Abstract

Anteriormente três oncogenes linhas de peixe-zebra transgénicos com expressão indutível de

xmrk

,

kras

ou

Myc

no fígado foram gerados e estas linhas transgénicas desenvolver tumores hepáticos viciado-oncogenes por indução química. No estudo actual, abordagens transcriptomic comparativos foram usadas para examinar a correlação entre os três cancros do fígado induzidas transgénicos com cancros do fígado humano. perfis de RNA a partir dos três tumores peixe-zebra indicado relativamente pequenas sobreposições de genes significativamente desregulados e vias biológicas. No entanto, os três tumores assinaturas transgênicos todos apresentaram correlação significativa com carcinoma hepatocelular humano avançado ou muito avançada (HCC). Curiosamente, a assinatura molecular de cada tumor de fígado de peixe-zebra induzida pelo oncogene correlacionada com apenas um pequeno subconjunto de amostras de carcinoma hepatocelular humano (24-29%) e foram conservadas entre o peixe-zebra vias regulada para cima e correlacionados subgrupo HCC humana. Os três modelos de câncer de fígado de peixe-zebra, juntos, representaram quase metade (47,2%) do HCC humanos enquanto alguns HCCs humanos mostrou correlação significativa com mais de uma assinatura definida a partir dos três tumores peixe-zebra viciado-oncogenes. Em contraste, comumente desregulada genes (21 para cima e 16 para baixo), os três modelos de tumor de peixe-zebra mostraram geralmente desregulação concordante na maioria dos HCC humana, sugerindo que estes genes podem ser mais consistentemente desregulada em uma ampla gama de HCC humanas com diferentes mecanismos moleculares e, assim, servir como marcadores de diagnóstico comum e alvos terapêuticos. Assim, estes modelos de peixe-zebra transgénicos com tumores induzidos por oncogenes bem definidas são ferramentas valiosas para a classificação molecular de HCC humana e para a compreensão dos condutores moleculares na hepatocarcinogênese em cada subgrupo HCC humana

Citation:. Zheng W, Li Z , Nguyen AT, Li C, Emelyanov A, Gong Z (2014)

Xmrk

,

Kras

e

Myc

modelos transgênicos do cancro do fígado Zebrafish Compartilhar assinaturas moleculares com Subconjuntos de Human Carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 9 (3): e91179. doi: 10.1371 /journal.pone.0091179

editor: Xiaolei Xu, Clínica Mayo, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de outubro de 2013; Aceito: 09 de fevereiro de 2014; Publicação: 14 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Conselho de Investigação médica Nacional de Cingapura. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Zhiyuan Gong é atualmente um editor acadêmico da PLoS ONE; isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

carcinoma hepatocelular humano (HCC) é conhecido por ser uma doença muito heterogénea, especialmente no estágios intermediários e avançados [1]. Devido às etiologias diversas e complexas que contribuem para a incidência de HCC, mutações genéticas diferentes ou vias moleculares alterados poderiam ser responsáveis ​​por hepatocarcinogenese. Até agora, diversas vias cancerígenas foram identificados para ser envolvido no desenvolvimento e progressão do HCC, incluindo o VEGFR, EGFR, e as vias de mTOR [2]. No esforço para decifrar o papel de diferentes vias oncogénicos, um número de modelos de ratos transgénicos foram estabelecidas [3], [4] e análises transcriptomic comparativos foram usadas para identificar os melhores modelos de ratos transgénicos para HCC humanas [4].

O peixe-zebra tem sido cada vez mais reconhecida como um modelo experimental valioso para doenças humanas, particularmente para cancros [5], incluindo cancros do fígado [6] – [11]. Demonstrou-se que os tumores tinham semelhanças marcantes de peixe-zebra com histologicamente cancro humano [12], [13]. Transcriptomic e análises epigenéticas também indicaram características conservadas do HCC peixe-zebra induzida por substância cancerígena com HCC humana [14] – [16]

Anteriormente temos gerados vários modelos de tumores de fígado por expressão transgénica de três oncogenes diferentes (

kras, xmrk

ou

Myc

) especificamente no fígado de peixe-zebra e estes peixes-zebra transgénicos costumam produzir tumores hepáticos com graus variáveis ​​de gravidade de adenoma hepatocelular (HCA) para HCC [6] – [9]. Os três oncogenes nós utilizados no peixe-zebra têm sido mostrados para ser envolvido na hepatocarcinogenese.

KRAS

é mutado em ~ 7% dos cânceres de fígado em humanos [17], mas a sinalização Ras é ubíqua ativado em HCC [18].

Xmrk

é uma variante que ocorre naturalmente do EGFR nos peixes do género

Xiphophorus

(platyfish e Espadas) com autofosforilação constitutiva e ativação de sinais a jusante [19]. A activação do sinal de EGFR é correlacionada com um mau prognóstico de doentes com HCC [20].

MYC

é comumente amplificado em muitos tipos de câncer, incluindo HCC e maior nível de MYC expressão está associada com o estado mais avançado de HCC [21]. Nós mostramos que a sobre-expressão de

kras

e

xmrk

no fígado de peixe-zebra poderia induzir HCC [7] – [9], enquanto a superexpressão de

Myc

induzida HCA na maior parte [ ,,,0],6].

transcriptomic análises comparativas de modelos animais e amostras clínicas humanas fornecem uma poderosa ferramenta para a identificação de vias moleculares conservadas e genes biomarcadores para o diagnóstico e terapia [15], [22]. Os nossos modelos de peixe-zebra transgénicos oncogene existentes têm bem definido up-regulação do oncogene motorista e isso pode fornecer uma ferramenta valiosa para identificar as forças motrizes moleculares na carcinogênese humana por análises transcriptomic comparativos. Assim, no presente estudo, foi empregue tecnologia de sequenciação de ARN para comparar os perfis de transcriptomic os três tumores hepáticos induzidos por oncogenes em peixes-zebra transgénicos. Por análises comparativas com transcriptomes fígado humano de pacientes cirróticos com CHC muito avançado, descobrimos que todos eles apresentaram correlação molecular forte com HCC humanos avançados ou muito avançados. No entanto, existem muito distintas vias biológicas desregulados baseados em genes desregulados nos três modelos transgénicos de oncogenes. Interessantemente, cada modelo de tumor de fígado de peixe-zebra correlacionada com um subconjunto de HCC humana e cada subconjunto tem algumas características moleculares distintas. Nós mostramos que os modelos de peixe-zebra transgénicos com a actividade do condutor-gene bem definida deve ser valioso para a classificação do HCC humana e para compreender os mecanismos moleculares por trás de cada subtipo HCC.

Materiais e Métodos

Tratamento e indução de cancro do fígado nas Models Três peixes-zebra transgénicos

Zebrafish foram mantidas seguindo o protocolo aprovado pelo Institutional animal Care e Use Committee da Universidade Nacional de Cingapura (Protocolo 079/07). A geração de

xmrk

e

Myc

peixes-zebra transgénicos foi descrito anteriormente e foram denominados como

TO (xmrk)

[9] e

TO (Myc)

[6], respectivamente, nas publicações anteriores. As duas linhas transgénicas foram construídas usando um sistema transgénico induzível por tetraciclina e a expressão de oncogenes, foram estimuladas pela doxiciclina. O

KRAS

V12

linha transgénica utilizado no presente estudo foi recentemente gerada utilizando um sistema de mifepristona induzível [7], em combinação com um sistema Cre-loxP (não publicado). Para o

xmrk

e

Myc

linhagens transgênicas, peixes transgénicos e seus irmãos não-transgênicas foram tratadas com 60 ug /ml de doxiciclina (Sigma, EUA) a partir de 3,5 mpf (mês após a fertilização) durante 6 semanas. Todas

xmrk

peixes desenvolveram HCC e todos

Myc

peixes desenvolvido HCA. No total, para cada linhagem transgênica, uma amostra de tumor (peixes transgénicos tratados com doxiciclina) e três amostras de controlo (irmãos não-transgênicas semelhante tratado com doxiciclina, irmãos transgênicos sem tratamento doxiciclina, e os irmãos não-transgênicas sem tratamento doxiciclina) foram coletadas para sequenciação de ARN. Em todos os casos, amostras de fígado utilizadas para a sequenciação de ARN foram reunidas de quatro para cinco peixes machos. Para o

kras

V12

peixes transgénicos, peixes transgénicos de um mês de idade foram tratadas com 1 mM mifepristone (Sigma, EUA) durante 36 horas para induzir a recombinação Cre-mediada para a ativação da

kras

V12

expressão do transgene no fígado. O

kras

V12

peixes transgénicos activado foram então deixadas a crescer durante seis meses para desenvolver amostras HCC e HCC foram então recolhidos para o seqüenciamento RNA. Três tumores no fígado de peixe transgénico induzido e três fígados normais de peixes transgénicos não induzidas foram reunidas separadamente como amostras de tumor e de controlo. Todas as amostras utilizadas foram de peixe macho e foram utilizados dois conjuntos de réplicas biológicas.

A identificação das listas de genes assinatura em cada modelo de cancro do fígado de peixe-zebra

O ARN total foi extraído utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen, EUA ) e tratou-se com ADNase I para remover a contaminação do ADN genómico. 3 ‘de RNA-SAGE (análise em série da expressão do gene) sequenciação foi realizada num ABI plataforma sólida por missão Biotech (Taiwan) de acordo com o protocolo do fabricante e 10-23000000 leituras foram gerados a partir de cada um amostrador (Tabela S1). Resumidamente, o ARNm foi purificado utilizando Dynabeads Oligo (dT) ECOP (Invitrogen) e submetido a síntese de cDNA. ADNc resultante foi digerido por NlaIII e EcoP15I para resultar em uma marcação 27 nucleótidos de ADNc entre os dois adaptadores de sequenciação. As etiquetas foram mapeados para o NCBI RefSeq (Sequência de Referência) do banco de dados mRNA para peixe-zebra com um critério de permitir máximas não coincidências nucleotídicas 2. Todos os dados de RNA-Seq foram submetidos a Gene Expression Omnibus banco de dados com os seguintes números de acesso: GSE53342 para

xmrk

e

Myc

dados e GSE53630 para

KRAS

dados. contagens de tags para cada transcrição foram normalizados para TPM (transcrições por milhão) para facilitar a comparação entre as diferentes amostras. Os genes diferencialmente regulados no

Myc viajantes – e

xmrk viajantes – cânceres de fígado induzidos foram identificadas utilizando uma amostra t-teste, conforme descrito anteriormente [23], e os genes diferencialmente expressos no

kras

câncer de fígado induzida foi identificado usando bicaudal teste t de Student.

para facilitar implicações funcionais de transcriptoma peixe-zebra, todos os genes de peixe-zebra foram mapeados para genes humanos anotados, a fim de usar o software on-line existente desenvolvida em genes humanos. Assim, o mapeamento de homologia humana de clusters UniGene peixe-zebra foram recuperados do Genome Institute of Singapore Zebrafish Anotação de Dados (https://123.136.65.67/). Para grupos UniGene mapeados por mais do que uma entrada de transcritos, a maior TPM foi usado para representar o nível de expressão do cluster Unigene. Alguns clusters UniGene peixe-zebra foram mapeados para grupos UniGene mais do que um humanos, que geralmente vinham da mesma família de genes. Para remover a redundância e evitar causar viés na análise funcional, apenas o primeiro cluster Unigene humana na lista foi selecionado para representar os clusters UniGene peixe-zebra. As listas de genes de peixe-zebra significativamente up-regulamentados que foram mapeadas com homólogos humanos e utilizados para analyese comparativa com dados HCC humanas são mostrados na Tabela S2.

Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA)

GSEA foi utilizado para estabelecer o parentesco entre os modelos de peixes-zebra transgénicos e cancros do fígado humano [24]. GSEA é um método computacional que determina se um

priori

conjunto definido de genes mostra estatisticamente significativas, diferenças concordantes entre duas amostras biológicas; ele calcula uma pontuação de enriquecimento utilizando uma estatística de soma em execução através de uma lista ordenada dos conjunto de dados de expressão gênica. homólogos humanos dos genes significativamente up-regulamentados dos tecidos tumorais de peixe-zebra foram usados ​​como assinaturas de câncer para cada modelo de peixe-zebra transgénicos para a comparação com os dados transcriptomic HCC humanos. Cada fenótipo escolhido de HCC humanas (tanto uma fase HCC específico ou a uma amostra particular, HCC) foi comparada com o resto das amostras no mesmo conjunto de dados. Todos os genes no fenótipo escolhido foram classificados por teste-t para determinar as diferenças de expressão entre diferentes fases ou amostras HCC HCC diferentes. A pontuação enriquecimento da assinatura câncer de peixes-zebra transgénicos pré-definida foi calculada utilizando uma estatística de soma em execução através dos genes classificados. A significância estatística da pontuação de enriquecimento foi estimado utilizando um procedimento de teste de permutação com base empírica-fenótipo. Um valor FDR (taxa de detecção falsa) foi fornecido através da introdução de ajuste do teste de hipóteses múltiplas. dados de transcriptoma de câncer de fígado humanas foram recuperados de Gene Expression Omnibus banco de dados (GEO). O conjunto de dados humana, incluindo diferentes estágios de HCCs utilizados na comparação era GSE6764 [25]. Os dez conjuntos de dados HCC humanos utilizados para examinar a representação de assinaturas do gene do cancro do fígado de peixe-zebra são resumidos na Tabela S3. informações anotação foi recuperado do SOURCE (https://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch). Para várias sondas que podem ser mapeados para um cluster Unigene, a intensidade máxima do sinal foi selecionada para representar o nível do cluster Unigene expressão.

GSEA Pré-classificados Análise

GSEA opção de pré-classificados foi utilizado para analisar as vias desreguladas em cada modelo de peixes-zebra transgénicos e subgrupos de HCC humanas. Resumidamente, todo o transcriptoma foi classificada pela logaritmo transformado p-valor (base de 10). Os genes regulados positivamente foram atribuídos valores positivos, e os genes regulados para baixo e os valores negativos. Foram utilizadas as vias canônicas curadoria do MSigDB (Molecular Assinatura Banco de Dados). O número de permutação utilizado era 1000.

RT-qPCR Validação

O ARN total foram sujeitos a transcrição reversa utilizando o estojo de síntese de ADNc SuperScript II (Invitrogen). RT-qPCR foi realizado com os mesmos conjuntos de ADNc utilizadas para SAGE sequenciação utilizando o sistema de SYBR Green I Mestre 480 LightCycler (Roche). As reacções foram realizadas em triplicado para cada amostra de ADNc e as sequências de iniciadores são mostrados na Tabela S4. Os níveis de expressão de genes em cada controlo ou amostra de fígado transgénico foram normalizados com o nível de

β-actina

ARNm como o controlo interno. O log

2 mudanças vezes entre amostras de tumores e de controlo foram calculados utilizando o método CT acordo com a fórmula: log

2 vezes muda = -ΔΔCT = – [(gene CT de interesse-CT

β-actina

) transgênica sample- (gene CT de interesse-CT β-actina) amostra de controlo]. Bicaudal teste heteroscedástico t foi realizada utilizando valores CT normalizados (CT gene – CT β-actina) e alterações com p 0,05 são considerados significativos

Resultados

Identificação da diferencialmente expressos. genes nos modelos do cancro do fígado três transgênicos Zebrafish

as três linhagens transgênicas de oncogenes (

xmrk, Myc

e

kras

V12

) foram induzidos a desenvolver tumores hepáticos ( Figura S1) e estas amostras tumorais foram submetidos a sequenciação de ARN-SAGE. Por um critério de selecção da mudança dobra 1,5, p valor 0,05 e TPM 10 (em qualquer amostras de tumores de controlo ou), genes diferencialmente expressos foram selecionados a partir dos três conjuntos de tumor. Havia 2.892, 797 e 494 genes up-regulamentados e 169, 902 e 676 genes regulados negativamente no

xmrk Restaurant -,

kras viajantes – e

Myc viajantes – induzido cancro do fígado de peixe-zebra, respectivamente (Figura 1A, B). genes desregulados dos três modelos transgénicos mostraram relativamente pequenas sobreposições, indicando que os três oncogenes regulada conjuntos bastante distintas de genes. Isto é consistente com o relatório que morfologicamente uniforme tipo de cancro é frequentemente classificados em subgrupos diferentes com base nos seus padrões de expressão de genes diferentes [26]. Curiosamente, havia 21 regulada para cima e para baixo 16 genes regulados comumente encontrados em todos os três modelos de tumor (Figura 1A, B, Tabela 1).

(A) diagrama de Venn de genes regulados positivamente no três peixe-zebra modelos HCC transgênicos. (B) diagrama de Venn de genes regulados por baixo dos três modelos HCC transgênicos zebrafish. (C) vias desreguladas na três tumores hepáticos transgénicos oncogene. Para cima e para baixo as vias reguladas em cada modelo HCC transgênicos zebrafish foram analisados ​​por GSEA análise pré-classificado. Vermelhos e verdes indicam para cima e a sub-regulação, respectivamente, e o código de cores baseado em FDR está mostrado à esquerda. Pathways correlacionando com células cinzentas não foram detectados com qualquer alteração. Os caminhos-regulada foram distribuídos em sete categorias da indicação do cancro (excluindo permitindo a imortalidade replicativo) de acordo com Hanahan e Weinberg [27] e para baixo-reguladas vias foi classificada com base em diferentes aspectos do metabolismo do fígado (ver Tabela S1 para detalhes).

vias distintas regulamentados no tumor Models três Zebrafish fígado

análise Pathway usando GSEA mostrou que os três modelos transgênicos câncer de fígado têm diferentes percursos desregulamentado (Figura 1C, Tabela S5) . Tem sido amplamente aceito que há oito marcas câncer de tumorigênese de várias etapas e as complexidades das neoplasias [27], [28]. Descobrimos que as vias GSEA identificados caído em pelo menos sete marcas de câncer (exceto para permitir a imortalidade replicativo).

Xmrk

principalmente up-regulamentados caminhos envolvidos na evasão supressores de crescimento e evitar a destruição do sistema imunológico, que incluiu a activação do ciclo celular, promovendo a transcrição do RNA, up-regulação do proteassoma e alterando propriedades imunológicas.

Kras

desde que as células de tumor com a capacidade de sinais proliferativos auto-sustentáveis ​​por cima de regulação de EGFR, Raf-MEK-ERK, a PI3K-AKT-mTOR e GSK3 vias de sinalização. Especificamente, ele também alterou os caracteres adesivas focais de células tumorais que pode ativar a invasão e metástase.

Myc

principalmente regulada para cima e tradução proteólise para ajudar as células de tumor para escapar supressores de crescimento, e também sobre-regulada via VEGF, portanto, potencialmente induzir angiogénese. Enquanto não houve uma via única significativamente sobre-regulada em todos os três modelos de tumor, houve alguns caminhos-regulada em dois modelos, como o proteassoma no

xmrk

e

Myc

modelos, e via de IGF1, mTOR, tRNA biossíntese e adesão focal no

xmrk

e

KRAS

modelos. Em contraste, as vias em reprogramação do metabolismo energético eram geralmente regulada para baixo em todos os três modelos que o down-regulação no

Myc

modelo era menos evidente do que os outros dois modelos. Enquanto isso, muitas outras vias envolvidas na função hepática normal, tais como factores do sangue, metabolismo de aminoácidos, a desintoxicação e metabolismo xenobiótico, o metabolismo dos ácidos gordos, e a síntese de bílis foram uniformemente regulada para baixo em todas as três modelos de tumor. No entanto, uma exceção foi a regulação hormonal que era aparentemente sobre-regulada nos

KRAS

tumores.

Correlação dos Três Gene Assinaturas de Zebrafish fígado Tumores nos diversos estágios de HCCs Humanos

os genes regulados positivamente, 2.892, 797 e 494 do

xmrk

,

kras

e

Myc

tumores respectivamente, foram usados ​​como os genes assinatura para cada modelo. Estes genes regulados positivamente foram convertidos em 1,362, 490, e 146, respectivamente unigenes humano, a fim de comparar com os dados transcriptomic disponíveis a partir de estudos em seres humanos. Em seguida, compararam os conjuntos de genes de três da assinatura com um conjunto de dados de transcriptoma humano (GSE6764) de diferentes estágios de condições de fígado humano: fígado cirrótico, nódulos de baixo grau displásicas (LGDN), nódulos alto grau displásicas (HGDN), e muito cedo, mais cedo , avançado, e HCC muito avançada (veHCC, EHCC, AHCC e vaHCC), em que os estágios HCC patológicos foram definidos pelo tamanho do tumor, estado de diferenciação e nível de metástases [25]. Os três conjuntos de genes assinatura foram todos regulamentados, como a doença progride, mas eles começaram a ser regulado para cima em diferentes estágios de tumorigênese (Figura 2). O

xmrk

assinatura apresentou correlação positiva com HCCs a partir de EHCC, e foi significativamente correlacionada com AHCC e vaHCC. O

kras

assinatura positivamente correlacionada com a AHCC e vaHCC, e isso só foi significativamente correlacionada com vaHCC. O

Myc

assinatura apresentou correlação significativa positiva com HCCs a partir de EHCC, similar com o nosso resultado anterior utilizando um conjunto independente de dados de RNA-seq a partir da mesma linhagem transgênica [6]. Curiosamente, os comuns 21 genes regulados positivamente em todos os três modelos de tumor também mostrou aumento da regulação mesmo a partir da fase muito precoce do HCC, indicando estes genes estão correlacionados com todo o processo neoplásico.

O gene-regulada assinaturas dos três tumores transgênicos (xmrk, kras e Myc) e 21 comumente-regulada genes (comuns) foram utilizados para GSEA e Ness (pontuações de enriquecimento normalizada (eixo y) em função de diferentes estágios de HCCs humanos (eixo-x .) NES está listado na tabela e asterisco indicam significância estatística: FDR 0,25 Abreviaturas:. CL, fígados cirróticos; LGDN, nódulos de baixo grau displásicas; HGDN, nódulos displásicos de alto grau; veHCC, muito cedo HCC; EHCC, HCC precoce; AHCC, avançado HCC;. vaHCC, HCC muito avançado

Representação dos três Gene Assinaturas de zebrafish fígado tumores em amostras HCC Humanos

Tendo em conta as vias de distintivos alterados nos três fígado de peixe-zebra modelos de tumor e o alto nível de heterogeneidade em pacientes com CHC humanos, procurou-se analisar o grau de representação dos três modelos de câncer de fígado de peixe-zebra em amostras HCC humanos. Foram examinadas dez conjuntos de dados clínicos publicados HCC microarray, cada uma das quais incluídas pelo menos 80 amostras clínicas. Os dez conjuntos de dados contêm um total de 1.272 amostras que abrangem diferentes grupos étnicos e fatores de risco (Tabela S2). Descobrimos que o

xmrk

,

kras

e

Myc

assinaturas genéticas foram significativamente correlacionados com 30,8%, 24,8% e 25,6% de todas as amostras clínicas, respectivamente. 47,2% das amostras de carcinoma hepatocelular humano apresentou correlação com a pelo menos uma das três assinaturas de gene do peixe-zebra (Tabela 2, Figura S2). Em diferentes conjuntos de dados HCC humanos, os intervalos percentuais, passando de 22,0% para 60,4%. Além disso, algumas das amostras clínicas foram correlacionados com dois ou mesmo três assinaturas genéticas de peixe-zebra. Co-correlação de duas assinaturas de genes, ou seja,

xmrk

/

kras

,

kras

/

Myc

e

kras

/

Myc,

representaram 17,5%, 13,5% e 12,4% das amostras HCC humanos. 9,3% das amostras humanas mostraram co-correlação de todos os três assinaturas de gene. Assim, parece que os três modelos de tumores de fígado de peixe-zebra transgénicos representam mecanismos moleculares da hepatocarcinogênese em quase metade dos casos de carcinoma hepatocelular humanos e a outra metade do HCC humana pode ser devido a mecanismos moleculares diferentes.

ainda demonstrado que os subconjuntos de HCC humanas que mostraram significativamente correlação positiva com a mesma assinatura gene de vias-regulada semelhantes também partilhados (Figura 3, Tabela S6). Para esta análise, cada um dos conjuntos de HCC humanas foi separada em dois subgrupos: aqueles que mostra uma correlação significativa com as assinaturas de peixe-zebra, e o resto. genes diferencialmente expressos entre os dois grupos foram identificadas pelo teste t de duas caudas, e análises foram realizadas por via de análise GSEA pré-classificados. As vias foram submetidos a agrupamento hierárquico por valores FDR transformadas com logaritmo usando MeV [29], [30]. Como mostrado na Figura 3, as vias regulados diferencialmente em HCC humanas que demonstraram correlação significativa com uma das assinaturas de peixe-zebra teve padrões distintos. O agrupamento A é via consistiu de vias-regulada em todos os três sub-grupos, incluindo proteassoma, ARNt biossíntese e fosforilação oxidativa. Ribossoma, transcrição e tradução, e ciclo celular foram também altamente regulado para cima, o que sugere que as amostras de carcinoma hepatocelular humano significativamente correlacionados com qualquer uma das assinaturas de peixe-zebra foram, provavelmente, mais do que aqueles não proliferativa significativamente correlacionados. O cluster via B contém vias regulada na maioria dos subgrupos associados com

xmrk

mas up-regulada nos subgrupos associados com

kras

e

Myc

. Curiosamente, teses vias foram consistentes com percursos altamente regulada no

xmrk

induzida HCC peixe-zebra, incluindo o metabolismo de energia, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de ácidos graxos, a biossíntese dos ácidos biliares, via do complemento, biossíntese de esteróides, e biossíntese de N-glicano. O cluster via C é mais up-regulamentada em

kras

-associated subgrupos HCC, incluindo o metabolismo do glutamato e glicólise. Tem sido relatado que

Kras

poderia aumentar a conversão da glicose para o glutamato, e isto era essencial para

Kras

tumorigenicidade mediada por [31]. O cluster via D foi geralmente up-regulamentada no

xmrk viajantes – e

kras

-correlated HCC humana, mas mostrou um padrão diferente em

Myc

-correlated HCCs humanos . Este aglomerado continha muitos caminhos quinase que foram desregulados no

xmrk viajantes – e

kras

induzida por câncer de fígado de peixe-zebra, mas não alterou significativamente no

Myc

induzida fígado de peixe-zebra Câncer. O cluster via E foi bastante heterogêneo. O cluster via de F foi bem separado de todos os outros e que continha as vias que foram principalmente para baixo-regulados em todos os subgrupos HCC humanas associadas com as assinaturas de peixe-zebra, incluindo linhagem hematopoiética celular, via de citocina, a sinalização de cálcio, e GPCR via. Uma vez que a maioria destas vias sub-regulada estão envolvidas na resposta inflamatória, é provável que os subgrupos de HCC humanas não capturados pelos três modelos de peixe-zebra tem estado inflamatório mais grave.

As barras de cores representa o logaritmo-transformado valores FDR. -Regulada caminhos são dados valores positivos (vermelho) e as vias para baixo regulamentados valores negativos (verde). Vias correlacionando com células cinzentas não são detectados em análises da via. Pathways, quer com FDR = 1 ou não detectada em mais de cinco das 30 combinações são pré-excluídos da análise.

Os Genes Comumente cima e para baixo-regulados no peixe-zebra fígado tumores são também consistentemente cima e para baixo-regulado no HCC Humanos

Enquanto os três assinaturas genéticas representam aumento da regulação de vias distintas e se correlacionam com diferentes subgrupos de HCC humana, procurou-se investigar se a 21 comumente-regulada e 16 genes comumente regulados negativamente em todos os três modelos transgênicos seriam regulamentados de igual modo no HCC humanos. Entre os dez conjuntos de dados HCC humanos que usamos, nós fomos capazes de examinar dois conjuntos de dados que incluíam tanto HCCs e os seus tecidos não tumorais correspondentes (GSE14520 e GSE25097). No entanto, apenas GSE14520 poderia ser comparado com os dados de peixe-zebra como a maioria dos genes humanos homólogos aos genes comuns de peixe-zebra pode ser identificados a partir da plataforma de microarray utilizados: 19 dos 21 genes sobre-regulada (excepto

FOXA3 e

MRPS9

) e 12 dos 16 genes regulados negativamente (exceto para

cyp2ad2

,

slco1d1

,

TDH

e

Miox)

. GSE14520 conjunto de dados contém 229 HCC primários e os correspondentes não tumorais emparelhado tecidos hepáticos, [33] [32]. O

xmrk

,

kras

e

Myc

assinaturas foram significativamente correlacionados com 30,5%, 20,0% e 20,5% das amostras de CHC e, no total de 47,6% da HCC amostras mostrou significante sobre-regulação de, pelo menos, uma das assinaturas de cancro de fígado de peixe-zebra (Tabela 2). Entre os 19 genes sobre-regulada, dos quais 16 foram regulados positivamente em mais de metade dos doentes de HCC, e nove deles foram regulados positivamente em mais de 75% dos pacientes (Figura 4).

STMN1

foi regulado para cima em 96,9% dos HCCs humanos do conjunto de dados, que é a mais ubíqua-regulada.

STT3A

e

SRP14

foram regulados positivamente em 93,0% dos HCCs humanos. Entre os 12 genes regulada para baixo, dos quais 11 foram regulados negativamente em mais de metade dos pacientes de CHC.

FBP1

foi regulada em 96,9% dos HCCs humanos examinados. FBP1 é uma enzima reguladora gliconeogênese e funciona para antagonizar a glicólise no câncer gástrico [34].

FBP1

é regulada para baixo na maioria dos HCCs humanos por metilação [35]. Restauração da expressão FBP1 em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano inibiu o crescimento das células de forma significativa, o que sugere que pode funcionar como um supressor de tumores [35].

Foram identificados

19 dos genes supra-regulados e 12 dos genes regulados de deslocamento na plataforma de microarray. A cor vermelha indica aumento da regulação, ea cor verde indica a infra-regulação.

Finalmente, a expressão destes 19 para cima e 16 genes regulados negativamente também foi validado por RT-qPCR em todos três tipos diferentes de tumores. Como mostrado na Figura S3, a maior parte do gene na maioria dos testes (~ 90%) confirmou tendência consistente de alterações nas amostras de tumor.

Discussão

É bem conhecido que HCC humanas são altamente heterogênea; Assim, entre espécies estudos comparativos a nível transcriptomic deve ser valioso para identificar vias conservadas e críticos na carcinogênese em espécies de vertebrados. Aqui foi determinado em primeiro lugar vias desreguladas a partir de cada um dos peixes-zebra transgénicos modelo de oncogene. Embora os três modelos de tumor transgênicas tiveram caminhos biológicos desregulados bastante distintos, todos eles correlacionada com HCC avançados ou muito avançados, em comparação com as assinaturas genéticas de HCCs humanos. Além disso, também descobrimos que cada um dos zebrafish modelo representam um subconjunto de HCC humana. Uma vez que as nossas linhas transgénicas têm oncogenes bem definido caminhos de condução na carcinogénese, a informação a partir do peixe-zebra transgénico deve ser valioso para a compreensão dos mecanismos moleculares principais de cada subgrupo HCC, o que é imperativo para o desenvolvimento de terapias mais eficazes específicos para cada subgrupo. Curiosamente, os três modelos de peixes-zebra transgénicos oncogene significativamente representam apenas menos de metade do HCC humana e há uma necessidade de desenvolver mais e diferentes modelos animais transgénicos oncogene para cobrir HCC mais humanos para uma maior compreensão dos mecanismos moleculares distintos em hepatocarcinogenese, com foco vias inflamatórias.

no presente estudo, nós também identificou uma lista de genes comumente desregulados em tumores do fígado induzidas por diferentes sinais oncogênicos foi identificado e as suas alterações Expressional em amostras HCC humanos foram validados

in silico

(Tabela 1, Figura 4). Estes genes podem ser servido como potenciais alvos terapêuticos, uma vez que eram independentes das vias oncogénicos individuais. Os genes regulados positivamente inclui aqueles em proteínas tradução e processamento (

eif5a2

,

abce1

,

rrp9

,

srp14

,

itm1 <