Sumário

IL-2 é o factor de crescimento primário para promover a sobrevivência e proliferação das células T activadas que ocorre após o engate do quinases Janus (JAK) 1-3 /e transdutor de sinal e activador da transcrição ( STAT) 5 via de sinalização. STAT5 tem duas isoformas: STAT5A e STAT5b (comumente referido como STAT5) que, em células T, desempenham papéis redundantes transcrever genes do ciclo celular e sobrevivência. Como tal, a inibição de STAT5 por uma variedade de mecanismos pode rapidamente induzir a apoptose em certas células tumorais linfoides, sugerindo que ele e os seus genes alvo representar alvos terapêuticos para controlar certas doenças linfóides. Para procurar moléculas que estes alinhados de IL-2 genes regulados detectados pela Affymetrix micromatrizes de expressão génica com o cistrome STAT5 identificado por análise de chip-on-chip, em uma linha de células de leucemia humana de IL-2-dependente, KIT225. Selecione genes sobrepostos foram então validado utilizando qRT

2PCR matrizes de médio rendimento em PBMC activados por PHA humanos. Dos 19 genes putativos, um regulador chave da sinalização do receptor de células T, PDE4B, foi identificado como um novo alvo, que foi prontamente sobre-regulada ao nível da proteína (3 h) nos níveis de IL-2, estimulada PBMC humanas activadas. Surpreendentemente, apenas a CD8 + purificada células T primárias expressa PDE4B, mas não as células CD4 +. Além disso, PDE4B verificou-se ser altamente expressa em células T CD4 + células cancerosas linfóides, o que sugere que esta pode representar um papel fisiológico singular para a CD8 + e células cancerosas linfóides e, portanto, podem representar um alvo para intervenção farmacêutica para certas doenças linfóides.

Citation: Nagy ZS, Ross JA, Rodriguez G, Balint BL, Szeles L, Nagy L, et al. (2013) Genome Mapping Ampla revela PDE4B como um Induced STAT5 Gene IL-2 Target em PBMC humanas activadas e células cancerosas linfóide. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10.1371 /journal.pone.0057326

editor: Ramin Homayouni, Universidade de Memphis, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nagy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) número de concessão AI053566 para RAK e uma subvenção de projecto-piloto para ZSN (programa SCORE NIGMS, conceder S06 GM008012-37), e tornado possível pelo Grant número 5G12RR008124 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, um componente do NIH. ZSN é o destinatário da János Bolyai Research Felowship da Academia de Ciências da Hungria e é suportado pela NKTH-OTKA-UE 7KP (Acções Marie Curie) Reintegração Grant (OTKA MB08C 84.630). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O transdutor de sinal de mamíferos e ativador de transcrição (STAT) a família é composto por 7 membros (1-4, 5a, 5b e 6). moléculas STAT exercem papéis críticos na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência (revisto em [1]). Originalmente, acreditava-se que Stats para ser fatores latentes que residem no citoplasma e só ativado quando citocinas ligam ao seu receptor cognato após a activação de tirosina-quinases Janus (JAK). De facto, o modelo central sugere que JAK fosforilar resíduos de tirosina no receptor de servir como locais de ancoragem para as moléculas de sinalização contendo domínio SH2 tais como STATS. Na sequência de ancoragem através de interações fosfotirosina-SH2, estatísticas tornam-se tirosina fosforilada por JAK, desengatar a partir dos dímeros de receptores e de formulário via interações recíprocas domínio fosfotirosina-SH2. O dímero STAT é depois translocado para o núcleo para iniciar a transcrição do gene [2] – [3]. No entanto nós sabemos agora que STATS pode dimerizar e formar tetrâmeros na ausência de fosforilação da tirosina e ser nuclear localizada para controlar a regulação do gene em muitos aspectos exclusivos que são menos compreendidas [4] – [5].

O que está claro é que STAT 1, 3, 5A e 5B são amplamente utilizados por várias citocinas e são importantes para a regulação do crescimento celular, proliferação e morte, enquanto Estatísticas 2, 4 e 6 promover a defesa virai e Th1 contra Th2 diferenciação, respectivamente. Além disso, STAT3 e STAT5 foram encontrados estar estreitamente relacionado e relevante para a tumorigénese (revisto em [1]). Com efeito, as formas fosforiladas de tirosina constitutivamente STAT5 são facilmente observada numa variedade de células cancerosas e tecidos de origens diferentes, como um resultado da translocação cromossómica, tirosina-quinases desreguladas e transformação viral (revisto em [1]).

A papel fisiológico da STAT5A e B é em grande parte derivado do

in vivo

estudos de STAT5A e B knockout animais. A partir desses estudos parece claro que STAT5A é principalmente envolvidos no desenvolvimento da glândula mamária [6] e STAT5b é responsável por regular o crescimento através de hormona de crescimento sinalização [7]. Em linfócitos T, no entanto, que têm funções de compensação: estudos de STAT5A /B duplo ratinhos deficientes revelou que eles têm um papel na mediação redundantes progressão do ciclo celular de células T activadas [8], [9]. Além disso, estudos que empregam ratinhos nulos STAT5A /B indicam que estas moléculas são importantes para o desenvolvimento de órgãos linfóides como uma deficiência nestas proteínas pode resultar no fenótipo da imunodeficiência combinada grave [10]. Além disso, STAT5 parece actuar como um factor de sobrevivência essencial para as células T, uma vez que constitutivamente activo (ou seja, tirosina fosforilada) STAT5 é muitas vezes presente em linfóides e células cancerosas de leucemia entre outros tipos de tumores, em comparação com células normais, não transformadas (revisto em 1]). Além disso, o bloqueio expressão STAT5 em células mononucleares de sangue periférico humano, bem como células de cancro e leucemia linfóide severamente a viabilidade celular de compromisso e induzir a morte celular por apoptose [11]. Dados de muitos grupos sugere que a STAT3 desempenha um papel semelhante ao oncogénica STAT5 e dependente do tipo de célula, um pode ser mais dominante [12]. Novas descobertas para esta família de proteínas também sugerem que a sobrevivência das células quando promover características não-fosforilada pode desempenhar um papel regulador do gene assim [4]. Estes dados ajudar a fornecer novos modelos interessantes que sugerem que desacoplamento farmacológica de activado, bem como STAT5 activado por un pode ser necessário para perturbar os seus genes-alvo para induzir a morte de células de cancro. Assim, a identificação e a sobrevivência das células de tumor relevante genes alvo STAT5 é um objectivo importante para o desenvolvimento de terapias anti-cancerosas novos.

Um método que tem sido bem sucedida na identificação de novos genes alvo é cromatina imunoprecipitação que pode revelar a transcrição directa interacções de DNA factor- [13] e permite a identificação de locais de ligação do factor de transcrição desconhecido em novos genes alvo através da geração de uma biblioteca do genoma que pode ser (i) sequenciados e localizada no genoma humano, ou (ii) hibridado com micromatrizes representando regiões não codificantes do genoma. mapeamento do genoma dos genes-alvo STAT5 citocinas induzida foram realizados e publicados em vários tipos de células (T-, pré-B-, NK-como células cancerosas da mama tumor e humanos), utilizando tecnologias de chip-clone ou chip-Seq [4] [14] – [18]. Em particular, o mapeamento de eventos e mudanças de transcrição em células T primárias usando o chip-Seq, microarrays de expressão genética, ou tecnologia de RNA-Seq ligação IL-2 inducible STAT5 foram realizados e publicados tanto para rato [5], [16], [19 ], [20] e humanos [16], [] 19 modelos. Estes estudos importantes focado principalmente sobre o papel do STAT5 na diferenciação de células T helper e respostas imunes fisiológicas.

O presente trabalho buscou identificar a sobrevivência das células tumorais chave e genes alvo STAT5 relevantes em IL 2-células de leucemia humana dependentes usando expressão gênica e estudos promotor de microarray. Cujos resultados foram alinhados e uma piscina de seleção de alvos candidatos foram então validada em PBMC activadas humanos normais. Fosfodiesterase (PDE) 4B, um regulador de sinalização de AMP cíclico em células T foi demonstrado ser regulada de IL-2 em PBMC humanos e células T activadas CD8 + purificadas. Curiosamente esta molécula foi fortemente sobre-expressos no tumor linfóide mas não preparado células CD4 + T primárias.

Resultados e Discussão

Uma Abordagem Genome-wide identificar STAT5 específicos genes IL-2-mediadas

STAT5 é um regulador potente da sobrevivência das células T como os seus resultados de depleção em morte celular massiva de T activadas e células linfóides tumorais [11] – [12]. Até o momento, estudos genômicos têm sido utilizados para identificar e localizar IL-2 regulamentados eventos de ligação STAT5 e genes alvo em camundongos normais [5], [16], [19], [20] células T humanas e [16], [19] revisto em [21]. No entanto, no presente estudo buscou-se identificar IL-2 genes alvos STAT5 mediada todo o genoma de células tumorais linfóides (Figura S1). Para mapear sistematicamente sítios de ligação STAT5 na escala genômica que nós definimos como a cistrome STAT5 [22] e IL-2 mudanças de expressão de genes mediadas nós empregadas microarrays. Para estes estudos determinou-se primeiro o cistrome STAT5 usando o chip-on-chip, em células IL-2 KIT225 dependente que foram deixadas não-estimulada ou estimulada com IL-2 durante 30 minutos, seguido de análise da expressão do gene subsequente para detectar IL-2 mediada ARNm muda a 3 horas. Os conjuntos de dados resultantes foram então analisados ​​estatisticamente e alinhado e um conjunto seleto de genes que abrigava sites dentro de suas regiões promotoras de ligação STAT5 foram validados utilizando o rendimento médio qRT

matrizes 2PCR.

Gerar uma biblioteca de IL-2 regulamentados STAT5 Sítios de Ligação

em primeiro lugar, três réplicas biológicas de ChIP foram realizadas utilizando uma mistura de anticorpos dirigidos contra o terminal C de STAT5A e STAT5b em células KIT225 estimuladas com IL-2 durante 30 min. O ensaio foi validado pela medição da IL-2 induzida por enriquecimento do intensificador IL2RA [23] elemento chamado positiva Reguladora Região (PRR) III (Figura 1A) através de anticorpos STAT5 em comparação com o soro de controlo. Em seguida, o ADN foi amplificado capturados como descrito nos Materiais e Métodos que utilizam um protocolo de amplificação aleatória. Para confirmar que as bibliotecas manteve-se enriquecida para o controlo positivo PRR elemento III pós-amplificação, PRR III foi medida utilizando qPCR (Figura 1B) a partir de todas as experiências em replicado. Em seguida, a análise de microarray utilizando matrizes Affymetrix GeneChip 1.0R promotor humano foi realizada utilizando ADN genómico de entrada (como controlo) e a IL-2 estimulada em amostras de três réplicas biológicas como descrito acima. O resultado do “arquivos .cel” foram analisadas através MAT (Análise baseada em modelo de matriz Tiling, [24]) que rendeu “arquivos .bed” com as coordenadas cromossômicas de todas Chip-regiões, incluindo os valores de p, contagens MAT (para permitir o enriquecimento em diferentes regiões de diferentes comprimentos para ser comparado diretamente), FDR (taxa de detecção falsa) cálculos e bandeiras de repetição. elementos de duplicação repetitivas e segmentar foram removidos e os restantes 1581 visitas foram mapeados com CEAS (Cis-regulação Elemento de anotação System) [25] dentro de 300 kb de regiões genômicas anotados. Como mostrado na Figura 2A apenas cerca de 17% dos genes candidatos encontram-se dentro promotores vizinhas, enquanto que cerca de 25% e 42% estão localizados em potenciadores e intrões, respectivamente. Estes resultados estão em boa concordância com os dados dos outros, indicando que a maior parte dos sítios de ligação de TF são encontradas em regiões intrónicas e intergénicas [26]. Para comparar nossos resultados com os conjuntos de dados Chip-Seq publicados anteriormente, sítios de ligação STAT5A e STAT5b derivada de células T humanas primárias CD4 + foram re-analisados ​​(GSE27158 [16], usando um gasoduto análise ChIP-Seq por Barta et al, [27 ]) e os picos resultantes submetidos a análise SECA. Os resultados resultantes para STAT5A e distribuição locais STAT5b foram como se segue: 21% e 19%, intrónica 34% e 35%, limite-potenciador de 38% e 39%, respectivamente, indicando que o padrão de ligação da STAT5 genómico a partir de a corrente ligada ao promotor chip de-on-chip conjuntos de dados coincidem com os resultados chip-Seq por Liao e seus colegas [16]. Curiosamente apenas cerca de 20% dos sítios de ligação STAT5 foram confinados aos promotores. Em seguida, o enriquecimento de ligação TF motivos foram também analisados ​​com base no valor mudança vezes CEAS atribuído o que representa motivos significativamente enriquecida com 2 fold-mudança dentro das regiões em fichas sobre todo o genoma. Figura 2B tabela superior e painel mostra que os motivos TF com as maiores variações de dobra incluem os motivos de ligação STAT clássica TTCNNNGAA sob diversas formas. O elemento de resposta sensível Interferão (ISRE) também foi significativamente enriquecida que sugere que, em certas células STAT5 também podem ligar-se, possivelmente, a estes motivos: quer directamente ou com a ajuda de um outro TF que se liga a ISRE. Figura 2B menor mesa e painel representam a locais de ligação de TF mais significativamente enriquecida. Curiosamente estes são STAT TTC meias-sites. Talvez nestes tipos de células podem ligar-se STAT5 meios locais, directa ou indirectamente, sugerindo uma regulação anormal como este tipo de ligação de DNA não foi observada

In vitro

[28].

(A ) KIT225 IL-2 dependente de células de leucemia humana foram tornadas quiescentes e em seguida estimuladas com forma (-) ou IL-2 (+) durante 30 min a 37 ° C, fixadas com formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, cromatina imunoprecipitados com anticorpos para mistura STAT5A /B C-terminal ou IgG de controlo. O ADN eluído foi amplificado com os iniciadores correspondentes à humano IL2RA PRR III. Os dados representativos de três experiências independentes são apresentados. material de entrada representa 5% da cromatina imunoprecipitada. controle Beads representa amostras em que imunoprecipitação foi realizada sem quaisquer anticorpos mas por outro lado foi tratado de forma idêntica. (B) As células foram tratadas tal como descrito acima e, em seguida, para as experiências de microarranjos de DNA do ChIP-ed foi amplificado aleatoriamente na sequência de ligação de ligantes como os descritos na secção de Materiais e Métodos de três experiências independentes. O DNA amplificado foi então utilizado como modelo em reações de qPCR para medir o enriquecimento do IL2RA PRR III.

(A) de distribuição Genome-wide de STAT5 sítios de ligação (por cento do número total de locais). O chip-on-chip identificados elementos que caiu dentro de 300 kb de regiões codificantes foram analisados ​​com base na sua distância de genes mais próxima, utilizando SECA. O gráfico de pizza representa a distribuição “%”. (B) Enriquecido fator de transcrição motivos com maior fold-change (painel superior) e maior significância (painel inferior) vinculativo. Enriquecido sites e suas matrizes dentro do chip-on-chip identificado, CEAS analisados ​​elementos reguladores de ligação TF são mostrados.

Identificar IL-2 genes regulados em células KIT225 Utilizando Análise de Expressão Gênica

a fim de identificar os genes de IL-2 mediada por células KIT225, células esgotadas de IL-2 foram tratadas com a IL-2 ou de controlo de veículo, durante 3 horas e sujeita a análise da expressão do gene de microarray em duas réplicas biológicas. A partir desta análise, os genes alterados 469 maior do que duas vezes, com 129 jusante e 340 genes sobre-regulada, incluindo vários IL-2 alvos mediadas, tais como CISH, SOCS1, OSM, PIM-1, BCL6 e BCL2. Esta lista gene foi analisada com o software baseado na web Ingenuity Pathway Analysis, que confirmou ainda STAT5A e status de ativação STAT5b após o tratamento IL-2 (Figura S2) e identificadas redes celulares relevantes para a função imunológica, incluindo o desenvolvimento celular Ciclo Celular, hematológica Sistema Development Função, Sistema Reprodutor Development Função, bem como Cellular Movimento, Crescimento Proliferação significativamente sobre-representados (figura S3).

Identificação de IL-2 genes regulados do STAT5 Cistrome

O nosso objectivo era descobrir um grupo de IL-2 genes responsivos que contêm sítios regulatórios STAT5. Por isso, criou cruzam-se das cistrome STAT5 e as IL-2 genes que respondem usando o Navegador Tabela UCSC. Primeiro, a Affymetrix IDs da piscina expressão gênica foram convertidos para locais genómicos (arquivos .bed) que foram, em seguida, alinhados com os resultados de chip-on-chip. Estas piscinas foram visualizados na escala genômica usando os “arquivos .bed” eo Integrative Genomics Viewer (IGV, Figura 3). A partir da piscina cruzam composta de 106 genes, uma lista de 57 genes que continham os locais STAT5 regulatórias dentro de seu promotor proximal (30 genes), segmentos a jusante imediatos do gene (7 genes), potenciador (14 genes) ou o primeiro exão (6 genes) foram escolhidos para validação em PBMC com primário humanos (Figura 3 e Tabela S1) no nível de mRNA utilizando o rendimento médio qRT

2PCR matrizes de expressão gênica (descrito em Materiais e Métodos e resultados estatisticamente significativos (p-valor. 0,05) mostrada na Tabela 1). As IL-2 conhecidos genes alvo (indicadas por asteriscos na Tabela 1) a BCL2, BCL6, CDK6 e IL2RA foram identificados como IL-2 genes indutíveis com locais de ligação de STAT5. Outros IL-2 genes alvo conhecidos, tais como CISH, IFNG FOXP3 e também foram identificados por GEA e, por conseguinte, foram incluídas como controlos positivos sobre as matrizes. Embora se conheçam esses genes a ser regulado por STAT5, em células KIT225 seus locais de ligação STAT5 não foram identificados pela análise de chip-on-chip, para o qual não se pode descartar um efeito específico tipo de célula. Para esclarecer esses achados, IGV foi usado para visualizar os locais genômicos de conhecidos (SOCS2, SOCS3, IL2RA, CISH, BCL2, BCL6 e CDK6 (Figura 4A) sublinhadas são aquelas identificadas em nossa tela) e 18-2 IL-alvo desconhecido /STAT5 genes (Figura 4B). Entre estes, por exemplo, CD69 (até 2,3 vezes) foi mostrado para influenciar a diferenciação de células Th17, que é um processo dependente de STAT5 conhecido [29]. CDKN2C, também chamado como p18 (TINTA) 4c, é um conhecido inibidor da iniciação do ciclo celular G1, que aqui é sub-regulada cerca de 2 vezes por IL-2. Linfócitos citosólico de proteínas (LCP) 2 (1,7-dobrar-se) é um alvo para Zap70-quinase em linfócitos T e a sua deficiência é conhecida por induzir uma ausência de duplo positivo CD4 + CD8 + timócitos e de células T periféricas [30]. RAFTLIN (proteína-ligando jangada) também foi mostrado para influenciar as respostas imunitárias mediadas por células T e Th17 diferenciação [31]. STK17B é uma cinase de serina, também conhecido como DRAK (DAP cinase indutora de apoptose relacionada com quinase) 2, que é conhecido por mediar a apoptose induzida por IL-2 e regular a sensibilidade do receptor de células T em timócitos em desenvolvimento [32] – [33]. Fosfodiesterase (PDE) 4 B é um tipo 4 PDE (até ~ 2 vezes) que regula a sinalização de TCR por têmpera o efeito negativo de cAMP [34] e em células T humanas CD4 + a diminuição da expressão de PDE4B conduz a uma redução da IL-2 após a anti -CD3 /CD28 co-estimulação [35]. O local de ligação de chip-on-chip identificado STAT5 dentro da PDE4B é mostrado na Figura 4B, visualizado pela IGV. Curiosamente, a IL-2 aumentou o nível de PDE4B, que contém vários locais de ligação STAT5 intrónica, com base em estudos de células T murinas [5].

visualização dos resultados obtidos a partir da identificação do genoma de IL-2 genes induzidos e sítios de ligação STAT5 (como descrito na Fig. 1) com a IGV.

(a) Mostrado são conhecidos genes alvo STAT5 incluindo SOCS2, SOCS3, CISH e aqueles também identificou pelo chip-on -chip (IL2RA, BCL2, BCL6 e CDK6) e (B) 18 promotoras localizado genes recém-identificados visualizadas pela IGV usando hg19.

STAT5 ocupa um putativo IL-2 site GAS Responsive dentro do gene PDE4B

in vivo

em PBMC humano

para confirmar que STAT5 é capaz de ligar um local putativo gás dentro do gene PDE4B (localizado no cromossomo 1, as posições hg18 66.567.898-66.573.077) em uma forma indutível IL-2, foram realizadas experiências de chip em PBMC humanas quiescentes deixada sem tratamento (-) ou tratados com IL-2 durante 30 min (+) isolado a partir de três dadores independentes. Como resultado observou-se que STAT5 PDE4B ligado num IL-2 forma dependente e significativa (p 0,05) com um aumento de aproximadamente 1,7 vezes, em comparação com as células não tratadas (Figura 5A). O IL2RA PRR III foi utilizada como um controlo positivo (Figura 5B). Curiosamente, o gene PDE4B continha tanto STAT5A e IL-2 sítios de ligação de resposta STAT5b investigada dentro de células T humanas primário [16] que se sobrepunham com a nossa região de chip-on-chip. Além disso, a actividade de ligação a ADN STAT5 aumentada após tratamento de IL-2 bem correlacionada com o aumento de 2 vezes observados nos níveis de ARNm (Tabela 1).

ChIP ensaios realizados com anticorpos STAT5 ou soros de controlo (IgG) foram realizadas em repouso (-) ou hPBMCs estimuladas de IL-2 (30 min, +) isolados a partir de três dadores independentes para medir o enriquecimento da região de PDE4B putativo STAT5 regulada (a) ou o intensificador IL2RA PRR III (B) identificado por picador on-chip. Entradas representam 1% da cromatina utilizados em ensaios chip e barras de erro representam os desvios padrão. * Representa diferenças estatisticamente significativas (p 0,05)

Short Term IL-2 Tratamento (3 h) induz PDE4B Protein Expression em PBMC humanos PHA-activados e CD8 +, mas não células CD4 +

Para validar ainda que PDE4B é regulada por IL-2, foram também examinados mudanças do nível de proteína no ingénuos (N), activados por PHA (a), quiescente (Q) e IL-2 estimularam PBMC humanos em 3 h (+) em dois dadores independentes (Figura 6A). O nível de proteína de PDE4B aumento de aproximadamente 2 vezes (Figura S4, análise de densitometria), que se correlaciona com o aumento ~1.7-vezes na actividade de ligação a ADN de STAT5 e aumento de 2 vezes nos níveis de ARNm (Figura 5A e Tabela 1, respectivamente) . humanos primários CD4 + ou células T CD8 + foram também testados (Figura 6B). YT células NK-serviu como controlo positivo e ß-actina como um controlo de carga. Ambos PHA-activação (72 horas) e curta duração de tratamento de IL-2 induzida a expressão da proteína de PDE4B em PBMCs e CD8 +, CD4 +, mas as células T não. Com base nestes dados, é interessante especular que PDE4B pode ser o primeiro “linha de defesa” em PBMC e as células T CD8 + contra a sinalização de cAMP elevado que ocorre com a estimulação da célula T [36]. Sabe-se que um outro tipo de isoforma 4, PDE4D também é expresso em células T CD4 + células [35], o que nos conduz a especular um possível modelo onde existe têmpera constante de vias induzidas cAMP em comparação com as células CD8 +. Uma outra possibilidade pode ser que o atraso de até-regulação da PDE4B em células CD4 + é para regular negativamente de cAMP nestas células num ponto distai do tempo. Testes de CD4 + vs células CD8 + foi realizada a partir de um único doador e acreditamos que oferece novas oportunidades para investigar o possível papel da PDE4B nestes tipos de subconjuntos de células T.

PBMCs humanas normais de três doadores independentes (mostradas são 2 resultados representativos) foram deixados un-ativado (N, naïve) ou foram activadas com PHA (a, Q, +), em seguida, feita de repouso após 72 horas de ativação PHA pelo CO

2 descascar como descrito na secção Materiais e Métodos (Q ), depois estimuladas com IL-2 durante 3 horas (+). As células foram recolhidas e em seguida Ocidental colocados a hibridar com anticorpos para PDE4B ou ß-actina, como indicado à direita. Marcadores de peso molecular estão apresentados à esquerda. No painel inferior imediatamente após o isolamento de PBMC de células CD4 + (pistas fi) ou CD8 + (pistas ser) as células foram seleccionadas negativamente tal como descrito na secção Materiais e Métodos utilizando esferas magnéticas, e, em seguida, activados com PHA, tornadas quiescentes, estimuladas com IL-2 e de Ocidental riscados para PDE4B e ß-actina, tal como descrito acima. células YT serviram como controlos positivos para a expressão PDE4B. (C) PDE4B é expresso em linhas celulares tumorais linfoides de CD4 +. KIT225, linhas de células linfóides H9, Molt3, MT2, Hut102 CD4 + e YT-NK como foram lisadas e quantidades iguais de proteína Ocidental riscados para PDE4B e ß-actina, tal como descrito para a Figura 6A. Os dados representativos de duas experiências independentes é apresentado.

PDE4B é expressa em células CD4 + linfóides Lines tumor de células

Desde PDE4B foi encontrado anormalmente expressa em amostras difuso de grandes linfoma de células B [35] surgiu a questão que poderia ser o estado de expressão PDE4B em vários CD4 + e outras linhas celulares de cancro linfóides. Portanto, um conjunto de linhas celulares de tumores linfoides de CD4 + humanas e uma linha de células NK, como, YT, foram examinados por transferência Western mostrou que a proteína altamente expresso PDE4B presente nessas células (Figura 6c). via de sinalização STAT5 é relevante para várias destas linhas de células: MT2 humano e Hut102 e exibir via STAT5 hiperactivo [37], enquanto YT e as células KIT225 sofrem apoptose quando STAT5 é empobrecido [11], [38]. Curiosamente, PDE4B foi encontrado sobre-expresso na fracção de difuso de grandes amostras de linfoma de células B que eram refractários à quimioterapia [39]. Seria, portanto, interessante para investigar o destino da célula se PDE4B poderia ser eficazmente esgotar e se a morte pode resultar.

Tomados em conjunto, é plausível a postular que a superexpressão da PDE4B pode ser o resultado de ligação de ADN genómico STAT5 anormal que poderia subsequentemente contribuir para o fenótipo tumorigénico de estas linhas celulares. Teste desta hipótese requer uma investigação mais aprofundada.

Conclusões

Em conclusão, utilizando uma abordagem sistemática que combinava a determinação da análise cistrome STAT5 e expressão gênica induzida por IL-2 dentro de um modelo de células de leucemia humana ; e com a ontologia gene de acompanhamento, bem como a validação expressão rendimento transcrição meio em PBMC humanos primários, identificamos 19 genes alvo STAT5 novos, alguns com funções ainda a ser determinada e algumas com relevância para as células imunes. Nós também validou um gene alvo candidato romance, PDE4B ao nível da proteína em PBMCs e verificou-sobre-expresso em linhas tumorais linfoides de CD4 +. Estes dados também sugerem que as células de tumor de origem linfóide pode ter locais de ligação STAT5 genómicas enviesadas e, portanto, genes alvo em comparação com células linfóides normais (como sugerido pela comparação dos nossos dados com os dados já existentes na literatura por Liao e colegas [16] ); Portanto, encontrar metas específicas para erradicá-los pode requerer o mapeamento do genoma dos maiores conjuntos de amostras de tumores primários da mesma origem. Se as células linfóides com uma via STAT5 hiperativa pode ser sensível aos inibidores PDE4B e um mecanismo para controlar certos tumores serão objecto de estudos futuros.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Tratamento

A linha celular de linfoma humano YT [40], CD4 + linhas de células T humanas HUT-102 [41] e MT-2 [42], de células CD4 + linha celular de linfócitos T derivados do timo Molt-3 [43], CD4 + a linha de células T H9 [44] e de IL-2 de linha celular de leucemia dependente humano CD4 + KIT225 [45] (gentilmente fornecida pelo Dr. J. Johnston, Queens University, Reino Unido) foram cultivadas como descrito [4], [38]. IL-2 foi obtido a partir do Repositório pré-clínica do NCI. As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas, activados com PHA e mantidas como descrito [46]. As células T CD4 + ou CD8 + foram isoladas por selecção negativa utilizando células CD4 Dynabeads® Untouched ™ Human T (Cat. Nº. 113.46D) ou células CD8 humano T (Cat. Nº. 113.48D) kits, respectivamente.

Cromatina imunoprecipitação

Chromatin imunoprecipitações foram realizadas a partir de cerca de 5 × 10

7 células KIT225 como descrito [4] com anticorpos anti-STAT5A /B (mistura SC-1081 e SC-835 (C-terminal STAT5A e anticorpos STAT5b, respectivamente)) ou soro de coelho normal (controlo de IgG) durante 3 h a 4 ° C. Para confirmar que os ensaios foram bem sucedidos, a amplificação por PCR do local de ligação conhecido STAT5 localizado a 5 ‘do gene humano IL2RA positiva dentro do Reguladora Região III [23] (para a frente: 5′-ACG TCT AGA AAG AAA GTG GTC-3′ reverso : 5’-CTG TCC CTG GAT GAA CCT AGT-3?) foi realizado utilizando PCR em tempo real quantitativa. [4] Os valores de transcrições em amostras desconhecidas foram obtidas por interpolação (ciclos de PCR para limiar Ct) valores de uma curva padrão. As curvas padrão foram preparados a partir de quantidades conhecidas de ADN purificado, amplificado por PCR. ChIP qPCR ensaios de primers para validação PDE4B ChIP foram encomendados à SABiosciences, uma empresa Qiagen (Cat # GPH900044 (-) 01A), fornecendo posições cromossômicas para o 250 bp que circunda o local putativo GAS (chr1:66569949-66570198, hg18). As reacções de PCR foram realizadas usando 2 × SYBR Green Mastermix da BioRad e um termociclador BioRad IQ5 em triplicado. unidades arbitrárias definidas como “ligação ao DNA, (dB)” foi obtida por 2∧ (-averageCt) e desvio padrão de SD ≈ ln (2) * stdev (averageCt) * Db.

Aleatório Amplificação da cromatina imunoprecipitadas ADN

Para gerar bibliotecas de DNA ChIP-Ed, amplificação aleatória foi realizada como descrito no https://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf pelo laboratório DeRisi na UC São Francisco. Resumidamente, as amostras de ADN-ChIP ed foram amplificados com uma versão modificada de um protocolo de PCR aleatório [47]. O DNA foi emparelhado com o iniciador A (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), e a síntese de ADN da segunda cadeia foi realizada com Sequenase (US Biochemical). Este material foi então usado como molde para 35 ciclos de PCR com o iniciador B (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTC) utilizando o seguinte perfil: 30 s a 94 ° C, 30 s a 40 ° C, 30 s a 50 ° C, 60 s a 72 ° C e uma mistura de dNTP contendo dUTP. Os produtos foram purificados com o kit de purificação QIAGEN PCR, quantificado e corrido num gel de agarose a 1% para verificar o tamanho do fragmento, em seguida, testados para o enriquecimento dos terminais positivo Reguladora Região III, tal como descrito acima.

In Silico

Análise

Chip-on-chip resultados foram analisados ​​com MAT (Análise baseada em modelo de matriz Tiling, [24] https://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/) pela Liu laboratório do Departamento de Bioestatística e Biologia Computacional do Instituto de Câncer Dana-Farber, Harvard School of Public Health. mapeamento genético proximal das sequências genómicas até 300 kb foi realizada utilizando o sistema de elementos de anotação Cis-Regulamentação (SECA https://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Os resultados foram visualizados por o IGV. A conversão de coordenadas do genoma e arquivos de anotação do genoma de diferentes versões dos conjuntos do genoma humano foi realizada utilizando a ferramenta UCSC Genome liftover em https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.

Isolamento RNA e ADNc síntese