Sumário

tráfico Lisossomo desempenha um papel significativo na invasão do tumor, um evento chave para o desenvolvimento de metástases. Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram que o movimento anterógrada (para fora) de lisossomas para a superfície celular em resposta a certos estímulos microambiente do tumor, tal como o factor de crescimento de hepatócitos (HGF), ou pH extracelular ácida (Phe), aumenta a secreção de catepsina B e de tumores invasão celular. Anterógrada tráfico lisossoma depende da actividade do permutador sódio-protões e pode ser revertida bloqueando bombas com troglitazona ou EIPA estes iões. Uma vez que estas drogas não pode ser avançada para a clínica devido à toxicidade, concebemos um ensaio de elevado conteúdo para descobrir fármacos que bloqueiam o tráfico lisossoma periférica com o objectivo de identificar novas drogas que inibem a invasão de células tumorais. Um sistema de processamento de imagem de alto teor automatizado (Cellomics) foi usado para medir a posição dos lisossomos relação ao núcleo. Entre um total de 2210 drogas produtos realocada e naturais selecionados, foram identificados 18 “hits”. Um dos compostos identificados como um inibidor de tráfico lisossoma anterógrada foi niclosamida, uma droga anti-helmíntico humano comercializado. Estudos adicionais revelaram que niclosamide bloqueada ácida Fen, HGF, e fator de crescimento epidérmico (EGF) induzida por redistribuição anterógrada lisossoma, a secreção de protease, motilidade e invasão de DU145 castrar células cancerosas da próstata resistentes em concentrações clinicamente relevantes. Num esforço para identificar o mecanismo pelo qual impedido o movimento de lisossomas niclosamida anterógrada, verificou-se que esta droga exibiu nenhum efeito significativo sobre o nível de ATP, os filamentos de actina ou os microtúbulos, e teve um efeito mínimo sobre a PI3K e MAPK. Niclosamida colapso pH intralisossomal sem ruptura da membrana de lisossomas, enquanto bafilomicina, um agente que danifica acidificação lisossoma, também foi encontrada para induzir JLA no nosso modelo. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que promove a agregação niclosamida lisossoma juxtanuclear (JLA) através da modulação de vias envolvidas na acidificação lisossoma. Em conclusão, nós projetamos um ensaio de alto conteúdo reproduzível validado para triagem de drogas que inibem o tráfico lisossoma e reduzir a invasão tumoral e resumimos a ação de uma dessas drogas

Citation:. Circu ML, Dykes SS, Carroll J, Kelly K, F Galiano, Greer A, et al. (2016) A tela com base-Imaging Content alta Novel Identifica o Anti-Helminthic Niclosamide como um inibidor da Lisossomo Anterógrada Tráfico e celular do cancro da próstata Invasion. PLoS ONE 11 (1): e0146931. doi: 10.1371 /journal.pone.0146931

editor: Sidney Yu, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 de julho de 2015; Aceito: 23 de dezembro de 2015; Publicação: 19 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Circu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:. Esta pesquisa foi financiada, em parte, pela doação da Pfizer, eo financiamento do Cancer Center Feist-Weiller. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declaram não haver conflitos de interesse

Abreviaturas: ( EGF), factor de crescimento epidérmico; (HGF), fator de crescimento de hepatócitos; (Phe), a pH extracelular; (JLA), Juxtanuclear agregação lisossoma; (LMP), permeabilização da membrana lisossoma; (ECM), matriz extracelular; (RILP), Rab interagindo proteína lisossómica; (Tro), troglitazona; (EIPA), 5- (N-etil-N-isopropil) -amiloride; (LAMP1), lisossoma associada à membrana da proteína-1; (MAPK), mitógeno proteína quinase ativada

Introdução

Os lisossomos são organelas intracelulares multifuncionais contendo enzimas hidrolíticas que degradam macromoléculas e componentes celulares [1]. Lisossomos foram classicamente pensado para única função em relação à limpeza celular, mas evidências recentes sugerem que essas organelas também contribuir para a patologia de muitas doenças clinicamente relevantes, incluindo tumores malignos. Lisossomos estão envolvidos na tumorigênese através de vários mecanismos, incluindo a autofagia desregulado, o tráfico lisossômico aberrante e exocitose, e aumento da permeabilização da membrana lisossoma (LMP) [2,3]. Devido à grande variedade de funções mediadas pelo lisossoma, que desempenham um papel na sobrevivência do tumor, lisossomas recentemente têm vindo a ganhar a atenção como um alvo atractivo para a terapêutica do cancro.

formação de colónias metastáticas que resultam a partir de um tumor primário invasivo é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Infelizmente, não existem medicamentos disponíveis que inibem este processo. Portanto, o aumento da compreensão da invasão é urgentemente necessário, a fim de desenvolver terapias eficazes para prevenir a progressão do tumor. Os nossos estudos anteriores demonstram que o tráfico lisossoma desempenha um papel importante na regulação da invasão de células de cancro, em que as células tumorais com lisossomos localizados perto da membrana plasmática secretam mais proteases e são mais invasiva do que células com lisossomas agrupados na região perinuclear [4-7]. Em particular, demonstrámos que várias características comuns do microambiente do tumor sólido, o factor de crescimento hepático (HGF), e ácido extracelular (Phe) gatilho lisossoma o movimento para fora, acompanhados pelo aumento da secreção de catepsina B e a invasão de células tumorais.

Com efeito, a catepsina B é uma protease de cisteína lisossómica que desempenha um papel no turnover de proteína dentro dos lisossomos [8]. Em células malignas, a expressão de catepsina B é altamente regulado para cima em comparação com o tecido normal, e a enzima pode ser encontrado dentro de actina ricos saliências invasivos invadopodia denominado [9,10]. A evidência apoia a noção de que as proteases lisossomais, incluindo a catepsina B, são secretadas para o meio extracelular, em que estas proteases participam na degradação da matriz extracelular (ECM), um evento necessário na invasão de células de cancro [9,10].

Os lisossomos movimento ao longo dos microtúbulos e filamentos de actina via associação com motor proteínas moleculares, incluindo dyneins, kinesin e miosina [11-13]. Além disso, vários GTPases RhoA incluindo, RAB7 proporcionou, e Rab27 recrutar proteínas do motor a lisossomos, proporcionando assim uma regulamentação estrita da motilidade lisossoma em toda a célula [14-16]. Notavelmente, o movimento dirigido minus-end dos lisossomos ao longo dos microtúbulos é dependente RAB7 proporcionou e Rab interagindo proteína lisossômico (RILP), que recrutar motores de dineína para lisossomos e promove transporte retrógrado [12]. A este respeito, inibição tráfico lisossoma anterógrada por sobre-expressão de resultados RILP em níveis reduzidos de invasão secretada catepsina B e de células de tumor [4]. Curiosamente, troglitazona (Tro) e 5- (N-etil-N-isopropil) -amiloride (EIPA), inibidores de permutadores de protões de sódio, promover o tráfico retrógrada de lisossomas periféricas em células de cancro da próstata, resultando na secreção reduzida de protease e a invasão de células de tumor [ ,,,0],4]. EIPA e Tro mediada por agregação lisossoma juxtanuclear (JLA) é RAB7 proporcionou /RILP dependente.

Outro fator que pode contribuir para o tráfico lisossoma é o tipo vacuolar da bomba de protões-ATPase (V-ATPase). Este grande complexo enzimático transforma a energia da hidrólise do ATP para o movimento de prótons através da membrana lisossomal. Além de gerar lisossomal acidificação, V-ATPase também está implicado em outras funções celulares, incluindo o tráfico vesicular. Com efeito, o C-subunidade tem sido mostrado para interagir com ARF6, uma pequena GTPase que dirige o tráfico de membrana e dinâmica do citoesqueleto [17]. Em osteoclastos, ATP6AP1 (uma subunidade da V-ATPase também conhecido como AC45) interage com a pequena GTPase RAB7 proporcionou, que regula o tráfico vesicular [18]. A isoforma A-subunidade também está acreditado para ser crucial para o tráfico vesicular [19].

Como inibidores previamente caracterizados de tráfico lisossoma anterógrada, como Tro e EIPA não pode ser avançado para a arena clínica [20], nós procurou identificar novos reaproveitado e de produtos naturais compostos adicionais muitos dos quais já estão em uso clínico para indicações não-cancerosas. Nosso objetivo foi identificar novos inibidores de tráfico lisossoma anterógrada com um bom perfil de segurança. Isto representa uma nova abordagem na pesquisa do câncer translacional que poderiam descobrir novos anti-invasão eficaz e drogas anti-metastáticos.

Neste artigo, apresentamos os resultados de uma tela de 4 bibliotecas de compostos, alguns dos quais já são comercializados para indicações não-cancerosas, utilizando uma abordagem de alto teor romance combinando microscopia de fluorescência e análise de imagem multi-parâmetro. Foram identificados vários medicamentos que inibem o tráfico lisossoma anterógrada, incluindo niclosamide. Niclosamide (C13H8Cl2N2O4, MW 327) é um agente anti-helmíntico oral, aprovado pela FDA, amplamente disponíveis fora os EUA para o tratamento de vermes intestinais. É barato, em geral, bem tolerada e associada com alguns efeitos secundários [21]. Niclosamida exerce o seu efeito tóxico contra helmintos por desacoplamento da fosforilação oxidativa [22,23] e recentemente foi demonstrado possuir um efeito promissora contra o cancro. Neste relatório, nós investigamos o mecanismo de niclosamide de ação e efeito na secreção lisossomos protease, motilidade célula cancerosa e invasão.

Material e Métodos

As linhas celulares e cultura

A A linha de células de cancro da próstata humano DU145 e glioma linha celular A172 humano foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). células DU145 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Mediatech, Corning, NY) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. linhas de células de glioma A172 foram mantidas em Dulbeco Meio de Eagle Modificado (DMEM) (Mediatech) suplementado com 10% de FBS. Ambas as linhas celulares foram mantidas numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 e foram passadas ao atingir mais de 75% de confluência. Tamponada RPMI-1640 foi preparado a partir de pó de RPMI-1640 suplementado com 10 mM de NaHCO

3 e 20 mM de NaCl e ajustada à FE 6.4.

tela Alto teor de inibidores de periférica lisossoma tráfico

DU145 As células foram semeadas em placas de 96 poços a 4500 células por poço. RPMI tamponado meios tituladas a pH de 6,4-6,8 foi adicionado à coluna 12, depois o meio foi removido e serve como controlo negativo. Os compostos a serem rastreadas foram adicionados à coluna de 2-11 após a diluição em meios de baixa de pH tamponado a uma concentração final de 5uM. Os 4 bibliotecas de compostos incluídos na tela atual incluem a recolha NIH Clínica (450 drogas), Prestwick (1200 drogas), fitoquímica (320 drogas) e GreenPharma (240 drogas). 25 uM EIPA serviu como um controlo positivo. Após uma incubação de 16 horas, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% frio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 20 minutos. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, lisossomas foram coradas por incubação com o H4A3 LAMP-1 de anticorpo diluído a 1: 200 em 0,25% de BSA e 0,1% de saponina em PBS (BSP) durante 1 hora. As células foram então lavadas com PBS 3 vezes e incubadas durante 1 hora com DyLight de burro anti-rato diluído a 1: 200 em BSP. As células foram então lavadas com PBS 3 vezes e incubadas durante 20 minutos com DAPI (Sigma-Aldrich) diluído a 1: 1000 em PBS. DAPI foi lavado com PBS e as células foram mantidas em PBS, durante a duração do processo de triagem. As placas foram montado e lido em um Cellomics Arrayscan (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) imager de fluorescência automatizado (Fig 1A). As células foram fotografadas usando objetiva de 20x em 2 canais fluorescentes. Um total de 15 campos diferentes em cada cavidade, e um máximo de 300 células foram fotografadas por poço. O algoritmo de análise de biocompartmental foi usada para identificar cada célula por seu núcleo e a aplicação de uma máscara citoplasmático (anel) e calcular o número de lisossomas dentro do anel. O anel era de 12 pixels de largura, e a sua borda interior foi de 6 pixels de distância a partir do núcleo. O número médio de lisossomas dentro da região do anel designado foi adquirida como “significa ponto anel canal de contagem 3”, que representa a distribuição de lisossomas em relação ao núcleo. Quando lisossomas afastar-se do núcleo e se dispersam por todo o citoplasma, o número de pontos que representam os lisossomas dentro citoplasmáticos aumentos máscara. Em contraste, os lisossomas aglomerado perto do núcleo os números de local no interior das diminuições anel citoplasmáticos (Fig 1B). fator de ensaio a Z “foi determinada a partir da EIPA (controlo positivo) e a pH baixo (controlo negativo) [24]. As experiências foram realizadas em duplicado. Somente placas com fator Z positivo ‘foram utilizados para análise.

(A) A metodologia da abordagem triagem de alto conteúdo baseado Cellomics. (B) coloração DAPI é utilizado pela plataforma Cellomics de imagem para identificar as células individuais. Uma máscara virtual é tirada pela máquina (apresentada por um anel verde) com uma largura predeterminada e distância do núcleo. O número de lisossomas dentro da máscara é calculada pela máquina (representado pela mancha de cor púrpura no interior do anel). Por tratamento de células com ácido pHe, lisossomas mover para fora e o número de manchas no interior do anel aumenta. Ao inibir o movimento de lisossomas, o número de pontos em torno do núcleo aumenta, enquanto que o número de pontos dentro das diminuições máscara anel. Esta propriedade foi utilizada para calcular a distribuição lisossoma relativa. (C) O efeito funcional para cada composto em relação ao controlo foi calculada utilizando “percentagem normalizada de inibição” (NPI). significância estatística entre os compostos e o controlo negativo foi medida pelo escore Z. Um gráfico de dispersão representando o NPI (eixo X) eo escore Z (eixo Y) de cada composto é desenhado. As drogas que produzem uma pontuação NPI de mais de 50% e uma pontuação Z de menos de -4 (quadrante inferior direito, como indicado pela seta vermelha) foram designados como compostos ‘hit’.

Reagentes e anticorpos

LY294002, U0126, bafilomicina a e nocodazol foram adquiridos a partir de Calbiochem (San Diego, CA) e foram usadas a 10 uM, 10 uM, 100 nM e 10 uM, respectivamente. Faloidina 1: 200 foi comprada na Life Technologies (Grand Island, NY). O anticorpo α-tubulina, 1: 1000, foi adquirido a partir de Neomarkers (Fremont, CA). anticorpo LAMP1 (H4A3), 1: 200, foi adquirido a partir dos estudos de desenvolvimento Hibridoma banco na Universidade de Iowa. DyLight 594 ou FITC, de burro anti-murganho ou anti-coelho foram adquiridos a Jackson Immunoresearch (West Grove, PA). pAKT PMET e foram utilizados a 1/1000 e comprado de Cell Signaling (Beverly, MA). EIPA (25 uM), citocalasina D (1 uM), anticorpo RAB7 proporcionou (1: 1000), e cloroquina (50 uM) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Secundário anti-coelho conjugado com HRP e anti-rato foram adquiridos a partir de GE Healthcare (Pittsburgh, PA).

Imunofluorescência

As células foram semeadas a 50-70% de confluência em lamelas de vidro. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 20 minutos. As células foram então lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo primário (1: 200 diluído em BSP) durante uma hora. As células foram em seguida lavadas outra vez com PBS antes da incubação com anticorpo secundário conjugado com fluorescência (1: 200 diluído em BSP) durante uma hora. Para a coloração de actina, as células foram incubadas com faloidina diluído a 1: 200 em BSP durante 20 minutos. As lâminas foram montadas utilizando o reagente Slowfade Anti-Fade ouro com DAPI (Life Technologies, Grand Island, NY). As imagens foram adquiridas utilizando um Olympus UPlanFL 40X /0,75 objectiva e um microscópio Olympus BX50 com software Metamorph. As imagens foram fundidas usando software ImageJ. Para imagens confocal, foram utilizados a /1,4-0,6 objectivo de petróleo Plano HCX Apo 63X no microscópio SP5 Leica TCS e software Leica LAS AF.

acridina laranja coloração

As células cultivadas em lamelas de vidro foram carregados com 10 ug /mL de acridina laranja (Sigma Aldrich) durante 20 minutos a 37 ° C e depois lavadas com PBS. Após uma incubação de um dia para o outro com diferentes compostos, as células foram fixadas com PFA a 4% frio durante 20 minutos e, em seguida, as lâminas foram montadas com Slowfade Anti-Fade ouro Reagente com DAPI, antes da visualização por microscopia de imunofluorescência.

ensaio de proliferação

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a 4500 células por poço e cultivadas durante 16 horas. Os números de células viáveis ​​em poços em triplicado foram determinados após CellTiter-Azul

® (Promega, Madison, WI) de reagente foi adicionada a cada poço a 1/5 proporção em volume, de acordo com o protocolo do fabricante. A placa foi incubada a 37 graus durante 1 hora, e, em seguida, montado sobre leitor fluorescente, em que a fluorescência em determinado ponto do tempo é registada a 560 de excitação /emissão 590.

ATP ensaio

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a 4500 células por poço e cultivadas durante 16 horas. CellTiter-Glo

® reagente (Promega, Madison, WI) foi adicionado a cada poço de acordo com o protocolo do fabricante e a placa montada num leitor de luminescência. A quantidade de luminescência de cada poço é proporcional à quantidade de ATP.

Western Blot

lisados ​​celulares totais foram recolhidas em tampão de Laemmli a ferver (0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,13 mM de azul de bromofenol, 1 M de sacarose) misturado com beta-mercaptoetanol (a uma razão de 50: 1). Os lisados ​​foram corridos num gel de poliacrilamida a 10%, transferidas para PVDF (Millipore, Billerica, MA), bloqueadas em leite a 10% em TBST (20 mM Tris, 137 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 7,5) e sondadas com anticorpos apropriados durante 16 horas. As membranas foram depois incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1: 5000) durante uma hora antes de desenvolver utilizando ECL Plus (Pierce, Waltham, MA). filme Kodak XAR BioMax foi utilizado para a detecção de quimioluminescência.

catepsina B de ensaio

Este ensaio foi realizado como anteriormente descrito [7]. Resumidamente, as células foram plaqueadas a 80% de confluência, momento em que meio completo foi substituído por meio isento de soro e as condições indicadas. Após a incubação, o meio foi removido e os restos celulares foram recolhidos por centrifugação breve. O meio foi, em seguida, concentrou-se por meio de dispositivos de concentração Amicon filtração 10000 Dalton (Millipore). As amostras foram, em seguida, titulada para pH 5,0-5,5 e a catepsina B activo foi então detectado através de um ensaio de actividade de catepsina B fluorogénico (Calbiochem, San Diego, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Simultaneamente, os lisados ​​celulares foram extraídos com tampão RIPA a 4 graus. A concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de Pierce BCA colorimétrico (Thermo Fisher Scientific). atividade catepsina B foi normalizada para nível de proteína celular total pelo cálculo da actividade rácio catepsina B sobre o nível de proteína em cada condição.

entrega de Lentivirus shRNA de

shRNA voltada para RAB7 proporcionou (CCGGGCCACAATAGGAGCT GACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) foi entregue em células de câncer de próstata DU145 usando Missão

™ transdução Lentivirus Partículas (Sigma-Aldrich) de acordo com o protocolo do fabricante e, como previamente descrito [6,7]. expressão shRNA foi mantida sob puromicina (/mL 1,8 mg) de seleção. Non Target (NT) shRNA alvo há genes de mamíferos conhecidas foi usado como um controle negativo (Sigma-Aldrich, shc202V).

células de transfecção com plasmídeos que codificam LC3-GFP-mCherry

O retroviral- baseada plasmídeo pBABE-mCherry-EGFP-LC3B (plasmídeo # 22418) foi adquirido a partir de Addgene (Cambridge, MA). O vírus foi pseudotipado utilizando o vector de embalagem pPAM3 após a co-transfecção de células HEK293T e os sobrenadantes virais foram filtrados (0,2 micron), aliquotado e armazenado a -80 ° C. experiências de transfecção foram realizadas utilizando o reagente Lipofectamine transfecção (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante.

motilidade e ensaios de invasão (IncuCyte)

96 poços ImageLock microplacas (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) foram revestidos com colagénio do tipo I (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células foram plaqueadas e cultivadas a 90% de confluência. feridas idênticas foram feitas em cada poço com o 96 curandeiro bem ferida (Essen Bioscience). As células foram lavadas para remover as células flutuantes e detritos. 20% de Matrigel (Corning) foi colocado em poços designados para estudos de invasão. As condições de tratamento foram aplicadas em cada poço. As placas foram montadas sobre a plataforma de imagem IncuCyte Zoom (Essen Bioscience), que é mantida a 37 graus com 5% de CO2 e adquire imagens em tempo real para a mesma região em cada poço a cada 4 horas. Uma máscara foi criada para determinar a cicatrização de feridas para cada poço. Densidade Relativa Ferida (RWD) foi utilizado para quantificar a invasão de células de tumor e a motilidade.

DQ-colagénio IV degradação ensaio

células DU145 foram cultivadas durante 2 dias em lamelas que foram mergulhados com 100% de matrigel (Corning) e DQ-colagénio IV (Invitrogen Life Technologies, diluída para uma concentração final de 25 ug /mL). Após o tratamento durante a noite com a droga na presença ou ausência de HGF, as células foram fixadas em 4% (w /v) de paraf ormaldeído durante 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas 2 vezes com PBS e incubadas com Alexa Fluor 635 faloidina (Life Technologies) diluído 1: 200 em BSP durante 30 minutos para corar o citoesqueleto de actina. As células foram então lavadas 2 vezes com PBS e lamelas foram montadas. Colónias e clivada DQ-colágeno IV foram visualizados na Leica TCS SP5 Laser confocal do microscópio e as imagens foram capturadas usando software LAS AF.

Estatísticas

GraphPad Prism 5.0 e software Microsoft Excel foram utilizados para executar as estatísticas. Um ou dois de cauda teste t de Student foi utilizado para analisar diferenças estatísticas. Todos os gráficos mostram a média eo desvio-padrão (SD). Diferenças na P 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. IC

50 das drogas foi calculada usando a equação de regressão não-linear no GraphPad Prism. o rastreio de drogas foi realizada em 2 repetições. fator Z robusta ‘foi calculada utilizando o desvio absoluto médio e mediana do controlo positivo e negativo de cada placa e apenas placas com valor positivo foram validados [24-27]. fator Z ‘= 1 – {3 (SDN + SDP) /(Mn-Mp)} [20], em que Mp, Mn, SDP, SDN são média e desvio padrão de controle positivo (EIPA) ou controle negativo (ácido sozinho) . Tamanho do efeito de cada composto foi calculada usando percentagem normalizada de inibição (NPI). NPI = (H-XI) /(H-G) de tempo de 100; em que H = média do controlo negativo e L = média do controlo positivo e XI o valor do correspondente composto. diferença estatística do efeito do composto em relação ao controlo negativo foi calculada utilizando a pontuação Z, que é o valor de cada um dos compostos normalizados para o controlo negativo. pontuação Z = (xi-H /Sdn, onde xi é o valor do correspondente composto, H e SDN são a média eo desvio-padrão do controlo negativo em cada placa, respectivamente. Somente drogas com uma pontuação Z abaixo de menos 4 e NPI acima de 50% foram re-examinados para estudos futuros.

resultados

Uma nova abordagem triagem de alto conteúdo baseado em imaging identifica drogas que inibem anterógrada tráfico lisossoma

a fim de identificar compostos disponíveis clinicamente que impedem ácida anterógrada tráfico lisossoma mediada-Fen, desenvolvemos uma tela de alta conteúdo usando o Cellomics matriz de digitalização IV plataforma de imagem (Fig 1A). DU145 células cancerosas da próstata foram semeadas em placas de 96 poços. meio livre de soro baixo pH e EIPA foram usados ​​como controlos negativos e positivos, respectivamente. Os compostos de quatro bibliotecas químicas independentes foram aplicados em aproximadamente 5 concentração uM para células tratadas com pH 6,4 RPMI isento de soro durante a noite. As células foram fixadas e os lisossomas foram identificadas com um lisossoma associada à membrana da proteína-1 ( LAMP1), um anticorpo marcador lisossomal estabelecido, enquanto que os núcleos foram visualizados com DAPI. A plataforma Cellomics Arrayscan foi usado para visualizar a imunofluorescência em cada poço usando um 20x uma distribuição lisossoma quantificada software de análise compartimental dentro de cada célula e objectivo. distribuição lisossoma foi determinada através da análise do número de LAMP-1 puncta positiva dentro da região designada “anel” (Fig 1B).

As células com lisossomos exibindo JLA (EIPA tratado) tinha menos lisossomos dentro da região do anel, em comparação para células com lisossomos localizados difusa por todo o citoplasma. Os ensaios foram validados por meio do cálculo do factor de Z “, que mede a capacidade do teste para diferenciar entre os controlos positivos e negativos [24]. O efeito funcional para cada composto em relação aos controles foi calculado usando uma “percentagem normalizada de inibição” score (NPI). inibição mais forte do tráfico lisossoma anterógrada confere um valor maior NPI. A significância estatística do “significa mancha anelar” diferença entre composto e controle negativo foi medido utilizando uma abordagem Z score (Fig 1C). Os compostos com uma pontuação superior a 50 NPI% e pontuação Z abaixo foram seleccionados -4 (quadrante inferior direito conforme indicado pela seta vermelha) e re-examinada visualmente para eliminar falsos positivos. Entre 2210 testado compostos, dezoito drogas foram identificados como hits e verificada por meio de triagem secundária. Muitos destes compostos já são conhecidos por serem agentes de microtúbulos perturbar, e previsivelmente eles iriam bloquear o movimento para fora dos lisossomos.

Niclosamide, um agente anti-helmíntico, também foi identificada como um dos hits. Uma vez que, niclosamida tem sido demonstrado ter efeitos anti-cancerígenos no glioblastoma [28], cancro do pulmão de não pequenas células [29], cancro colorrectal [30], e cancro da mama [31], optou-se por continuar a investigar o papel de niclosamida em movimento lisossoma em células de cancro da próstata.

niclosamida é tóxico a concentrações de 1,0 micromolar

primeiro, foi testada a toxicidade celular de niclosamida, de modo a identificar a gama de concentrações em que este medicamento pode ser utilizado para estudos experimentais. Niclosamida foi aplicado a células de cancro da próstata DU145 em concentrações variáveis ​​ao longo do tempo. A viabilidade celular foi medida por um ensaio de células baseado em fluorescência (Fig S1A). niclosamida tratamento resultou na proliferação reduzida a concentrações de 0,6 ^ M e acima de 24 e 48 horas após o tratamento. A diminuição da viabilidade celular tornou-se mais evidentes às 48 horas e a uma dose de 1 ^ M e acima quando se verificar uma diminuição em células viáveis ​​às 48 horas versus 24 horas. A concentração inibitória de metade do máximo (IC

50) foi calculada como 1,01 uM (Fig S2). Portanto, para o restante dos experimentos que realizamos, optamos por uma concentração que não exceda 1 PM e experiências que não pode exceder 24 horas.

Niclosamide inibe o tráfico anterógrada lisossoma em células cancerosas

para caracterizar ainda mais niclosamida como um inibidor de tráfico lisossoma, as células de cancro da próstata DU145 foram tratadas durante a noite com DMSO ou niclosamida e exposta a meios de pH ácido 6,4, 33 ng /ml de HGF ou 100 ng /ml de EGF durante 16 horas. As células foram então fixadas e coradas com DAPI (azul), LAMP1 (vermelho), e faloidina (verde) (Figura 2A). As células tratadas com DMSO exibida tráfico lisossoma anterógrada em resposta ao ácido Phe, HGF e EGF. No entanto, as células tratadas com niclosamida não sofrem tráfico lisossoma anterógrada em resposta ao ácido Phe, HGF ou EGF; Em vez disso, os lisossomas permanecem agrupados na região perinuclear. Isto confirma os resultados do rastreio de alto teor de fármaco que niclosamida identificado como um inibidor de tráfico lisossoma.

(A) As células foram tratadas com DU145 pHe 6,4, 33 ng /mL de HGF ou 100 ng /ml de EGF em a presença ou ausência de 0,5 uM niclosamida. As células foram fixadas e coradas para DAPI (azul), actina (verde) e LAMP-1 (vermelho). No controle e na EGF ou células dos lisossomos estão localizados na periferia (setas brancas) enquanto que em células tratadas com niclosamide os lisossomos são em torno do núcleo (setas brancas) HGF-tratada. Barras de escala: 10 pm. células DU145 foram tratadas durante a noite com várias concentrações de niclosamida diluída em (B) meios de pH baixo (pH 6,4), (c) meio contendo 33 ng /mL de HGF, ou meios de comunicação (D) contendo 100 ng /ml de EGF e distribuição lisossoma relativa era calculada utilizando o imager Cellomics. Quantificação do lisossoma posição é mostrada como a média do calculado “significa ponto anel canal de contagem 3”. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes. * Indica a significância estatística (p 0,01) versus niclosamida. células DU145 (e) foram tratadas com 1 uM niclosamida ao longo do tempo e distribuição lisossoma relativo foi calculado utilizando o gerador de imagens Cellomics. Quantificação do lisossoma posição é mostrada como a média do calculado “significa ponto anel canal de contagem 3”. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes.

Um estudo de resposta à dose foi conduzido para determinar a dose mínima eficaz de niclosamida necessária para iniciar JLA. células DU145 foram tratados com concentrações variáveis ​​de niclosamida durante 16 horas na presença ou ausência de pHe acídico (Fig 2B), HGF (Figura 2C), ou EGF (Figura 2D). As células foram imunocoradas para detectar LAMP1 e DAPI foi utilizado para identificar os núcleos. A distribuição lisossoma relação foi analisada utilizando o Cellomics Imager. Niclosamide bloqueou significativamente re-distribuição dos lisossomos a uma concentração tão baixa quanto 312 nm após estimulação com HGF ou EGF, e a 625 nm após estimulação com pHe ácida.

Em seguida, realizou-se uma análise de curso de tempo para identificar a quantidade mínima de tempo que foi necessário antes niclosamida era eficaz na indução de JLA. células DU145 foram expostas a niclosamida ao longo do tempo, na presença de meio ácido (pH 6,4). Figura 2E indica que o posicionamento lisossoma foi alterada a assim que 2-4 horas após a exposição a niclosamida, e JLA aumentou ao longo do tempo. Nenhuma mudança de posicionamento lisossoma foi observado em células tratadas com veículo de controlo. Colectivamente, estes dados indicam que niclosamide altera a posição do lisossoma numa dose tão baixa quanto 312 nM e tão cedo quanto 2 horas.

não-induzida Niclosamide JLA não envolvem inibição da produção de ATP

Os trabalhos anteriores implicado kinesin, uma proteína motora ATPase, em movimento dirigido plus-end lisossoma (movimento para fora do lisossoma) [32-34]. Desde niclosamida é conhecido pela sua capacidade para atingir a fosforilação oxidativa dos parasitas [22,23], procurou-se determinar se JLA induzida por niclosamida foi devido a depleção de ATP, resultante de uma fosforilação oxidativa inibida e, consequentemente, alteração da actividade de ATP proteínas, tais como -Driven cinesina. Por conseguinte, as células de cancro da próstata DU145 foram tratados com controlo de veículo ou niclosamida ao longo de um período de 4 horas de tempo e os níveis intracelulares de ATP, um substituto de fosforilação oxidativa, foi medida utilizando um ensaio à base de luminescência (Fig S1B). Embora, o impacto de niclosamida no lisossoma posicionamento é observada tão cedo quanto 2 horas após a exposição ao fármaco, não se observou nenhuma diferença significativa no nível de ATP entre as células tratadas com controlo de veículo ou niclosamida. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes. Citocalasina D foi utilizado como um controlo para despolimerizar os filamentos de actina. As células foram fixadas e coradas para a actina (verde) e DAPI (azul). As setas indicam que os mesmos componentes celulares (filamentosa da actina-seta, actin- cortical fechada seta, focal adhesion- seta aberta) são semelhantes entre controle e niclosamide. Barras de escala: 20 pm. Nocodazole foi utilizado como um controlo para despolimerizar os microtúbulos. PI3kinase MAPK e não são necessários para prevenir a niclosamida meios ácidos induzidas para fora lisossoma movimento.

(A) células foram estimuladas com 33 ng /mL de HGF na presença ou na ausência de 0,5 uM niclosamida ao longo do tempo. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e a análise por Western blot foi realizada para as proteínas indicadas. (B) As células DU145 foram pré-tratados com o inibidor de PI3K, LY294002, ou inibidor de MAPK, U0126, antes da adição de niclosamida 1 uM durante 16 horas. As células foram fixadas e coradas para LAMP-1 e a média de distribuição lisossoma em relação ao núcleo foi calculada utilizando o gerador de imagens Cellomics. Quantificação de distribuição lisossoma é mostrado como sendo a média de posição em relação ao núcleo. * Indica a significância estatística (p 0,05) em relação ao mesmo tratamento isento de soro. niclosamida blocos crescimento motilidade e invasividade independentemente do estatuto de RAB7 proporcionou.

células DU145 e NT RAB7 proporcionou KD foram cultivadas em placas de 96 poços e feridos com o 96 agente de cura de feridas bem antes da adição de Matrigel nas cavidades concebidas para invasão induzida pelo factor. As células foram deixadas a (A) ou migrar (B) invadir na presença de 33 ng /mL de HGF ou 100 ng /ml de EGF na presença ou na ausência de 0,3 uM niclosamida. Motilidade e invasão foram calculados utilizando a plataforma IncuCyte e a percentagem relativa densidade ferida em 24 horas após o ferimento. As barras de erro representam o SD de pelo menos 3 experiências independentes.