Abstract
15-desoxi-delta-12,14-prostaglandina -J
2 (15d-PGJ
2), um metabolito araquidónico e um agonista de PPARy natural, é conhecido por induzir a apoptose em células tumorais. Neste estudo, foram investigados novos potenciais terapêuticos de 15d-PGJ
2 por determinação dos seus efeitos anti-cancerígenos no tipo selvagem e células de carcinoma do ovário de doxorrubicina-resistente. Apesar de alta expressão de genes indutores de resistência, como MDR1, Bcl2 e Bcl-XL, 15d-PGJ
2 induziram fortemente a apoptose em células A2780 (/AD) doxorrubicina células resistentes semelhantes ao do tipo selvagem (A2780). Isto verificou-se estar relacionada com vias de caspase-3 /7- e NF-kB, mas não à sua actividade agonista de PPARy. 15d-PGJ
2 também foi capaz de reduzir a resistência doxorrubicina de células A2780 /AD em doses baixas como confirmado pela inibição da expressão do gene de MDR1 (P-glicoproteína) e SIRT1 (um gene senescência de drogas). Nós também investigou os efeitos de 15d-PGJ
2 na migração celular e transformação usando um ensaio de cicatrização e análises morfológicas, respectivamente. Descobrimos que 15d-PGJ
2 inibiu a migração muito provavelmente devido a inibição do NF-kB e transformação induzida das células A2780 /AD rodada-forma em células epiteliais alongados devido a inibição da HDAC1. Usando um
2 analógico 15d-PGJ, encontramos o mecanismo de ação dessas novas actividades de 15d-PGJ
2 sobre SIRT1 e expressões de genes HDAC1 e atividades enzimáticas. Em conclusão, o presente estudo demonstra que 15d-PGJ
2 tem um alto potencial terapêutico para matar as células tumorais resistentes aos medicamentos e, os efeitos inibitórios recém-descritas deste produto ciclo-oxigenase na SIRT1 e HDAC irá proporcionar novas oportunidades para o câncer terapêutica
Citation:. de Jong e, Winkel P, Poelstra K, Prakash J (2011) Anticancer Efeitos da 15d-prostaglandina-J
2 em Wild-Type e células de doxorrubicina-resistentes do cancro do ovário: Novel acções sobre SIRT1 e HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10.1371 /journal.pone.0025192
editor: Olivier Gires, Universidade Ludwig-Maximilians, Alemanha |
Recebido: 26 Abril de 2011; Aceito: 29 de agosto de 2011; Publicado: 21 de Setembro 2011 |
Direitos de autor: © 2011 de Jong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo projecto da União Europeia de Innovative Acção Programa de Groningen, Holanda, e por uma concessão Vici da Fundação Técnico Holandês (STW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As prostaglandinas (PGs) são uma família de metabolitos endógenos biologicamente activos do ácido araquidónico. Eles controlar uma vasta variedade de funções fisiológicas tais como a regulação do tónus do músculo liso, a inflamação, o crescimento e diferenciação celular [1]. 15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2 (15d-PGJ
2) é um derivado de desidratação de PGD
2, que também é conhecido como um agonista natural do receptor nuclear peroxisoma gama activado por proliferador do receptor (PPAR). 15d-PGJ
2 foi relatado para exibir várias atividades farmacológicas (actividades anti-inflamatórias, anti-fibróticas e apoptóticos), quer através de vias PPAR-dependentes ou vias PPAR-independentes como fator nuclear kappaB (NF-kB) – , Keap-Nrf2-, STAT1, e as vias dependentes de p53 [2], [3]. Em nosso estudo recente, demonstraram que 15d-PGJ
2 foi capaz de inibir a progressão do tumor significativamente
in vivo
em camundongos portadores de tumor. A sua efectividade foi encontrado para ser controlado pelo seu forte mas reversível de ligação da albumina do soro e pela penetração posterior de albumina nos tumores que era dependente da vasculatura tumoral [4]. Também outros grupos reportaram a actividade anti-tumoral de 15d-PGJ
2 in vivo em diferentes modelos tumorais [5], [6]. Estes resultados sugerem que um uso potencial de 15d-PGJ
2 para fins terapêuticos como um agente anti-cancro pode ser visionado.
Demonstrámos que 15d-PGJ
2 induz a apoptose em células cancerosas através de diferentes -PPARy independente de NF-kB e de vias dependente de caspase-[4], como também demonstrado por outros estudos [7], [8]. Sabendo o envolvimento de NF-kB via na regulação da resistência a múltiplas drogas (MDR1) e genes anti-apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-xl) [9], que hoje teve como objetivo investigar se 15d-PGJ
2 é capaz de induzir apoptose em células de cancro resistente a doxorrubicina em comparação com a de tipo selvagem. Nós ainda determinar se os efeitos induzidos pela 15d-PGJ
2 foram mediados por vias PPAR-dependente e /ou NF-kB-dependente. Chu e colaboradores demonstraram que o tipo de informações em silêncio regulador 1 (SIRT1), uma classe III da histona-desacetilase (HDAC), é sobre-expressa em vários tumores quimiorresistentes de doentes com cancro e a inibição da expressão do gene SIRT1 leva a diminuição na expressão de MDR1 e aumento da sensibilidade à droga [10]. Por isso, comparou a expressão SIRT1 em células de cancro do ovário resistentes de tipo selvagem humano e doxorrubicina e examinou os efeitos de 15d-PGJ
2 nesta expressão do gene SIRT1. Durante essas experiências, percebemos que 15d-PGJ
2-tratados células doxorrubicina resistente transformadas a partir de células de forma arredondada a um tipo alongado. Nós investigamos ainda mais esta mudança fenotípica e descobriu que 15d-PGJ
2 induzida esses efeitos por inibição das enzimas de classe I de HDAC. Muitas atividades farmacológicas de 15d-PGJ
2, por exemplo, inibição de PPARy, NF-kB, p53 e vias Nrf-keap são induzidas por fazer um complexo estável com a cisteína livre nestas proteínas por intermédio de um dos átomos de carbono electrofílicos [11]. A fim de determinar se os efeitos inibitórios de 15d-PGJ
2 em SIRT1 e HDAC também foram relacionados com este último mecanismo, realizamos vários
in vitro
experiências utilizando um análogo de 15d-PGJ
2 . Nossos resultados mostram muitas novas actividades deste metabólito ácido araquidônico endógena em células cancerosas e iluminar o mecanismo de ação deste produto ciclo-oxigenase.
Métodos
experimentos com células
Wild -type (A2780) e doxorubicina-resistente (A2780 /AD) linhas celulares de carcinoma do ovário humano foram obtidos a partir de University Medical Centre Groningen, Países Baixos. A2780 e A2780 /AD linhas celulares (doxorrubicina-resistentes) foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Bélgica) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e antibióticos (penicilina, 50 unidades /ml mais de estreptomicina, 50 ng /ml) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO
2. células A2780 /AD foram cultivadas na presença de doxorrubicina (2 uM). Duas semanas antes das experiências de um frasco separado de células doxorrubicina resistente foi mantida sem doxorrubicina. Estas células foram usadas para experiências adicionais para evitar a influência de doxorrubicina nas nossas experiências. Desde 15d-PGJ
2 in vitro perde a sua actividade na presença de FCS, todas as experiências foram realizadas em meio livre de FCS.
estudos de viabilidade celular.
As células foram semeadas no placa de 96 poços como 1 x 10
4 células /poço em 200 ul de meio com 10% de FCS. Após 48 h, as células foram lavadas com meio isento de soro e, em seguida, incubadas com diferentes concentrações de 15d-PGJ
2 em meio isento de soro durante 48 h. No caso de tratamento com o antagonista irreversível PPARy GW9662 (2-cloro-5-nitrobenzanilide, Sigma), as células foram pré-incubadas com GW9662 (10? M) durante 3 h e, em seguida, incubadas com uma mistura de 15-D-PGJ
2 (produtos químicos Cayman, Ann Arbor, MI) e GW9662 por 48 h. A viabilidade das células foi determinada usando corante azul de Alamar (Serotec, Oxford, Reino Unido), que mede o número de células em função da actividade mitocondrial. Após 48 h de incubação, o meio contendo o corante azul de Alamar (diluído 1:10) foi adicionado às células e incubou-se durante mais 4 h. Em seguida, o corante metabolizado (fluorescente) foi detectada com um fluorímetro com excitação a 560 nm e emissão 590 nm.
Caspase 3/7 ensaios enzimáticos.
caspase-3 e -7 enzimas de actividade foi determinada utilizando Caspase 3/7 Glo kit de ensaio (Promega, Medison, WI). 1 × 10
4 células foram semeadas em placa de 96 poços em 200 ul de meio de cultura. Após 48 h, as células foram lavadas com meio isento de soro e incubadas com diferentes concentrações de 15d-PGJ
2 em 100 ul de meio, durante 5,5 h. Subsequentemente, a 100 ul de reagente de Caspase 3/7-reconstituída foi adicionado às células e incubado durante 30 minutos na incubadora. A luminescência foi determinada por um luminómetro (Lumicount, Packard, Meriden, CT).
coloração Anexina V.
Anexina V coloração foi realizada sobre as células para determinar a indução de apoptose após tratamento com 15d-PGJ2. 1 × 10
4 células foram semeadas numa placa de 8 poços (Lab-Tek, Nunc, Roskilde, Dinamarca) em 400 ul de meio de cultura. Após 72 h, as células foram lavadas com meio isento de soro e incubadas com diferentes concentrações de 15d-PGJ
2 em 200 ul de meio durante 6 h. Subsequentemente, as células foram incubadas com 100 jil de anexina V-FITC (Roche, Mannheim, Alemanha) durante 15 min à temperatura ambiente, lavadas e fixadas com paraformaldeído a 4%. Em seguida, as células foram montadas com DAPI contendo solução de montagem e de coloração foi examinado sob um microscópio fluorescente.
Estudo da expressão do gene.
1 × 10
5 células por cavidade foram semeadas em 12 -bem placa e foram cultivadas durante 48 h e em seguida incubadas com diferentes compostos durante 48 h. As células foram lisadas utilizando um tampão de lise e o ARN foi isolado utilizando o kit Absolutely microprep ARN (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de ARN foram quantificados por um espectrofotómetro de UV (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Então ADNc foi sintetizado a partir de quantidades iguais de RNA usando Superscript III kit de síntese da primeira cadeia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os iniciadores para a espécie humana foram obtidos a partir de Sigma-Genosys (Haverhill, Reino Unido). As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1. níveis de expressão do gene para genes diferentes foram medidos por quantitativo em tempo real de RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando SYBR Green como uma sonda fluorescente (Applied Biosystems). Finalmente, os números de ciclo limiar (Ct) foram utilizados para calcular a expressão do gene para cada alvo através da normalização para o gene GAPDH de manutenção da casa.
transfecção e ensaio de luciferase para a actividade de NF-kB.
a actividade de NF-kB foi determinada utilizando um ensaio baseado repórter de luciferase como descrito anteriormente [4]. Em breve, PNF-kB-Luc (Clontech, Mountain View, CA) contendo uma sequência de ligação específica para o NF-kB e um plasmídeo de luciferase vazio, pTAL-Luc (controlo) foram usadas para estudos de transfecção. 1 × 104 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços brancos e a transfecção dos plasmídeos foi realizada utilizando o reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche) após 24 h. As células foram tratadas com um complexo de 0,17? G de ADN /0,5 uL FuGENE 6 em 100 ul de meios de comunicação normal com FCS a 10% durante 24 h. Subsequentemente, as células foram lavadas com meio isento de soro e incubadas com PGJ-15d
2, BAY 11-7082 (Sigma), ciglitazona com ou sem TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 4 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e lisadas com tampão de lise de células 20 uL, e suplementado com 100 ul de substrato de luciferase (Promega). A actividade da luciferase foi medida por um luminómetro (Lumicount, Packard). Os valores unitários luminescência de pNF-kB-Luc foram neutralizadas subtraindo os valores pTAL-Luc.
ensaio de cicatrização de feridas.
1 × 10
5 células por cavidade foram semeadas em 12 -bem placa e foram cultivadas durante 48 h em meio de cultura. Em seguida, um zero (ferida) foi introduzido na camada de células confluentes utilizando uma ponta amarela colocada num andaime, permitindo que a normalização do zero. As células foram lavadas três vezes com meio para remover as células destacadas. As células foram então incubadas com diferentes compostos durante 48 h e imagens de um local de ferida definidos foram feitos com assistido por computador de microscópio de contraste de fase (Olympus) em t = 0, 24 e 48 h. A área da ferida nas imagens microscópicas foi medida usando o software Image J. (National Institutes of Health, MD) em diferentes pontos de tempo. A cicatrização de feridas percentagem depois de 24 h ou 48 h, foi calculado em relação à área total da ferida em t = 0 h do mesmo local da ferida.
SIRT1 e enzima HDAC1 ensaios de actividade.
SIRT1 HDAC1 e ensaios de inibição de enzima foram realizados para determinar o efeito de 15d-PGJ2 sobre as suas actividades utilizando os kits comerciais de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Os ensaios enzimáticos e SIRT1 HDAC1 foram realizados em microplacas de acordo com as instruções do fabricante. Em primeiro lugar, tampão de ensaio, enzima SIRT1 ou HDAC1 e solvente (DMF) ou concentrações diferentes de tratamentos (15d-PGJ2 ou CAY-10410 dissolvidos em DMF) foram misturados. CAY-10410 (9,10-di-hidro-15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2), um análogo de 15-D-PGJ
2, foi adquirido a partir de produtos químicos Cayman. Em seguida, o substrato composto por a sequência de p53 Arg-His-Lys-Lys (e-acetil) -AMC péptido e co-substrato NAD + para a actividade SIRT1 foi adicionado à mistura de enzima e incubou-se à temperatura ambiente durante 45 min. Para medir a actividade de HDAC1, um substrato de lisina acetilada foi adicionado à mistura de enzima e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, o batente /solução de revelação, que contém uma mistura de um (inibidor SIRT1) Desenvolvimento e nicotinamida ou Tricostatina A (inibidor HDAC1) foram adicionados a microplacas e incubados durante 30 min e 15 min, respectivamente, à temperatura ambiente. peptídeo desacetilada reage com o desenvolvedor e libera um fluoróforo. Os fluoróforos para ambos os ensaios foram analisados utilizando um comprimento de onda de excitação de 350 nm e um comprimento de onda de emissão de 450 nm. 100% de actividade da enzima foi calculada pela incubação com DMF por si só e a percentagem de inibição da actividade de HDAC1 ou SIRT1 foi calculada em relação às correspondentes concentrações de solventes.
Análises Estatísticas
Os dados são apresentados como média ± padrão da média de erro (SEM) salvo indicação em contrário. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t não pareado de Student bilateral com
p Art 0,05 como o nível mínimo de significância. dados de célula-viabilidade foram ajustados de acordo com a curva dose-resposta sigmoidal para calcular IC
50 utilizando GraphPad Prism 4 software (La Jolla, CA).
Resultados
15d-PGJ
2 induz a apoptose em ambas as células A2780 e A2780 /AD-PPARy independentemente
confirmou que as células /A2780 AD são altamente resistentes à doxorrubicina em comparação com células A2780 de tipo selvagem como o IC
50 de doxorrubicina em A2780 e A2780 /AD foram de 1,3 e 120? M, respectivamente (Fig. 1A). No entanto, o tratamento com PGJ-15d
2 causou a morte celular em células A2780 (IC
50 = 4,3 uM) e células A2780 /AD (IC
50 = 2,6 uM) após 48 h de incubação. 15d-PGJ
2 é um agonista de PPAR conhecido, mas verificou-se que a indução de morte celular em ambos os tipos celulares foi independente de PPARy como pré-tratamento com o irreversível PPARy antagonista GW9662 não inverteram os efeitos da 15d-PGJ
2 nem na de tipo selvagem (Fig. 1B), nem em linhas de células resistentes (Fig. 1C). Além disso, verificou-se que 15d-PGJ
2 induziu apoptose em ambas as células do tipo selvagem e doxorubicina-resistente através da activação da via da caspase como de caspase-3/7 actividades enzimáticas foram significativamente induzida por 15d-PGJ
2 em estas células após 5,5 h de incubação (Fig. 1D). Embora (células resistentes) A2780 /AD foram ligeiramente mais sensível a 15d-PGJ
2 no ensaio de viabilidade de células, não foi ligeiramente inferior a indução da actividade da caspase nestas células em comparação com as células A2780, indicando a participação de ensaios independentes-caspase. A indução de apoptose nestas células foi também confirmado com a coloração de anexina V, um marcador de apoptose precoce. Verificou-se que ambos os tipos de células tornaram-se positivas para a coloração de anexina V (cor verde) após o tratamento com 15-D-PGJ
2 e o número de células positivas foi aumentada em concentrações mais elevadas em ambas as linhas celulares (Fig. 1E).
(a) a doxorrubicina matou células A2780 completamente em 5 mm enquanto que as células /AD A2780 foram altamente resistentes à doxorrubicina. Em contraste, 15d-PGJ
2 induziu morte celular em ambos os tipo selvagem A2780 (B) e linhas de células resistentes à doxorrubicina-A2780 /AD (C) dependente da dose depois de 48 h. Estes efeitos não eram dependentes de PPARy como de pré-incubação com um antagonista de PPARy irreversível GW9662 (10 uM) não bloquear esses efeitos. Os dados são apresentados como% do controlo que foi calculado assumindo células não tratadas 100% viáveis, tal como determinado com o ensaio de azul de alamar. (D) 15d-PGJ
2 reforçada caspase actividade 3/7 enzimas (a t = 5,5 h) em ambos os tipos de células numa forma dependente da concentração. Os dados representam a média ± EPM da média de pelo menos 3 experiências em separado. Diferenças em comparação com os controles são mostrados como *
p Art 0,05, **
p Art 0,01. (E) fotomicrografias representativas que mostram a coloração de anexina V (cor verde), um indicador de indução de apoptose, em células A2780 e A2780 /AD linhas após o tratamento com 15d-PGJ
2 concentração-dependente. a coloração DAPI (cor azul) indica o número total de células. Ampliação, 200 ×. As caixas de mostrar as imagens em maior ampliação de 480 ×.
15d-PGJ
2 induz a apoptose inibindo NF-kB via
Uma vez que a apoptose induzida por 15d-PGJ
2 foi independente de PPAR, investigamos o envolvimento da via NF-kB, um importante regulador da sobrevivência e proliferação celular, em células A2780 e A2780 /AD usando o ensaio de repórter luciferase NF-kB. Nós induziu a actividade de NF-kB nestas células com TNF-α recombinante humano, que é um activador directo da via NF-kB. Nós descobrimos que o tratamento com TNF-α (100 ng /ml) aumentou significativamente a actividade de NF-kB em ambos os tipos de células, mas de forma mais pronunciada em células A2780 (13 vezes) em comparação com A2780 /AD (6,0 vezes) (Fig. 2A) . O tratamento com 15-D-PGJ
2 reduziu significativamente o basal e induzida por TNF-α actividade de NF-kB em ambos os tipos de células numa forma dependente da concentração (Fig 2B e 2C). No entanto, os efeitos inibidores foram mais fortes no A2780 /A2780 AD do que como pode ser notado em 2.5 e 5.0 uM concentrações. Estes dados indicam que os efeitos indutores de apoptose de 15d-PGJ
2 foram mediados através de NF-kB via. Além disso, o agonista de PPARy ciglitazona não inibiram a actividade de NF-kB basal numa concentração de 10 uM, mas apenas em concentrações mais elevadas. Em outras experiências com ciglitazona, portanto, utilizou-se concentrações que induzem apenas os efeitos específicos de PPARy (CE
50 = 3,0 uM) [12] e os efeitos não NF-kB-mediadas. Um inibidor específico de NF-kB-bem conhecido, ou seja, BAY-11-7082 inibiram a actividade de NF-kB em ambos os tipos de células de forma semelhante e este inibidor foi utilizado em experiências adicionais para determinar o efeito da inibição de NF-kB nestas células.
para medir a actividade de NF-kB, ambas as células A2780 e A2780 /AD foram transitoriamente transfectadas com um plasmídeo contendo o promotor de NF-kB com um elemento repórter de luciferase (pNF-kB-Luc) durante 24 h. Após 24 h, 15d-PGJ
2, ciglitazona ou BAY-11-7082 foram incubadas com e sem TNF-α durante 4 h e, em seguida, a actividade de luciferase foi medida utilizando um ensaio de luminescência para determinar a actividade de NF-kB. (A) O NF-kB via activador, o TNF-α (100 ng /ml), induziu a actividade de NF-kB em ambos os tipos celulares, embora o aumento era mais elevado em células A2780. O tratamento com 15-D-PGJ
2 inibiu significativamente a actividade de NF-kB tanto na A2780 (B) e células A2780 /AD (C) que foi mais pronunciado em células de TNF-α-activados. A ciglitazona inibida NF-kB apenas em concentrações mais elevadas ou em células A2780 /AD-TNF-ct activado. BAY-11-7082 inibiram a actividade de NF-kB em ambos os tipos de células com uma eficácia semelhante. Os dados representam a média de pelo menos 3 experiências em separado. As diferenças estatísticas em comparação com os respectivos controles são mostrados como *
p Art 0,05 e **
p
. 0,01
15d-PGJ
2 reduz a expressão de ARNm de Bcl-2, Bcl-XL, MDR1 e SIRT1
Depois de análises de expressão de genes, verificou-se que as células /A2780 AD tinha indução substancial de genes anti-apoptóticos tais como Bcl-2 (120- dobrar) e Bcl-XL (2 vezes) em comparação com células não-A2780 resistentes (Fig. 3a). O tratamento com concentrações baixas de 15d-PGJ2 (1,0 e 2,5 uM) durante 48 h reduziu os níveis de expressão de Bcl-2 e Bcl-XL em A2780 /AD mais fortemente do que em células A2780 (Fig. 3A), que também pode explicar a maior de morte celular em células A2780 potência /AD. Estes efeitos não eram devidas a actividade agonista de PPARy ou NF-kB efeitos inibidores de 15d-PGJ
2 como o bem conhecido ciglitazona agonista de PPARy e NF-kB inibidor só tinha efeito menor selectivo em relação ao 15d-PGJ
2 (Fig. 3A).
(a) As células A2780 /AD teve maior expressão do gene de Bcl-2 e Bcl-XL em comparação com as células A2780. Efeitos da 15d-PGJ
2, ciglitazona e BAY-11-7082 sobre a expressão gênica foram determinados após 48 h de incubação, em ambos os tipos de células. células /A2780 AD também teve maior expressão de MDR1 (B) e SIRT1 (C) em comparação com células A2780. a expressão do gene MDR1 não era detectável (ND) em células A2780. Efeitos de 15d-PGJ
2, e ciglitazona BAY-11-7082 na expressão MDR1 foi determinada apenas em células A2780 (B), enquanto que os efeitos sobre a expressão SIRT1 foram medidos em ambos os tipos de células (C). Os dados representam a média ± SEM de pelo menos 3 experiências. As diferenças estatísticas em comparação com os respectivos controles são mostrados como *
p Art 0,05 e **
p
. 0,01
Além disso, descobrimos que há era uma sobre-regulação da resistência a múltiplos fármacos (MDR1) e classe III-HDAC-2 sirtuina homólogo de expressão de ARNm de (SIRT1) em células A2780 /AD doxorrubicina resistente em comparação com células A2780 de tipo selvagem (Fig. 3B e 3C). Os níveis de MDR1 em células A2780 foram abaixo dos níveis de detecção. Curiosamente, o tratamento com PGJ-15d
2 inibiu significativamente a expressão MDR1 nas células resistentes e estes efeitos foram mais provavelmente atribuído aos seus efeitos inibidores do NF-kB como BAY-11-7082 também inibiu a expressão, ao passo que não tinha efeito ciglitazona (Fig. 3B). 15d-PGJ
2 também inibiu a expressão SIRT1 em ambos os tipos de células, mas estes efeitos inibitórios não foram vistos com BAY-11-7082 (Fig. 3C). Por outro lado, ciglitazona reduziu a expressão SIRT1 apenas em A2780 /AD onde os níveis de SIRT1 foram elevados.
15d-PGJ
2 inibe processo de cicatrização
Uma vez que as células resistentes à quimioterapia pode ter um comportamento de migração diferente do que sua versão de tipo selvagem, que, além disso, examinaram o efeito de indutores de resistência sobre esses parâmetros usando
in vitro
ferida ensaio de cura. O ensaio mede, tipicamente a migração de células pela medição de fecho de um padrão zero no tempo. Descobrimos que as células A2780 /AD tinha migração significativamente mais lento do que as células A2780 (Fig. 4A e 4B). 15d-PGJ
2 reduziu a migração de ambos os tipos de células numa forma dependente da dose (Fig. 4C). Embora 15d-PGJ
2 reduziu a viabilidade celular em células /AD A2780 em 2,5 mM de concentração (Fig. 1C), nós não ver a morte celular nestas experiências que podem ser devido à camada de células confluentes usado nestas experiências. Descobrimos que anteriormente na camada de células confluentes 15d-PGJ
2 não teve efeito sobre a viabilidade celular de A2780 /AD (dados não mostrados). A ausência de morte celular nestas experiências também é aparente nas imagens representadas (Fig. 4a). Os efeitos inibidores sobre a cicatrização da ferida também foram observados com BAY-11-7082, mas não com ciglitazona indicando os efeitos de 15d-PGJ2 pode ser devida aos seus efeitos inibidores do NF-kB.
Para determinar os efeitos de 15d- PGJ
2 sobre a migração de células, um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada em células A2780 e A2780 /AD, tal como descrito em materiais e métodos. (A) Imagens representativas que mostram a zero (ferida) em t = 0 horas e t = 48 h com /sem diferentes tratamentos. Uma marca (visualizado nestas imagens sobre o lado superior ou inferior) foi colocada para localizar a mesma área no zero, as imagens foram feitas usando um microscópio invertido ea área aberta foi calculado nos pontos de tempo indicados. Ampliação, 40 ×. (B) O gráfico mostra% cicatrização de feridas em células A2780 e A2780 /AD, sem tratamentos. células A2780 apresentaram maior taxa de migração em comparação com células /AD A2780. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências diferentes. **
p Art 0,01 versus A2780 /AD. (C) O tratamento com 15d-PGJ
2 e BAY-11-7082 inibiu a ferida resposta após 48 h incubações cura enquanto ciglitazona não mostraram efeitos inibitórios. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências diferentes. *
p Art 0,05 e **
p
. 0,01 versus valores em t = 0 h
Efeito da 15d-PGJ
2 na célula morfologia
Durante as incubações com 15d-PGJ
2, percebemos que as células foram transformadas em células alargada e alongadas. Essa mudança fenotípica foi mais proeminente visível nas células A2780 /AD dox-resistente. Estas células foram inicialmente arredondada e encolheu, mas depois da transformação que atingiram mais citoplasma com os limites celulares distintas e exibida uma aparência de estrutura epitelial-like (Fig. 5A). O tratamento com ciglitazona ou BAY-11-7082 induziu nenhuma alteração na morfologia celular indicando que não há papel de PPARy e vias de NF-kB. Desde que foi relatado na literatura que o inibidor de HDAC Tricostatina A pode transformar as células de carcinoma do ovário [13], que trataram células com tricostatina A e descobriram que as células foi transformada de uma forma semelhante como com 15dPGJ
2 (Fig. 5A ). Embora as células A2780 também parecia mais esticado com 15d-PGJ
2 e tricostatina A, diferenças em comparação com células de controlo não eram grandes (Fig. 5B).
(A) imagens representativas que mostram a mudança na morfologia celular de A2780 /AD após incubação com PGJ-15d
2 (2,5 mM) e tricostatina A (70 nM). Em contraste, outros tratamentos, como ciglitazona e BAY-11-7082 não afetou a morfologia. As setas apontam para fora das células transformadas que tinham mais citoplasma e as células epiteliais da estrutura. Ampliação, 200 × (B) imagens representativos de células A2780 após incubação com diferentes tratamentos. O tratamento com 15-D-PGJ
2 (2,5 mM) e tricostatina A (70 nM) conduziu a um aumento claro no citoplasma. Ampliação, 200 × (C) Rácio de caracol para E-caderina expressão genética em células A2780 e A2780 /AD. Os dados representam a média ± SEM para 3 experiências.
Uma vez que a transformação de células pode ser relacionada com epitelial-mesenquimal processo de transição (EMT), foi examinada a expressão de Snail e e-caderina transcritos e descobriram que a proporção de caracol de E-caderina foi aumentada em ambos os tipos de células depois da exposição de 2,5 uM 15d-PGJ
2 embora as diferenças não foram estatisticamente significativas. Estes dados indicam que a mudança na morfologia celular induzida por 15d-PGJ
2 pode ser devido à indução do processo de TEM.
15d-PGJ
2 inibe a expressão de HDAC 1, 2 e 3 ARNm
Uma vez que os efeitos de transformação de células de 15d-PGJ
2 também foram induzidos pelo inibidor HDAC, examinámos o efeito de 15d-PGJ
2 em HDAC em ambos os tipos de células. Em primeiro lugar, foram comparados os níveis de mRNA de HDAC1, 2 e 3 em células A2780 e A2780 /AD e descobriram que HDAC2 foi significativamente regulada negativamente nas células resistentes comparativamente com as células de tipo selvagem (Fig. 6A). O tratamento com 15-D-PGJ
2 inibiu a HDAC1, 2 e 3 expressões de ARNm em ambos os tipos de células, dependente da dose (Fig. 6B e 6C). Os efeitos foram mais pronunciados em células resistentes. Essas inibições não foram encontrados com ciglitazona e BAY-11-7082, mas houve um aumento na expressão HDAC1 após a inibição de NF-kB com BAY-117082.
(A) em tempo real de dados qPCR mostrar as diferenças entre os níveis de expressão do gene basais de HDAC 1, 2 e 3 em células A2780 e A2780 /AD. **
p Art 0,05 contra células A2780. Efeito de diferentes tratamentos sobre os genes de HDAC foram determinados em células A2780 (B) e células A2780 /AD (C) após 48 h de incubação. Os dados representam a média ± SEM de 3 experiências separadas. As diferenças estatísticas em comparação com os respectivos controles são mostrados como *
p Art 0,05 e **
p
. 0,01
15d-PGJ
2 inibe atividades SIRT1 e HDAC enzimas devido a seus átomos de carbono eletrofílicos
Uma vez que descobrimos que 15d-PGJ
2 pode inibir a expressão gênica de SIRT1 e outros HDACs, nos perguntamos se 15d-PGJ
2 foi capaz de inibir estas actividades enzimáticas directamente. Utilizou-se um substrato baseado em sequência da p53 (-His-Lys-Lys Arg (e-acetil) -AMC) ensaio para determinar a actividade SIRT1 e para HDAC1 utilizou-se um ensaio à base de substrato de lisina acetilada. A fim de descobrir se o átomo de carbono C9 electrofílico é responsável pela actividade, que incluiu a 15d-PGJ
2 analógico CAY-10410 que carece a electrofilicidade em C9 (Fig. 7A). Descobrimos que 15d-PGJ
2 inibiu a actividade SIRT1 dependentemente da dose com uma inibição de até 71%, enquanto que CAY-10410 única mostrou apenas inibição moderada de 23%, enquanto ciglitazona não mostrou inibição a todos (Fig. 7B). No ensaio de enzima HDAC1, 15d-PGJ
2 conduziu a uma inibição de 40%, mas CAY-10410 e ciglitazona não mostrou qualquer inibição (Fig. 7C).
(A) As estruturas químicas de 15d-PGJ
2 (15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2) e o seu análogo CAY-10410 (9,10-di-hidro-15-desoxi-Δ
12,14-prostaglandina J
2). O asterisco indica os átomos de carbono electrofílicos que possam estar envolvidos na reacção de adição de Michael. Painel (A) e (B) mostra os efeitos dependentes da concentração de 15d-PGJ
2, CAY-10410 e ciglitazona sobre a actividade de desacetilase de SIRT1 e HDAC1, respectivamente, utilizando
In vitro
ensaios enzimáticos.
# P 0,01 versus ciglitazona,
† p 0,05 e
†† p 0,01 versus CAY-10410. (D) Efeito da CAY-10410 sobre a viabilidade celular das células A2780 e A2780 /AD, conforme medido com um ensaio azul alamar. (E) O tratamento com CAY-10410 (2,5? M) não induziu transformação das células após 48 h de incubação. Ampliação, 200 ×.
Nós ainda determinar se os efeitos de 15d-PGJ
2 foram apresentados devido ao átomo electrofílico C9, testamos os efeitos da CAY-10410, faltando eletrofílicas em C9 átomo de carbono, na viabilidade celular e transformação. Descobrimos que CAY-10410 fez nem induziu a morte celular, nem a transformação das células (Fig. 7d e 7e).
Discussão
No presente estudo, demonstramos os efeitos de 15d -PGJ
2, um produto de actividade de ciclo-oxigenase e como um agonista de PPARy endógeno, sobre a apoptose, resistência a drogas, a migração celular e a transformação das células cancerosas. Foram examinados os seus efeitos sobre o tipo selvagem, bem como células de cancro do ovário resistentes à doxorrubicina.