Sumário

XB130, uma nova proteína adaptador, promove o crescimento celular, controlando a expressão de diversos genes relacionados. MicroRNAs (miARNs), que são frequentemente mis-expressos em células de cancro, regular a expressão de genes alvo. No presente estudo, buscamos explorar o mecanismo oncogênico de XB130 através da regulação miRNAs. Analisamos expressão miRNA em XB130 RNA curto hairpin (shRNA) células cancerosas da tiróide WRO transfectadas de forma estável por um ensaio matriz miRNA e 16 miRNAs foram up-regulada e 22 miRNAs foram regulada para baixo significativamente nestas células, em comparação com os não-transfectadas ou controle negativo shRNA células transfectadas. Nós escolhemos três dos miRNAs-regulada (miR-33a, miR-149 e miR-193a-3P) e validado-los em tempo real por qRT-PCR. superexpressão ectópica de XB130 suprimiu estes 3 miRNAs em células MRO, uma linha de células com baixa expressão de XB130. Além disso, nós transfectadas imita miR destas 3 miARNs em células WRO. Eles regular negativamente a expressão de oncogenes (miR-33a: MYC, miR-149: FOSL1, miR-193a-3p: SLC7A5), visando a sua região 3 ‘não traduzida, e reduziu o crescimento celular. Nossos resultados sugerem que XB130 poderia promover o crescimento de células cancerosas por regular a expressão de tumor miRNAs supressivas e seus genes alvo

Citation:. Takeshita H, Shiozaki A, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et ai. (2013) XB130, uma proteína New Adaptador, regula a expressão de tumor supressora MicroRNAs em células cancerosas. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10.1371 /journal.pone.0059057

editor: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 06 de outubro de 2012; Aceito: 11 de fevereiro de 2013; Publicação: 19 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Takeshita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) subvenções de funcionamento MOP-13270, MOP-42546 e MOP-119514. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de filamentos de actina proteína associada (AFAP) é uma pequena família de proteínas adaptadoras envolvidas na transdução de sinal intracelular, organização do citoesqueleto, a motilidade celular e outras funções celulares. Ele inclui AFAP [1], AFAP1L1 (filamentos de actina proteína associado 1 como 1) [2], e XB130 (também conhecida como proteína associada de filamentos de actina-1 como 2, AFAP1L2) [3]. Eles têm sido demonstrados para participar na regulação de várias vias de sinalização através da formação de proteína-proteína e /ou de complexos de proteína-lípido [1], [4], e sob certas circunstâncias, estas proteínas do adaptador podem ser envolvidos na tumorigénese [5], [ ,,,0],. 6]

XB130 é um substrato de tirosina-quinase, que pode ser tirosina fosforilada por Src e outras tirosina-cinases [7] – [9], e interagir com Src SH2 através da sua extremidade N-terminal e motivos de ligação de domínio SH3 , e medeia a transactivação de Src relacionada do SRE e AP-1 [7]. O N-terminal da XB130 também contém um motivo YxxM que se pode ligar à subunidade p85α de fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K) através dos seus domínios SH2, e subsequentemente activar Akt [2], [8]. XB130 medeia a sobrevivência e proliferação celular através de vários sinais a jusante de Akt [9]. XB130 em células de cancro da tiróide humana regula o crescimento do tumor, como mostrado num modelo animal com ratinhos nus, através da promoção da proliferação de células e a inibição da apoptose. Além disso, knockdown de XB130 reduz a expressão de vários genes relacionados com a proliferação celular e /ou sobrevivência [10]. XB130 também está envolvido na regulação da migração celular [11]. Alteração da expressão XB130 tem sido observado no cancro da tiróide humana [10], câncer de esôfago [12], e câncer gástrico [13]. Por conseguinte, estes estudos requerem uma análise mais aprofundada sobre a função de XB130 na tumorigénese.

MicroRNAs (miARNs) são pequenos RNAs não codificantes (cerca de 22 comprimentos de nucleótidos), que podem especificamente interagem com a região 3 ‘não traduzida (3’UTR) de ARNm-alvo, inibir a tradução de ARNm, ou conduzir a clivagem de ARNm e degradação [14]. O número de miARNs humanos relatados excede 2000 (miRBase, Release 18 no Instituto Sanger), e miARNs desempenham um papel importante no controlo de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, o metabolismo e a proliferação [15] – [18]. Alguns miARNs são frequentemente mis-expressos em células de cancro, e foram recentemente identificadas como novos factores relacionados com a oncogénese e a progressão do tumor [19] – [22]. Vários estudos recentes concentrar-se na regulação da expressão e função miRNA no câncer [23] – [26], incluindo o câncer de tireóide [27] – [29].

Embora XB130 pode regular a expressão de muitos genes relacionados com a célula proliferação [10], e promove a proliferação e sobrevivência celular via PI3K Akt /[9], pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes à sua regulação da expressão gênica. No presente estudo, buscou-se determinar se XB130 poderia regular a expressão de alguns desses genes através de regulação negativa dos miRNAs supressores de tumor. Examinamos nível de expressão miRNA usando XB130 RNA curto hairpin (shRNA) células cancerosas da tiróide WRO transfectadas de forma estável, em comparação com as células não transfectadas ou células transfectadas estavelmente com o controle negativo shRNA. Por outro lado, transfectadas células cancerosas MRO que têm muito baixo de expressão de plasmídeo com XB130 XB130 para melhorar a sua expressão. Três tumorais miRNAs supressivos foram identificados e mais bem estudada, em termos de expressão de seus genes-alvo, a proliferação celular e apoptose.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

tiróide humana carcinoma de células WRO e células MRO foram do Dr. S. Asa (University of Toronto, Toronto, Canadá) [30], que obteve essas células a partir de Dr. J. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, EUA ). As células foram mantidas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de FBS, 1 mmol /l de piruvato e aminoácidos não essenciais (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, EUA), e 1% de penicilina-estreptomicina. Nós previamente estabelecido WRO células que são transfectadas de forma estável com plasmídeos de shRNA para XB130. (C3-1 e C3-4 foram estabelecidas a partir de C3 vector; C4-3 e C4-11 foram estabelecidos a partir do vector C4) e plasmídeo de controlo negativo shRNA (NC1, nc9 e NC12) foram estabelecidos anteriormente [10]. G418 (0,25 mg /ml) foi adicionado ao meio de cultura de células transfectadas para manter a selecção. As células foram cultivadas numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C com 5% de CO

2.

Estudos de proteínas e Western Blotting

Western blot foi realizada de acordo com os procedimentos como descrito previamente [ ,,,0],31], [32]. Em resumo, as células foram lisadas com tampão de ensaio de precipitação radioimune modificado (50 mmol /L de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mmol /L de NaCl; 2 mmol /L de EGTA, 2 mmol /L de EDTA, e 1% de Triton X-100) contendo 10 ug /ml de cada um de aprotinina, leupeptina, pepstatina, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 mmol /L de Na

3VO

4 e 10 mmol /l de NaF. As concentrações de proteína foram medidas por Pierce® Kit BCA Protein Assay (Thermo, Rockford, IL, EUA).

Os lisados ​​celulares contendo quantidades iguais de proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram então sondadas com os anticorpos indicados. As proteínas foram reveladas por SuperSignal Oeste Dura substrato ampliado Duração (Thermo). As intensidades das bandas de proteína foram quantificados usando o software ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Anticorpo foi gerado

XB130 monoclonal tal como descrito anteriormente [7]. Anticorpos para β-actina, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). O anticorpo anti-PCNA veio de Abcam (Toronto, ON, Canadá). Anti-Ki-67 (clone Ki-S5) vieram de Cedarlane (Burlington, ON, Canadá).

Microscopia e Análise de imunofluorescência

Para imunofluorescência, as células foram cultivadas em vidro lamelas pré tratou-se com 50 ug /ml de poli-L-lisina. Após a adesão, as células foram rapidamente fixado em 4% de paraformaldeído durante 20 min e lavadas com PBS. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton-X-100 durante 10 min e bloqueadas com BSA a 1% durante 1 h. As lamelas foram então incubadas com o anticorpo primário contra XB130 durante 2 h, seguido de lavagem e incubação com o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) durante 1 h. As lamelas foram igualmente coradas para M-actina com faloidina Oregon Verde 488 (Invitrogen) durante 1 h e de núcleo com corante Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 10 min. As lamelas foram lavadas com PBS e montadas em lâminas de vidro utilizando Dako montagem de fluorescência média (Dako, Mississauga, ON, Canadá). A coloração foi visualizada usando um microscópio Olympus IX81.

Matriz MicroRNA e Análise de Dados

Quatro XB130 shRNA clones estavelmente transfectados (C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11) foram usadas como células XB130 knockdown. células WRO e três negativos controle shRNA clones estavelmente transfectados (NC1, nc9 e NC12) foram usados ​​para comparação. O ARN total foi extraído utilizando miRvana ™ kit de isolamento de miARN (Ambion, Austin, TX, EUA). O número de integridade do ARN determinada pela Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi usada como uma medida da qualidade do ARN. perfil de expressão miRNA foi realizada utilizando sistema de miRNA Microarray da Agilent Humano (Agilent Technologies) com uma G3 SurePrint 8 × 60 K v16 plataforma para 1.205 miRNAs humanos (miRBase liberar 16,0). Resumidamente, 100 ng de ARN total foram marcadas com Cianina 3-PCP e hibridado para as matrizes a 55 ° C durante 20 h. As lâminas foram digitalizadas com um G2505C Agilent Technologies Scanner e as imagens digitalizadas foram analisadas usando Agilent recurso de extração versão 10.7.3. Análise da expressão diferencial e análise de agrupamento hierárquico foi realizada utilizando GeneSpring GX 11,5 (Agilent Technologies).

Alvo Predição de miRNAs

TargetScan 6,0 (https://www.targetscan.org/), microRNA .org (https://www.microrna.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/) e DIANA-MICROT v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) foram usadas para procurar alvos previstos de miRNAs.

real-Time RT-PCR quantitativo para XB130

O RNA total foi extraído utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA), e o ADNc foi sintetizado a partir do ARN total utilizando kit de alta Capacidade de ADNc RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). RT-PCR quantitativa para XB130 foi realizada utilizando o kit de SYBR Green PCR Master I em LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. SdhA foi usado como um gene de referência interno para análises. Os iniciadores de PCR para XB130 e SdhA são: 5′-XB130_forward AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 ‘, 5′-XB130_reverse GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3′, 5’-SDHA_forward CGGCATTCCCACCAACTAC-3 ‘e 5′-SDHA_reverse GGCCGGGCACAATCTG-3’. Expressão de XB130 foram normalizados utilizando o método 2-ΔΔCT relação ao SdhA. O ΔCt foi calculada subtraindo os valores de Ct de SdhA a partir dos valores Ct do XB130. mudança da dobra no gene foi calculada pela equação 2-ΔCt [33]. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. O meio de expressão da relação XB130 /SdhA em células WRO foi definido como 1 e os resultados foram expressos como média e desvio padrão de dobra de mudanças XB130.

Real-Time RT-PCR quantitativo para a pri-miRNAs e maduro miRNAs

Para quantificar a expressão do pri-miRNAs e miRNAs maduros, RNA total foi extraído utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion). Como para as quantificações do pri-miARNs, o ADNc foi sintetizado utilizando kit de Alta Capacidade de ADNc RT (Applied Biosystems). As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando um TaqMan® Universal Master Mix II e os TaqMan ® pri-miRNA ensaios específicos para possui-mir-33a, tem-mir-149 e tem-mir-193a-3p em 7900 em tempo real sistema de PCR (Applied Biosystems).

Quanto quantificações dos miRNAs maduros, um kit TaqMan® microRNA RT e TaqMan® microRNA ensaios específicos para HSA-miR-33a, tem-miR-149 e tem-miR- 193a-3p (Applied Biosystems) foram utilizados para as reacções de RT. As reacções de PCR em tempo real foram realizadas utilizando um TaqMan® Universal Master Mix II e os ensaios TaqMan® microRNA sobre um sistema de PCR de 7900 em tempo real (Applied Biosystems). Em ambas as quantificações, RUN6B (U6) foi avaliado como controlo endógena, e os resultados foram normalizados utilizando o método 2-ΔΔCT mesmo que em tempo real de qRT-PCR para XB130.

transfecção celular

geração de plasmídeo de GFP-sozinha, marcaram-GFP XB130 (GFP-XB130) e o seu mutante de deleção N-terminal (GFP-XB130ΔN) foram descritos anteriormente [11]. MRO células foram transfectadas transientemente utilizando 60 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen) numa placa de 100 mm, como descrito nas instruções do fabricante. O meio contendo o plasmídeo foi substituído com meio fresco 24 h após a transfecção, e as células positivas para GFP foram isolados por células activadas por fluorescência (FACS) Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA), 48 horas após a transfecção. células GFP positivas foram então usados ​​para ensaios de mancha e proliferação celular ocidentais.

Mirvana ™ miRNA Mimic de miR-33a, miR-149 e miR-193a e Mirvana ™ miRNA Mimic Negative Control # 1 foram obtidos comercialmente (Ambion ). WRO células foram transfectadas com 50 pmol de miR imitam utilizando 5 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen) numa placa de 6 poços de acordo com o protocolo do fabricante. O meio contendo o plasmídeo foi substituído por meio fresco 24 h após a transfecção e RNA total e as proteínas foram extraídas 48 h após a transfecção.

luciferase Reporter Assay

sequências de semente de miR-33a, miR -149 e miR-193a-3P e emparelhamento sequências 3’UTR de MYC, FOSL1 e SLC7A5 foram previstas por TargetScan. 3’UTR sequências foram clonadas a jusante para a luciferase do pirilampo de pmirGLO Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão e verificado por sequenciação (Promega, Madison, WI, EUA). O pmirGLO construir e MIR imitar ou controlo miR mímico foram co-transfectados em células WRO cultivadas em placas de 96 poços, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as actividades da luciferase Renilla foram pirilampo e luciferase medida utilizando um Ensaio Repórter Dual System (Promega). Firefly luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. A média da actividade da luciferase da relação Firefly /Renilla em células WRO co-transfectadas com cada um dos pmirGLO construir e controlar miR mímica foi definido para 1. Os dados foram expressos como média e desvio padrão de cinco experiências independentes.

proliferação celular e apoptose Assays

WRO células foram plaqueadas em poços de placas de microtitulação quíntuplo de 96 poços (100 ul /poço) para o ensaio de proliferação de células, em placas de microtitulação de 12 poços (1 mL bem /) para contagem de células ensaio, e em 6 poços de microtitulação (placas de 2 ml /poço) para ensaio de apoptose, em 5 × 10

4 células /ml e cultivadas durante 24 h. As células foram então transfectadas com miARN mímico como descrito acima.

A proliferação celular foi avaliada utilizando CellTiter 96® Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (Promega) a cada ponto de tempo (0, 24, 48, e 72 h) após a transfecção. Depois substituído com meio fresco, 20 ul da CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera humidificada, 5% de CO

2 atmosfera. A absorvância das amostras foi lida a 490 nm com um leitor de placas automático (Thermo). A absorvância do meio sozinho-fundo foi subtraído. O índice de proliferação foi calculada como a absorvância média de células no ponto de tempo indicado dividido pela média de absorvância de células em 0 horas após a transfecção e expressos como média e desvio padrão. Ensaio de contagem de células, as células foram destacadas dos frascos com uma solução de tripsina-EDTA e contados num hemocitómetro por em cada ponto de tempo. O número de células foi expresso como média e desvio padrão

No ensaio de apoptose, as células transfectadas foram colhidas 72 h após a transfecção e coradas com anexina V fluoresceína conjugado com isotiocianato de e fosfatidilinositol (PI), utilizando anexina V. – Kit FITC (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA), de acordo com os protocolos do fabricante e analisadas por BD AccuriTM C6 Citómetro de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA).

resultados

Caracterização de células XB130 shRNA transfectadas estavelmente WRO

Para estudar os papéis de XB130 na regulação das actividades de células WRO, nós transfectadas estavelmente as células com shRNA alvo XB130. Expressão de XB130 foi significativamente menor nestes clones (C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11) do que em células não transfectadas WRO e outros três clones estavelmente transfectadas com um shRNA controlo negativo (NC1, nc9, NC12), como determinado por transferência de Western (Fig. 1A) e por em tempo real quantitativa de RT-PCR (Fig. 1B). A expressão de ARNm SdhA foi usado como um gene de manutenção por qRT-PCR (Fig. 1B), porque a sua expressão não muda, sob diferentes condições experimentais [10], [34], [35]. Curiosamente, XB130 células knockdown apresentaram morfologia alongada quando examinados com microscopia de contraste de fase. Além disso, a coloração immunofluorecence revelou que a expressão de XB130 em células C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11 era praticamente indetectável, e coloração de F-actina também apresentaram morfologia alongada em níveis de células individuais (Fig. 1C, A Fig. S1)

As seguintes células foram examinadas:. células WRO (WRO), controle negativo shRNA transfectadas células WRO (NC1, nc9 e NC12) e XB130 shRNA transfectadas células WRO (C3-1, C3-4 , C4-3 e C4-11). (A) XB130 shRNA efetivamente reduziu XB130 níveis de proteína. (B) em tempo real quantitativa de RT-PCR revelou que a expressão de ARNm em XB130 XB130 shRNA transfectadas células WRO foram significativamente mais baixos do que as células WRO (* P 0,05). (C) WRO, nc9 C3-1 e foram imuno-coradas com um anticorpo XB130 e contrastadas para F-actina e núcleos com verde de Oregon 488 faloidina e Hoechst 33342. A expressão da proteína no citoplasma XB130 desapareceu nas células transfectadas XB130 shRNA.

células MicroRNA expressão perfil no XB130 shRNA transf

Para identificar miRNAs regulados por XB130, foi realizado ensaio de perfil de expressão miRNA, comparando XB130 shRNA células WRO transfectadas de forma estável (C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11) com os controles (WRO, NC1, nc9 e NC12) usando um ensaio de matriz de microRNA. análise GeneSpring GX mostrou que 38 miARNs foram significativamente alteradas por o knockdown estável de XB130 em células WRO (valor de p 0,05), dos quais, 16 foram regulados positivamente (Tabela 1) e 22 foram regulados negativamente (Tabela S1) em XB130 shRNA células transfectadas.

para determinar os mecanismos pelos quais XB130 regula a proliferação celular, nós nos concentramos em miRNAs reprimidos pela XB130 e selecionados miR-33a, miR-193a-3p e miR-149, para posterior análise , que têm sido relatados para mostrar funções supressoras de tumor em vários cancros [36] – [38]. Para verificar os efeitos da XB130 no miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p, quantificamos níveis destes 3 miRNAs usando em tempo real qRT-PCR. Tanto a miARN madura (Fig. 2A) e os níveis de pri-miARN (Fig. 2B) destas três miARNs em XB130 shRNA estavelmente transfectadas células WRO (C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11) foram significativamente mais elevados do que aqueles em que as células não transfectadas ou células WRO estavelmente transfectadas com shRNA controlo negativo (NC1, nc9 e NC12).

as formas maduras (a) e transcritos primários (B) de miR-33a, miR- 149 e miR-193a-3p são significativamente mais elevados em células WRO XB130 shRNA (C3-1, C3-4, C4-3 e C4-11) do que em WRO (* P 0,05) transfectadas

ectópica expressão XB130 suprimida formas primárias e maduros de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p

Para confirmar ainda mais os efeitos regulatórios da XB130 na expressão de miR-33a, miR-149, e miR-193a-3p, foi realizado um estudo de “resgate” em células de MRO, que têm muito baixa expressão XB130, conforme determinado pelo western blot. Nós células transfectadas com plasmídeos expressando MRO-GFP sozinho, GFP-XB130, ou o seu mutante de deleção N-terminal, a GFP-XB130ΔN. Células positivas para GFP foram recolhidas por FACS, e a expressão de proteínas GFP-XB130ΔN GFP-XB130 e em células transfectadas MRO foi demonstrada por Western blot (Fig. 3A). Em contraste com as células WRO, células MRO mostraram níveis de expressão significativamente mais elevados de miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p, ambas as formas maduras e primários. XB130-GFP sobre-expressão resultou numa regulação negativa significativa de ambos os miARNs maduros e pri-miARNs, ao passo que a sobre-expressão de GFP-XB130ΔN não provocou estes efeitos (Fig. 3B e C). Uma vez que o N-terminal de XB130 contém motivos funcionais que podem interagir com Src [7] e a subunidade p85α de PI3K [8], a ausência de efeitos deste mutante sugere que os efeitos de “resgate” de GFP-XB130 pode estar relacionada com Src e /ou relacionadas com PI3K mecanismos. O facto de ambos os níveis maduros e pri-miARN foram reguladas de forma semelhante por XB130 sugeriu que estes três XB130 afectada miARNs pelo menos parcialmente, ao nível da transcrição.

MRO células foram transfectadas com o vector GFP sozinho, ou GFP-XB130 , GFP-XB130ΔN (XB130 N-terminal mutante de deleção). Células positivas para GFP foram recolhidas por FACS. (A) Western blot revelaram que as células MRO expressar muito baixo XB130. Transfecção de GFP-XB130 (MRO-XB130) ou GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) mostrou XB130 expressão em células de MRO. As formas maduras (B) e transcritos primários (C) do miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p foram examinadas por em tempo real quantitativa de RT-PCR. Estes miARNs e pri-miARNs em células MRO foram significativamente maiores do que em células WRO, e significativamente reduzida por sobre-expressão de GFP-XB130, mas não por GFP-XB130ΔN. * P . 0,05 em comparação com células WRO

superexpressão de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p reduzida a jusante alvejado proteínas relacionadas à proliferação celular

relatado anteriormente que em XB130 shRNA transfectadas estavelmente células WRO, 57 genes relacionados com a proliferação celular ou sobrevivência foram significativamente alteradas, e a maioria destes genes foram regulados negativamente por XB130 shRNA [10]. Especulamos que entre esses genes, alguns são alvos de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p. Usando TargetScan 6.0, microRNA.org, PicTar e v4 DIANA-MICROT /TarBase 5.0, identificamos MYC e CEBPG como candidatos de genes-alvo para miR-33a, CEBPG e FOSL1 para miR-149, SLC7A5, DECR1 e SETD8 para miR- 193a-3p. Para avaliar se estes miRNAs realmente regular a expressão de alvos candidatos, nós transfectadas miR imitar em células WRO. A transfecção destes três imita miR aumentou significativamente os níveis de miARN respectivos (Fig. 4A), mas não afectou os níveis de proteína XB130 (Fig. 4B). Em comparação com células WRO, os níveis de proteína de MYC, FOSL1 SLC7A5 e foram mais baixos em XB130 shRNA células transfectadas de forma estável (C3-1 como um exemplo) (Fig. 4C-E). A sobre-expressão de miR-33a resultou numa diminuição dos níveis de proteína MYC (Fig. 4C). níveis Da mesma forma, a sobre-expressão de miR-149 regulado negativamente FOSL1 de proteína (Fig. 4D), e a sobre-expressão de miR-193-3p regulada negativamente os níveis de proteína SCL7A5 (Fig. 4E). A mímica controlo negativo (Cont-M) não afectou a estas três proteínas (Fig. 4C-E). Os níveis de proteína de CEBPG, DECR1 e SETD8 não foram alteradas por sobre-expressão destas imita miR (dados não mostrados).

(A) transfecção de miR imita (33a-m, m-149 e 193a-m) significativamente aumento da respectiva expressão miARN, enquanto o controlo de miR mímico (cont-m) não teve tal efeito, como quantificado pelo tempo real quantitativa de RT-PCR. (B) Western Blot mostra que a transfecção de miR mímico não alterou os níveis de proteína XB130. (C-E) MYC, FOSL1 e SCL7A5 são previstos alvo de miR-33a, o miR-149 e miR-193-3p, respectivamente. O painel superior mostra exemplos que a expressão da proteína alvo previsto foi diminuiu respectivo miR imitar as transfecções tal como determinado por Western blotting. painel inferior mostra a quantificação dos níveis de expressão por densitometria.

Uma vez que a sobre-expressão de GFP-XB130 em células MRO suprimida a expressão de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p ( Fig. 3A-3B), nós também testamos se ela pode afetar posteriormente proteínas-alvo a sua a jusante. As transferências de Western mostraram que, em comparação com células MRO-GFP sozinho transfectadas, GFP-XB130 células transfectadas apresentaram maior MYC, FOSL1 e SLC7A5. Em comparação com células transfectadas GFP-XB130ΔN, os níveis FOSL1 SLC7A5 e também foram claramente mais elevada em GFP-XB130 células transfectadas (Fig. S2). Estes resultados apoiou os dados imitar miRNA em células WRO.

miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p directamente visados ​​Local de Ligação na 3’UTR de MYC, FOSL1 e SLC7A5, Respectivamente

, em seguida, utilizado o sistema repórter de luciferase dupla pmirGLO para determinar se a redução em MYC, FOSL1 e níveis SLC7A5 por sobre-expressão de miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p miR mímico foi através da 3’UTR de seus mRNAs alvo. A complementaridade considerável foi identificada, utilizando os algoritmos em TargetScan entre sequências no interior das regiões de semente de miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p e sequências na 3’UTR de MYC, FOSL1 e SLC7A5, respectivamente (Fig. 5A ). As construções que contêm pmirGLO um repórter de luciferase e o 3 ‘UTR de cada um destes genes foram geradas 3. WRO células foram co-transfectadas com os constructos pmirGLO e cada um dos imita miR ou um controlo negativo miR. A sobre-expressão de miR-33a significativamente reduzida actividade da luciferase do pmirGLO construção com sequências clonadas 3’UTR de MYC (Fig. 5B). Da mesma forma, a sobre-expressão de miR-149 e miR-193-3p reduziu significativamente as actividades da luciferase quando as células foram transfectadas com o constructo de luciferase contendo os 3’UTRs de FOSL1 e SCL7A5 (Fig. 5C e D). Estes resultados indicaram que estes 3 miARN pode afectar a expressão de genes alvo relacionados por ligação aos seus 3’UTRs.

(A) sequências de semente de miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p e emparelhamento 3’UTRs sequência de MYC, FOSL1 e SLC7A5 como previsto por TargetScan são mostrados. O pmirGLO construir com as sequências clonadas 3’UTR (luc-myc, luc-FOSL1 e luc-SLC7A5) eo miR mímica (33a-m, 149 m e 193a-m) ou controlar miR mímica (cont-m) foram co-transfectados em células WRO. (B) sobre-expressão de miR-33a reduziu significativamente a atividade da luciferase do pmirGLO construir com sequências de 3’UTR clonada do MYC (luc-MYC). actividade de luciferase Da mesma forma, a sobre-expressão de miR-149 e miR-193-3p significativamente reduzida do Luc-FOSL1 (C) e o luc-SCL7A5 (D), respectivamente.

reduziu a proliferação celular por sobre-expressão de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p

MYC, FOSL1 e SLC7A5 são conhecidos a participar na regulação da proliferação celular. Uma vez que a transfecção de cada uma destas imita miR-regulada respectiva proteína alvo, que, em seguida, examinou os efeitos destes imita MIR sobre a proliferação celular. A proliferação de células WRO foi reduzida pela transfecção de miR mímico de miR-33a, o miR-149 ou miR-193a-3p, como determinado pelo ensaio de MTT (Fig. 6A), ou por contagem de células (Fig. 6B), em comparação com controlo miR imitam as células transf ectadas a 72 horas após a sementeira de células. Além disso, a expressão de marcadores de proliferação celular, Ki-67 e PCNA, foram reduzidos em cada um destes três imita RIM em comparação com células não transf ectadas ou células WRO transfectadas com controlo mímico (Fig. 6C). Por outro lado, a sobre-expressão de GFP-XB130, e para menos de GFP estender-XB130ΔN aumento da expressão de Ki67 em células MRO (Fig. S2).

Os números de células viáveis ​​foram avaliadas por ensaio de MTS (A) e contagem de células (B) a 24, 48, e 72 h pós-transfecção de controlo mímico (cont-m) e específico de miR mímico (33a-m, m-149 e 193a-m). A sobre-expressão de miR-33a, o miR-149 e miR-193a-3p levou a uma redução na proliferação celular. (C) marcadores de proliferação celular, PCNA níveis de Ki-67 e, também foram reduzidos em miR imitar células tratadas (33a-m, m-149 e 193a-3P). (D) A apoptose foi determinada por citometria de fluxo utilizando PI /anexina V dupla coloração. Superexpressão de miR-193a-3A induzida significativamente tanto a apoptose precoce (anexina V positiva /PI negativo) e apoptose tardia (anexina V /PI double positivo) em células WRO. *: P 0,05

Para determinar se o número de células reduzido foi devido a apoptose, foi realizada citometria de fluxo com PI /dupla marcação anexina V.. células positivas anexina V representam início a apoptose, enquanto que a anexina V e PI células positivas duplas representam apoptose tardia [10]. Superexpressão de miR-193a-3a (mas não outros dois miRNAs) induziu significativamente tanto precoce e apoptose tardia em células WRO (Fig. 6D). Estes resultados sugerem que o número de células reduzido em miR-33a e miR-149 imita são principalmente devido à inibição da proliferação celular, ao passo que o miR-193a-3p pode reduzir a proliferação celular e induzem a apoptose.

Discussão

em nosso estudo anterior, análise de microarray identificou 246 genes significativamente alteradas por bater de forma estável abaixo de XB130 em células de cancro da tiróide WRO. Especialmente, 57 dos 246 genes estão relacionados à proliferação celular ou sobrevivência, incluindo muitos reguladores de transcrição [10]. Estimou-se que aproximadamente 30% de todos os genes humanos podem ser regulados por miARNs [39]. As alterações no processamento miRNA contribui para Tumorigênese [40]. Portanto, a hipótese de que XB130 pode regular a expressão de miARN relacionados com o crescimento e subsequentemente controlar genes relacionados com a proliferação celular e sobrevivência. Para avaliar esta hipótese, analisamos a expressão miRNA em XB130 células WRO knockdown. os dados da análise de matriz MicroRNA mostrou que 38 miARNs foram diferencialmente expressos em células XB130 knockdown. Entre eles, nós nos concentramos em miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p que têm sido relatados como miRNAs supressores de tumor em vários tipos de câncer. MiR-33a desacelera a proliferação de células que actuam por inibição de células proto-oncogene PIM-1 no linfoma e câncer de cólon [36]. expressão de miR-149 tem uma correlação direta com oncogenes KCNMA1 e LOX em carcinoma de células renais claras celular [37]. Da mesma forma, o miR-193-3p alvo JNK1 e inibe a progressão do ciclo celular e a proliferação de cancro da mama [38]. Nós validado-regulação de miR-33a, miR-149 e miR-193a-3p na XB130 células knockdown por em tempo real qRT-PCR.

Nos processos de expressão de microRNA, RNA polimerase II produz longas transcrições de miRNA primário chamado pri-miARNs, que são cortadas e clivado por um complexo multi-proteínas, incluindo Drosha e DICER1 para produzir amadurecer miARNs funcionais [41]. Como a expressão miRNA é regulada ainda não está claro, no entanto, vários mecanismos têm sido sugeridos. Tem sido demonstrado que a p53 foi responsável pela maturação pós-transcricional de miR-16-1, miR-143 e miR-145, enquanto que a expressão de conexo pri-miARNs não foi influenciada pelo p53 [25]. Conforme relatado na Fig.