24 horas e os valores foram normalizados para o tamanho inicial da zero a 0 h. A migração celular é avaliado como o encerramento% de intervalo em cada ponto de tempo (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). MetKD reduz a invasão de células BxPC-3 em resposta a HGF em relação a células de controle (C). Os valores representam a mudança vezes no número de células /campo e são relatados como a média +/- SEM (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). imagens de células vivas de ASPC-1 células MetKD semeadas em colágeno I-revestido de fundo de cultura de células pratos show de vidro diminuiu a migração de células em resposta a 100 ng /mL HGF (D). As imagens foram recolhidas a cada dois minutos para um total de 120 minutos e os dados são expressos como o comprimento do percurso média +/- SEM por condição (*** p 0,001; ANOVA, n 30 células).

Met Knockdown danifica

in vivo

tumor crescimento

Nós procurou examinar a consequência do Met interrupção no crescimento do tumor

in vivo

, utilizando um modelo de camundongo ortotópico de câncer pancreático . Dado que diferenças de espécies cruzadas na interacção do HGF com murino Met humana tem sido relatada [31], utilizou-se primeiro análise de Western para confirmar a activação da Met humano por HGF de murino em BxPC-3 e células ASPC-1. Usando condições que resultam na fosforilação máxima Met por HGF humano, mostramos que Met humano foi activado pelo ligando de murino e humano usando o site anticorpos fosfo-tirosina específicos anti-Met e análise de Western (Figura 3A 3B). Sob estas condições de HGF humano foi 3-5 vezes mais eficaz do que o HGF na indução de fosforilação de murino Met, consistente com relatórios anteriores que murino HGF é funcionalmente activo para o receptor humano

embora com uma afinidade inferior [32], [ ,,,0],33].

análise de Western confirmou que murino (mHGF) e HGF humano (hHGF) activar Met humana em BxPC-3 (a) e ASPC-1 (B) As linhas celulares NT. Nenhuma activação Met foi observada na ausência do ligando. Os valores são expressos como média densidade relativa de PMET /Met +/- SEM (** p 0,01 *** p 0,001; ANOVA, duas experiências separadas). O tamanho do tumor foi medido a cada 10 dias, utilizando

In vivo

bioluminescente para imagiologia BxPC-3 (C) ou ASPC-1 (células D) após a injecção e são relatados como média tamanho do tumor em fotões /sec /cm

2 (* p 0,05, ** p 0,01; ANOVA). imagens bioluminescentes representativos são mostrados imediatamente antes da necropsia no dia 30 (BxPC-3) ou 45 dias (ASPC-1). O peso e a incidência total (%) de BxPC-3 tumores primários (E) e ASPC-1 (F) tumores primários e metastáticos são listados. Estável knockdown de ARNm Met em BxPC-3 (G) e ASPC-1 (H) MetKD xenoenxertos foi confirmada utilizando qRT-PCR. Os dados foram normalizados para GADPH e são relatados relativamente ao respectivo controlo NT (** p @ 0,01; *** p 0,001; ANOVA, n = 2).

Para examinar o efeito knockdown de Met no crescimento PDAC, utilizou-se BxPC-3 e ASPC-1 células pré-marcadas com luciferase do pirilampo para seguir a carga tumoral de forma não invasiva [26]. Números iguais de células de controlo e MetKD NT foram injectados no corpo do pâncreas de ratinhos nus atímicos e a carga de tumor quantificadas utilizando

In vivo

bioluminescência [26]. Forte crescimento do tumor foi detectado em ratinhos injectados com células de controlo que expressam o shRNA NT (Figura 3C 3D). Por outro lado, a incidência de tumor e o peso foi significativamente reduzida nos murganhos injectados com MetKD BxPC-3 ou ASPC-1 células. No momento da necropsia (40 e 45 dias para BxPC-3 e ASPC-1 injectado ratinhos, respectivamente), tumores pequenos massas foram prontamente detectadas no pâncreas injectados com BxPC-3 MetKD-2 células, mas não com BxPC-3 células MetKD-5 (Figura 3C e 3E). Isto não foi devido a problemas com a semeadura do tumor, como pequenos campos de tumor foram facilmente detectados microscopicamente em H E cortes corados de tumores MetKD consistente com os dados de bioluminescência (Informações de Apoio S2). Em ratinhos injectados com células ASPC-1, células MetKD mostram reduzido o tamanho do tumor primário no modelo ortotópico em comparação com ratinhos injectados com células NT (Figura 3D), correlacionando-se com a diminuição da incidência de local (fígado) e distante (pulmão) metástase tumoral (Figura 3F). qRT-PCR confirmou níveis reduzidos de ARNm Met em tumores MetKD quando comparados com os tumores NT (Figura 3G 3H). Assim, a perda de Met sinalização em BxPC-3 e ASPC-1 células prejudica a carga tumoral

In vivo

.

Met sinalização remodela o Tumor Vasculature

ortotópico ASPC-1 tumores foram retirados e processados ​​para análise posterior. Imunoprecipitação e análise de Western de Met humana nos tumores ortotópicos confirmou a ativação de humano Met por murino HGF

in vivo

(Figura 4A), de acordo com os nossos estudos anteriores que mostram a ativação do ser humano Met por HGF de rato recombinante (Consulte Figura 3A 3B). Como os níveis mais baixos esperados de fosfo-Met foi detectado nos tumores Met KD relativos a xenoenxertos NT (Figura 4A). Curiosamente, os tumores produzidos por células ASPC-1 MetKD rotineiramente continha extensas regiões de necrose central (Figura 4B) em comparação com os tumores maiores resultantes a partir de células ASPC-1 NT. Quantificação detectado um aumento de 5 vezes em áreas de necrose dentro dos tumores menores derivados MetKD-2 e 5-MetKD células em comparação com os tumores de controlo NT (Figura 4B). O aumento da necrose tumoral observado em MetKD ASPC-1 xenoenxertos poderia ser devido ao crescimento do tumor rápida, que excede a vasculatura do tumor, aumento da apoptose de células de tumor ou diminuição da angiogénese tumoral. Para distinguir entre estas possibilidades, coradas secções de tumor ASPC-1 MetKD e NT para Ki67 ou caspase-3 clivada para avaliar o nível da proliferação celular e apoptose, respectivamente. Análise morfométrica da coloração de Ki67 em tumores secções resultantes a partir de células MetKD revelou poucas células positivas por campo de Ki67 em comparação com tumores NT (Figura 4C). Examinar as secções de tumor de caspase-3 clivada coloração revelou números mais elevados de células positivas para a caspase-3 clivada em tumores MetKD relativos aos tumores NT (Figura 4D), indicando que a perda de Met sinalização poderá resultar numa maior susceptibilidade a apoptose. O aumento da apoptose e da necrose observada em tumores MetKD poderia ser atribuído a uma diminuição da angiogénese tumoral. Para testar isto, determinou-se a média da densidade de vasos (MVD) e no NT-MetKD tumores por coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o CD31, um marcador para as células endoteliais [28]. Consistente com os nossos dados, mostrando aumento da necrose em MetKD-2 e 5-MetKD tumores, MVD foi significativamente reduzida na periferia de tumores em comparação com xenoenxertos MetKD pancreáticas NT-derivados (Figura 4E). Nenhum sinal foi detectado dentro da massa central dos tecidos de xenotransplante, de acordo com relatórios sobre modelos humanos e do rato de câncer de pâncreas [34]. Assim, a perda de Met sinalização em células ASPC-1 reduz a carga tumoral num modelo ortotópico de rato, provavelmente como um resultado da diminuição da sobrevivência celular e angiogénese tumoral.

imunoprecipitação e análise de Western detectou forte Met fosforilada (PMET) em NT tumores em relação a baixos níveis de PMET em tumores MetKD (a). Cortes seriados de tumores embebidos em parafina foram ou H E manchado (B) ou processados ​​para Ki67 (C), ativa a caspase-3 (D) e cortes congelados para CD31 (E) coloração. A análise morfométrica indica um aumento significativo na necrose e caspase-3 clivada coloração com uma diminuição correspondente na Ki67 e CD31 coloração por alto campo motorizado (HPF) em tumores MetKD em relação aos tumores NT (** P 0,01, *** p 0,001 ; ANOVA). imagens de campo representativos são mostrados.

Met sinalização promove a secreção de Angiogênica Fatores

Met sinalização foi mostrado para promover a remodelação da vasculatura do tumor em tumores mamários e uterinos através da regulação positiva de VEGF e regulação para baixo de trombospondina-1 (TSP-1) [35]. O VEGF é um agonista potente de angiogénese que activa tanto a proliferação de células endoteliais e migração. Em oposição, TSP-1 suprime a angiogénese por inibição da proliferação de células endoteliais e induzindo a apoptose das células endoteliais.