chinesa
Abstract
Os microRNAs (miRNAs) foram relatados para desempenhar um papel-chave na oncogênese . variações genéticas em genes de processamento de miRNA e locais de ligação de miRNA pode afetar a biogênese dos miRNA e as interações miRNA-RNAm, portanto, promover a tumorigênese. No presente estudo, a hipótese de que os polimorfismos potencialmente funcionais em genes de processamento de miRNA pode contribuir para câncer de cabeça e pescoço susceptibilidade (HNC). Para testar esta hipótese, genotipados três SNPs em locais de miRNA processamento genes (rs1057035 ligação miRNA 3’UTR de
DICER
, rs3803012 no 3’UTR de
RAN Comprar e rs10773771 em 3 ‘ UTR do
hiwi
) com um estudo caso-controle, incluindo 397 casos HNC e 900 controles pareados por idade e sexo em chinês. Apesar de nenhum dos três SNPs estava significativamente associada com o risco global de HNC, rs1057035 no 3’UTR de
DICER
foi associado com uma diminuição significativa do risco de cancro oral (TC /CC vs. TT: OR ajustado = 0,65, IC95% = 0,46-0,92). Além disso, o ensaio de actividade de luciferase mostrou que o alelo variante rs1057035 C levou a níveis de expressão significativamente mais baixos em comparação com o alelo T, o que pode ser devido ao relativamente elevado de inibição HSA-miR-574-3p em
DICER
ARNm . Estes resultados indicaram que rs1057035 localizado na 3’UTR de
DICER
pode contribuir para o risco de câncer de boca, afetando a ligação de miRNAs a
DICER
. Em grande escala e bem concebida estudos são necessários para validar os nossos resultados
Citation:. Ma H, Yuan H, Yuan Z, Yu C, Wang R, Jiang Y, et al. (2012) variações genéticas em Key MicroRNA Processamento Genes e risco de câncer de cabeça e pescoço: estudo de caso-controle na população chinesa. PLoS ONE 7 (10): e47544. doi: 10.1371 /journal.pone.0047544
editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de maio de 2012; Aceito: 12 de setembro de 2012; Publicação: 11 de outubro de 2012
Direitos de autor: © Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por Priority Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (PAPD) e Jiangsu Natural Science Foundation (BK2011764). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de cabeça e pescoço (CCP), especialmente carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN), é a sexta neoplasia maligna mais comum em todo o mundo, sendo responsável por um número estimado de 650 000 novos casos de cancro e 350 000 mortes por câncer a cada anos [1], [2]. HNC inclui os cânceres que ocorrem nos seios paranasais, cavidade nasal, cavidade oral, faringe e laringe. Consumo de tabaco e de álcool têm sido identificadas como importantes prévias de HNC [1], [2]. Além disso, estudos também relatado que factores genéticos incluindo a história familiar e variantes genéticas em múltiplas vias biológicas foram implicados no desenvolvimento de [3] HNC. No entanto, o mecanismo exato de desenvolver HNC não foi totalmente explorado.
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de não-codificação, RNAs de cadeia simples de ± 22 nucleotídeos e atuam como reguladores de genes através da ligação a 3 “região -untranslated (UTR) dos transcritos codificadores de proteínas, por sua vez, provocando a degradação do RNA mensageiro ou a repressão de translação [4], [5]. Os estudos mostraram que miARNs estão envolvidos numa variedade de processos biológicos, incluindo regulação do ciclo celular, diferenciação, desenvolvimento, metabolismo e envelhecimento. Além disso, os miRNAs foram também ligada à etiologia, evolução e prognóstico do câncer, e perfis de expressão de miRNA pode identificar exclusivamente tipos de câncer [6], [7]. A biogénese de miARN é um processo complexo que envolve múltiplas proteínas e RNAs [8]. Em primeiro lugar, grandes precursores primários de miARN (pri-miARN) são transcritos principalmente pela ARN-polimerase II e clivagem de miARN precursor (pré-miARNs) pelo complexo microprocessador nuclear contendo o Drosha ARNase e a proteína de ligação a ARN de cadeia dupla DGCR8 [9] . Em seguida, o pré-miARN é translocado para o citoplasma, através da ajuda de Ran-GTPase e exportina-5 (XPO5), onde ele é posteriormente transformado por um complexo de proteínas, incluindo DICER, levando à produção de cadeia dupla duplex miARN. [ ,,,0],10]. Subsequentemente, uma mecha de miARN é incorporada complexo de silenciamento induzido por ARN (RISC), incluindo Hiwi, GEMIN3 e GEMIN4, que medeia a expressão de genes alvo. Evidências crescentes mostra que os componentes-chave na via biossintética de miARN desempenhar papéis importantes no desenvolvimento e prognóstico de cancros humanos, incluindo HNC [11], [12], [13].
Mais recentemente, foi relatado que a presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes microRNA, suas máquinas de processamento e locais de ligação alvo afeta a susceptibilidade ao câncer, modulando os níveis de miRNAs e interações miRNA-RNAm [14] expressão. Entre estes, alguns estudos têm-se centrado sobre o efeito de SNPs em sítios de ligação de miRNA (SNPs miRNA-vinculativo) de genes de processamento de miRNA e risco de câncer. Por exemplo, um estudo com 130 lesões orais pré-malignas (OPLS) casos e 136 controles descobriram que o alelo variante rs3742330 no 3’UTR de
DICER
aumentou significativamente o risco de passos ópticos nos americanos [15]. Dois outros estudos relataram que rs11077 em 3’UTR de
XPO5 Comprar e rs14035 em 3’UTR de
RAN
foram associados com o risco de câncer de esôfago [16] ou carcinoma de células renais [17]. No entanto, até à data, não há nenhum relatório sobre a relação entre as variações genéticas em genes biogênese miRNA e risco de HNC. Neste estudo, a hipótese de que SNPs potencialmente funcionais em 3’UTR de miRNA genes biogênese pode modificar o risco HNC na população chinesa. Para testar esta hipótese, foi realizada uma análise de genotipagem de três SNPs (rs1057035 no
DICER
, rs3803012 no
correu e rs10773771 em
hiwi
) com um estudo caso-controle de 397 casos de câncer de HNC e 900 controles saudáveis em Han chinês e avaliaram o seu individual e efeito conjunto sobre o risco de HNC. Para clarificar a importância funcional dos SNPs seleccionados com cancro HNC, também examinámos a actividade de luciferase de
DICER
rs1057035 (alelos C e T) pelo ensaio de clonagem e o gene repórter, a avaliação dos efeitos do SNP no ligação de miRNAs especiais à 3’UTR do
DICER
.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade médica de Nanjing. O desenho ea realização de estudo envolvendo seres humanos foram claramente descrito em um protocolo de pesquisa. Todos os participantes foram voluntários e iria completar o consentimento informado por escrito antes de participar nesta pesquisa.
População do estudo
Todos os pacientes HNC Recentemente e confirmação histológica foram consecutivamente recrutados a partir de Jiangsu estomatologista Hospital e do primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing, Nanjing, China, desde janeiro de 2009 a abril de 2011. os critérios de exclusão incluíram segundo tumor primário HNC ou metástase de câncer de outros órgãos. 420 casos foram inicialmente contactado para a participação e aproximadamente 95% dos casos elegíveis (397 casos) concordaram em participar do estudo. controles sem câncer de frequência combinado com os casos na idade (± 5 anos) e sexo foram selecionados aleatoriamente a partir de uma coorte de mais de 30.000 participantes de um programa de triagem baseada na comunidade para doenças não infecciosas na província de Jiangsu, China. Todos os participantes eram geneticamente não relacionados, étnica população Han chinês. Quando o consentimento informado por escrito foi obtido, de um questionário estruturado foi usado por entrevistadores treinados para recolher informações sobre dados demográficos e história exposição ambiental, tais como idade, sexo, tabagismo e consumo de bebida. Após entrevista, aproximadamente 5 ml da amostra de sangue venoso foi coletado de cada participante. Finalmente, um total de 397 casos e 900 controles completou a entrevista e doou a amostra de sangue.
selecção SNP e genotipagem
Oito genes-chave biogênese miRNA (
Drosha
,
DGCR8
,
XPO5
,
DICER
,
hiwi
,
GEMIN3
,
GEMIN4 Comprar e
RAN
) foram selecionados através de uma extensa pesquisa bibliográfica. Para cada gene, foi utilizada pela primeira vez o banco de dados do NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/construir 131) para procurar SNPs que localizada a 3 ‘UTR de genes e encontraram 17 SNPs com menor freqüência do alelo (MAF ) 0,05 na população chinesa. Em seguida, duas ferramentas de análise baseadas na web foram usadas para prever o efeito de 17 SNPs na ligação miRNA (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm; https://miracle.igib.res.in/dbSMR ) [18], [19] e apenas 4 SNPs com resultados consistentes em ambas as ferramentas foram permaneceu. Entre esses SNPs (rs11077, rs1057035, rs10773771 e rs3803012), rs11077 foi excluído porque acentua a busca pelo banco de dados miRBase (https://www.mirbase.org/search.shtml) mostrou que esta SNP não foi localizado na região de ligação para qualquer miARN. Como resultado, foram identificados 3 SNPs de ligação de miRNA em três genes (rs1057035 no
DICER
, rs3803012 no
correu e rs10773771 em
hiwi
). Entre aqueles, rs1057035 foi previsto para influência tem-miR-574-3p vinculativo, rs3803012 influenciar tem-miR-199-3p ligação e 10.773.771 influenciar tem-miR-1264 vinculativo
(*, P . 0,05; **, P . 0,001)
O ADN genómico foi isolado a partir de leucócitos de sangue venoso por digestão com proteinase K e extracção com fenol /clorofórmio. A genotipagem dos SNPs foi realizada utilizando TaqMan Ensaio discriminação alélica em um sistema ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A genotipagem foi realizada sem saber caso ou controle de status dos sujeitos, e dois controles negativos em cada formato de 384 poços foram usados para controle de qualidade. Os resultados de genotipagem foram determinados usando SDS 2,3 Allelic Discriminação Software (Applied Biosystems). A concordância alcançado 100% para as duplicatas de 5% das amostras para cada SNP. Ensaio
repórter luciferase para determinar o efeito de vincular miRNA na expressão DICER
A região 3’UTR de
DICER
contendo os rs1057035 local de reconhecimento putativas foi amplificado a partir do ADN da amostra, em seguida, clonado no PMIR-RELATÓRIO
TM (Applied Biosystems) com vector de digestões com Mlu I e Hind III. Os iniciadores foram: GTAGACGCGTTCAACAGCAAACTTCAGCC (sentido) e TCCAAAGCTTGGCAGGGTATCAGAATCTTT (anti-sentido). Os plasmídeos contendo as diferentes alelos de rs1057035 foram geradas utilizando a mutagénese específica do local. Todas as construções utilizadas neste estudo foram mapas de restrição e sequenciado para confirmar a sua autenticidade.
TCA-8113 (uma linha celular humana oral, carcinoma de células escamosas) [20], 293T (uma linha de células de rim embrionário humano) e Hela As células (a linhagem celular de carcinoma cervical humano) foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco Eagle com alto teor de glucose (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Gibco) e 50 ug /ml de estreptomicina (Gibco) a uma 37 ° C incubadora suplementado com 5% de CO2. As células foram semeadas a 1 x 10
5 células por poço em placas de 24 poços (BD Biosciences, Bedford, MA). Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células foram transfectadas por Lipofectamina 2000 de acordo com a sugestão do fabricante (Invitrogen). O
DICER
plasmídeos de luciferase 3’UTR (alelos diferentes) e quimicamente sintetizada hsa-miR-574-3p maduro foram cotransfectadas respectivamente. O plasmídeo pRL-SV40 (Promega) foi co-transfectado como um controlo de normalização. Seis réplicas para cada grupo, e a experiência repetida pelo menos três vezes. Após 24 horas de incubação, as células foram recolhidas e analisadas quanto à actividade de luciferase com o Reporter Assay Sistema Dual-Luciferase (Promega).
A análise estatística
O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado por um bem -de-fit χ
2 teste para comparar as freqüências genotípicas observadas com os esperados entre os indivíduos do grupo controle. Distribuições de variáveis selecionadas demográficos, fatores de risco e as frequências de genótipos variantes entre os casos e os controles foram avaliados usando o χ
2 de teste. As associações de genótipos variantes com risco HNC foram estimadas calculando odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) de ambas as análises de regressão logística uni e multivariada. A heterogeneidade entre os subgrupos foi avaliada com o teste Q baseado em qui-quadrado ea heterogeneidade foi considerado significativo quando
P Art 0,05. As possíveis interacções gene-gene e gene-ambiente (ou seja, tabagismo e estado de beber) foram avaliadas pelos modelos de regressão logística. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software de Statistical Analysis System (SAS Institute V.9.1, Cary, NC). Dois lados testes foram geralmente utilizado para análise estatística e
P
. 0,05 foi considerado como o nível de significância estatística
Resultados
As características selecionadas dos casos e os controles são apresentados na Tabela 1. Não houve diferenças significativas nas distribuições de idade, sexo e tabagismo entre os casos e os controles (
P
= 0,637, 0,263 e 0,580, respectivamente), ea média de idade foi semelhante (59,98 ± 11,94 anos para os casos e 60,65 ± 7,99 anos para os controles). Tal como esperado, mais bebedores foram observadas no grupo de casos em comparação com o que no grupo de controlo (45,1% vs 32,2%,
P
0,001). Do total de 397 casos, 293 (73,8%) eram com o tumor da cavidade oral, 6 (1,5%) com orofaringe, 86 (22,2%) com a laringe e 10 (2,5%) com os outros. Além disso, 335 casos (84,4%) apresentaram com carcinoma de células escamosas.
SNPs estavam em Hardy-Weinberg (
P
= 0,14 para rs1057035 e
P
= 0,73 para rs3803012, respectivamente), exceto rs10773771 (
P
= 0,01). As distribuições genotípicas e alélicas de
DICER
rs1057035,
hiwi
rs10773771 e
RAN
rs3803012 em casos e controles são apresentados na Tabela 2. O único locus análises revelaram que as distribuições genotípicas destes três polimorfismos não foram significativamente diferentes entre os casos e controles globais (
P
= 0,080 para rs1057035,
P
= 0,397 para rs3803012 e
P
= 0,539 para rs10773771, respectivamente). Para investigar mais profundamente os efeitos modificadores de três variantes de risco de HNC com diferentes locais do tumor, foi realizada a análise de estratificação por cavidade bucal e câncer de cavidade não-orais. Como mostrado na Tabela 2, genótipos variantes rs1057035 foram associados a uma redução significativa do risco de cancro oral (TC vs. TT: OR ajustado = 0,65, 95% CI = 0,46-0,93, ajustado
P
= 0,019; TC /CC vs. TT: OR ajustado = 0,65, 95% CI = 0,46-0,92, ajustado
P
= 0,016; aditivo modelo: OR ajustado = 0,67, 95% CI = 0,48-0,93; ajustado
P
= 0,018). foi observada nenhuma das associações significativas entre os genótipos de dois outros SNPs (rs3803012 A G, rs10773771 G A). eo risco de HNC com locais diferentes (Tabela 2)
Realizou-se ainda mais a análise da estratificação na associações entre rs1057035 e risco de câncer oral, por idade, sexo, tabagismo, etilismo e histologia. Como mostrado na Figura 1, a diminuição do risco de câncer oral relacionado com a variante TC genótipos /CC foi significativa entre os mais jovens (OR ajustado = 0,61; IC95% = 0,38-0,97), do sexo feminino (OR ajustado = 0,53; 95% CI = 0,30-0,95), não-fumantes (OR ajustado = 0,50; 95% CI = 0.30-0.83) e não-bebedores (OR ajustado = 0,54; IC95% = 0,33-0,89), em comparação com o genótipo TT. No entanto, o teste heterogeneidade mostrou que não havia uma heterogeneidade significativa (
P
0,05) em cada dois estratos. Também avaliamos o efeito da adição de álcool, tabagismo e gênero na RUP e descobriu que estes houve diferenças se estas variáveis foram incluídas nos modelos ou não incluído (Tabela S1). Além disso, não foram observadas resultados significativos para o gene-gene ou gene-ambiente (ou seja, tabagismo e estado de álcool) interações (dados não mostrados).
Porque rs1057035 mostrou associação significativa com o risco de câncer oral e foi previsto para localizar no local de ligação putativo miARN (HSA-miR-574-3p), é interessante testar se rs1057035 influencia o direccionamento do conjugado de HSA-miR-574-3p
DICER
ARNm in vitro. Assim, geramos genes repórter da
DICER
3’UTR (C ou alelo T) que foram cotransfectadas com sintetizados quimicamente hsa-miR-574-3p madura em linhas celulares Tca8113 carcinoma de células escamosas. Como mostrado na Figura 2, a co-transfecção de HSA-miR-574-3p inibiu significativamente a expressão do repórter transportando alelo rs1057035 C, mas não o alelo T (linha celular 293T: 0,057 ± 0,002 para o alelo C contra 0,333 ± 0,089 para o alelo T ,
P
= 0,032; linha de células Hela: 0,041 ± 0,007 para o alelo C contra 0,357 ± 0,257 para o alelo T,
P
= 0,030; linha de células Tca8113: 0,072 ± 0,067 para o alelo C contra 0,833 ± 0,120 para o alelo T,
P
0,001). Os resultados sugerem que o alelo variante rs1057035 poderia afetar diferencialmente a segmentação de hsa-miR-574-3p para 3’UTR de
DICER
em células de câncer bucal.
Discussão
neste estudo de 397 pacientes HNC e 900 controles sem câncer em uma população chinesa de caso-controle, que investigou as associações entre três SNPs em 3’UTR de miRNA genes da biossíntese e risco de HNC. Embora nós não encontrou evidências para um efeito principal de cada SNP em risco global HNC, a análise de subgrupo de HNC mostrou que os genótipos variantes de rs1057035 foram associados com o risco de HNC decorrente de cavidade oral. análises funcionais adicionais mostraram que o alelo rs1057035 C levou a actividade da luciferase significativamente menor, em comparação com o alelo T. Estes resultados sugerem, pela primeira vez, que os polimorfismos potencialmente funcionais de
DICER
pode desempenhar um papel no desenvolvimento de HNC, particularmente daqueles tumores que surgem na cavidade oral.
DICER é uma enzima responsável pela clivagem dos precursores de miARN e anteriormente tem sido implicado no processo oncogénico dos vários tipos de cancro [21], [22], [23]. A evidência indica que
DICER
podem ter diferentes papéis na tumorigênese de diferentes tipos de câncer. Por exemplo, alguns estudos mostraram que os níveis mais baixos de
DICER
expressão de ARNm foram associados com o desenvolvimento de cancro do pulmão [24] e o prognóstico de cancro do ovário [11]. No entanto, os estudos também demonstraram que os níveis de expressão elevada
DICER
foram correlacionados com aumento da proliferação celular de células de cancro oral [12]. Em nosso estudo, descobrimos que alelo variante rs1057035 C levou à significativamente mais baixos níveis de
DICER
expressão e exibiu um efeito protetor na susceptibilidade câncer bucal, que foram consistentes com os resultados em células de cancro oral [12]. Além disso, descobrimos que o efeito protetor de genótipos variantes rs1057035 foi estatisticamente significativa em alguns subgrupos, tais como mulheres, não-fumantes e não-bebedores. No entanto, teste de heterogeneidade não mostrou heterogeneidade significativa (P
Restaurant 0,05). Entre cada dois estratos, o que implica que não houve modificação do efeito de risco por estas variáveis sob investigação
A significativa SNP (rs1057035 ) identificado no nosso estudo está localizado na 3 ‘UTR de
DICER
e previsto para afectar a ligação do conjugado de HSA-miR-574-3p. HSA-miR-574-3p é evolutivamente conservada ao nível dos nucleótidos a partir de moscas para os seres humanos. Embora a função de HSA-miR-574-3p não é clara, prevê-se para atingir várias centenas de genes humanos [25]. Nossos resultados indicam que o
DICER
alelo rs1057035 C pode afetar o direcionamento de hsa-miR-574-3p e resultam na diminuição da expressão de
DICER
mRNA em células de câncer bucal, que pode ser um possível mecanismo subjacente para a associação observada entre rs1057035 e a diminuição do risco de câncer oral. No entanto, não encontramos nenhuma associação entre rs1057035 e risco global de cancro HNC ou risco de câncer não-oral em nosso estudo. A patogênese do câncer bucal pode ser um pouco diferente de outros tipos de câncer que se colocam à cabeça e pescoço. Por exemplo, epidemiológico recente e estudos moleculares identificaram tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV) como o potencial fator etiológico para HNC, mas é mais proeminente no câncer de orofaringe do que no câncer de cavidade oral [3], [26 ].
Além disso, nós também não encontraram associações significativas entre SNPs no 3’UTR de
RAN
e
hiwi
e risco de HNC. RAN é um único membro da superfamília Ras de GTPases, que é essencial para o transporte de pré-miARNs do núcleo para o citoplasma por meio do complexo do poro nuclear, de um modo dependente de GTP-[27]. Hiwi é uma parte do ARN de silenciamento induzido por Complexo (RISC) e um regulador chave da pluripotência de células estaminais através do controlo celular auto-renovação e diferenciação [28]. Alguns estudos investigaram as associações entre os polimorfismos destes dois genes e risco de vários tipos de câncer, como câncer de esôfago, câncer de bexiga e carcinoma de células renais, mas os resultados foram inconsistentes [15], [16], [17], [29] . Em nosso estudo, primeiro descobriu que
RAN
rs3803012 e
hiwi
rs10773771 genótipos variantes não foram associados com risco de HNC, sugerindo que estes SNPs podem não modular a suscetibilidade de HNC na população chinesa.
Vários potenciais limitações do presente estudo considerações mandado. Primeiro de tudo, um relativamente pequeno tamanho da amostra pode limitar o poder estatístico do nosso estudo, especialmente na análise de estratificação por locais de tumor. Avaliou-se o poder estatístico para o efeito de rs1057035 pelo software PS (Potência e da Amostra Tamanho Cálculos versão 1.0.17) e descobriram que, no caso do OR = 0,65 (modelo dominante), a nossa amostra pode chegar a 78,8% da estatística eficácia. Em segundo lugar, é um estudo de caso-controle de base hospitalar e viés de seleção inerente não pode ser completamente excluída. No entanto, foi aplicado um desenho epidemiológico rigoroso na seleção de temas de estudo e usado posteriormente ajuste estatístico para fatores de risco conhecidos para minimizar potenciais vieses. Em terceiro lugar, uma vez que a intensidade e duração do hábito de fumar e beber estavam ausentes neste estudo, foi difícil fazer uma análise futura para essas variáveis de exposição. Última, nós só selecionados SNPs de ligação de miRNA para genotipagem e não podia avaliar a relação entre outros SNPs potencialmente funcionais em genes de processamento de miRNA e risco de HNC. estudos epidemiológicos Assim, maior, bem desenhados com populações etnicamente diversas são necessários para confirmar e expandir os nossos achados.
Informações de Apoio
Tabela S1.
A análise para o efeito de variáveis em RUP nos modelos. NOTA:
o teste da razão de verossimilhança foi utilizado para verificar a diferença entre -2 * log Probabilidade de os dois modelos.
b Em comparação com o primeiro modelo, incluindo idade, sexo, fumar e beber
doi:. 10.1371 /journal.pone.0047544.s001
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