Abstract

A evidência recente liga a activação aberrante de Hedgehog (Hh) de sinalização com a patogênese de vários cancros, incluindo meduloblastoma, glioblastoma, melanoma, bem como pâncreas, colo-rectal, e carcinomas da próstata. Aqui temos investigado o papel do factor de transcrição Gli1 no cancro do ovário. Para este fim, o perfil de Gli1 expressão foi examinada em ovários normais, tumores de ovário, e linhas celulares de cancro do ovário, e

in vitro

efeitos de um bloqueador específico HH-via, KAAD-ciclopamina, ou um específico inibidor Gli1 (GANT58) sobre a proliferação celular e sobre a expressão do gene alvo Hh também foram avaliados. Os resultados obtidos demonstraram que as células epiteliais no tecido de cancro do ovário expressam níveis significativamente mais elevados de Gli1 nuclear do que no tecido normal do ovário, em que a proteína era quase indetectável. Além disso, a análise multivariada mostrou que Gli1 nuclear foi independentemente associada a menor sobrevida em pacientes avançados serosa do cancro do ovário (IC HR = 2,2, 95% 1,0-5,1, p = 0,04).

In vitro

experimentos demonstraram expressão Gli1 nas três linhas de células de carcinoma de ovário testados, A2780, SKOV-3 e OVCAR-3. Notavelmente, embora KAAD-ciclopamina levou à diminuição da proliferação de células, este tratamento não inibir a expressão do gene alvo hedgehog em qualquer uma das três linhas de células de cancro do ovário, o que sugere que a inibição da proliferação celular foi um efeito não específico ou tóxico. De acordo com estes dados, não foram observadas diferenças na proliferação das células quando as linhas celulares foram tratadas com GANT58. Em geral, os nossos dados clínicos suportam o papel de Gli1 como um marcador de prognóstico no cancro do ovário avançado e serosa como um possível alvo terapêutico na doença. No entanto, os nossos

in vitro

resultados chamam a atenção para a necessidade de seleção de modelos experimentais apropriados que representam com precisão tumor humano para testar terapias futuras envolvendo inibidores da via Hh

Citation:. Ciucci A, De Stefano I, Vellone VG, Lisi G, Bottoni C, Scambia L, et ai. (2013) Expressão da glioma-Associated Oncogene homólogo 1 (Gli1) in Advanced serosa do cancro do ovário é associado com Desfavorável sobrevida global. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10.1371 /journal.pone.0060145

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 07 de novembro de 2012; Aceito: 22 de fevereiro de 2013; Publicação: 28 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ciucci et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é uma das principais causas de. morte em malignidades do sexo feminino, na grande maioria dos países desenvolvidos [1]. Com efeito, uma vez que esta doença tem poucos sintomas em fases precoces do seu desenvolvimento, a maioria das mulheres são diagnosticadas após o tumor primário já metástase; apesar da resposta inicial a debulking cirúrgico e a terapia de primeira linha com carboplatina e paclitaxel, a maioria dos tumores eventualmente desenvolver resistência aos medicamentos ea sobrevida em 5 anos é geralmente inferior a 30% [2]. Apesar de muitos esforços têm sido feitos para esclarecer a etiologia da carcinogênese ovariana e os mecanismos moleculares envolvidos na proliferação de células de carcinoma de ovário, esta doença continua a ser entre os menos entendidos de grandes tumores malignos humanos.

O Sonic hedgehog (Shh) de sinal -transduction via é importante na regulação da modelação, a proliferação, a sobrevivência e o crescimento de muitas células e tecidos, em que o embrião e do adulto. Ligação do secretora ligantes Hh (Sonic, indiana, ou deserto, SHH, IHH ou DHH) ao seu receptor transmembranar Patched (Ptch1) inicia a via clássica de sinalização Hh liberando Smoothened (Smo) da supressão Ptch1-dependente. Smo modula um complexo citoplasmático contendo supressor de Fused (Sufu), ativando assim as 3 (Gli) reguladores de transcrição associada a glioma. induz GLI1 e Gli3 reprime genes alvo Hh que incluem

Gli1

,

PTCH1

,

A ciclina D1

,

c-Myc

, e

Bcl -2

, enquanto que Gli2 pode actuar em ambas uma forma positiva ou negativa, dependendo eventos de processamento pós-transcricional e pós-tradução [3].

activação aberrante de sinalização de Hh tem sido implicado em vários cancros, incluindo a pele, cérebro , cólon, pulmão, próstata, pâncreas no sangue e, entre outros, accionado por um ligando ou dependente de uma via independente do ligando [4], [5]. Ligando dependente via de Hh pode ser ou autócrino, em que o ligando de Hh produzido pelas células tumorais actuam sobre as células tumorais vizinhas causando a activação da via de células-autónoma, ou pode envolver um mecanismo parácrino onde ligando Hh secretado a partir do epitélio sinaliza o compartimento estromal subjacente para criar uma microambiente favorável que propicia o crescimento do tumor. sinalização autócrina é visto no caso de o cancro do pulmão e da próstata, ao passo que no caso de cancro do ovário e colo-rectal o mecanismo parácrino parece prevalente [4], [5]. Na sinalização independente do ligando, a via de Hh é activada de uma forma de células-intrínseca através de mutações de perda de função em componentes negativos de acção, tais como Ptch1 e Sufu, ou através de mutações de ganho-de-função em componentes positivos de acção , tal como Smo [4]. Além disso, a sinalização de Hh-Gli interage com outras vias de sinalização de forma bidireccional e de contexto específico, e várias linhas de evidência sugerem que a regulação dependente do contexto do código de Gli por oncogenes e supressores de tumor constitui uma base para o envolvimento disseminado de Gli1 em cancros humanos, esta proteína de apoio e a progressão do tumor metastático transição [6], [7]. Notavelmente, no cancro do ovário, a via Hh pode também interagir com os estrogênio sinalização em uma rede complexa modulação da plasticidade fenotípica [8].

No presente estudo buscou-se determinar se a via de Hh é ativada no ovário Câncer. Para este fim, primeiro investigado imunohistoquímica da expressão da proteína Gli1 no epitélio de superfície do ovário normal e no câncer de ovário seroso avançados e correlacionados a sua expressão com os parâmetros clínico e os resultados dos pacientes. Em seguida, examinámos a expressão de Gli1 em linhas celulares de cancro do ovário, e

in vitro

efeitos de uma via hedghehog bloqueador específico, KAAD-ciclopamina [9], [10] ou um inibidor específico Gli1, GANT58 [ ,,,0],11], sobre a proliferação celular e sobre a expressão do gene alvo de hedgehog. Gli1 é realmente considerado como activador da transcrição final e, assim, fundamental da via Hh; a sua transcrição é induzida por sinalização de Hh, tornando-se, até agora, o melhor marcador fiável de uma via activa, de forma consistente transcrito em células que respondem HH-[7]. Além disso, Gli1 tem sido considerado um alvo adequado para a terapia do cancro, porque é a jusante de várias vias de sinalização [12].

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo obtido aprovação do Comitê de Ética da Universidade Católica do Sagrado coração, em Roma, Itália e pacientes deram consentimento por escrito para a recolha de tecidos e análises.

os pacientes

o estudo incluiu 56 pacientes com câncer de ovário seroso avançada admitiu à Oncologia Unidade de Ginecologia da Universidade Católica de Roma, entre Março de 2000 e Dezembro de 2008. macroscopicamente e histologicamente normais ovários, removido por motivos profiláticos, também foram obtidos a partir de 12 mulheres na pós-menopausa. características clinicopatológicas da série global estão resumidos na Tabela 1. De acordo com as directrizes padrão, esforço cirúrgica máxima foi tentada em todos os pacientes, resultando na completa ressecção (tumor residual 0 mm), em 35 (63%) casos. Todos os pacientes receberam quimioterapia baseada em platina (75-100 mg /m

2 para a cisplatina, AUC = 5 para carboplatina, por ciclo). Cinqüenta pacientes (89,3%) também receberam paclitaxel (135-175 mg /m

2 para cada ciclo). Recorrência da doença foi definida de acordo com critérios gCig CA125 [13], [14] e /ou confirmação radiológica da progressão do tumor. Para definir quimio-sensibilidade, foi utilizada a definição comum de resistência de platina, definindo como pacientes “sensíveis” que recaíram 6 meses ou mais após prévia quimioterapia contendo platina, e como pacientes “resistentes” que recaíram menos de 6 meses após a quimioterapia foi interrompida, ou que progrediu durante o tratamento [15]. dados de acompanhamento estavam disponíveis para todos os 56 pacientes (mediana de acompanhamento, 35 meses; gama, 9-127 meses). Durante o período de acompanhamento, progressão e morte da doença foram observadas em 42 e 23 pacientes, respectivamente.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, o processo de recuperação de antigénio foi realizada por aquecimento do forno microondas em tampão de citrato (pH = 6). As secções foram incubadas com soro de cabra normal a 20% durante 30 min a temperatura ambiente para reduzir a ligação não específica. As células que expressam Gli1 (clone H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, diluição de 1:50), foram identificadas após incubação durante a noite a 4 ° C. O anticorpo utilizado no presente estudo foi testado quanto à especificidade, conforme descrito anteriormente [17] – [20]. As secções foram incubadas com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho), durante 30 min, à temperatura ambiente. As lâminas foram desenvolvidas com (sistema de substrato DAB, DakoCytomation) diaminobenzidina, contra-coradas com Hematoxilina de Mayer, desidratados em etanol e xileno, e, finalmente montada. carcinoma de células basais foi utilizado como um controlo positivo. A coloração sem anticorpo primário foi usado como controlo negativo.

Avaliação da imuno-coloração

A expressão foi avaliado considerando a percentagem de células que exibem imunorreacção em um mínimo de 500 células neoplásicas histologicamente identificadas. Gli1 coloração foi observada tanto no citoplasma e no núcleo de células de carcinoma do ovário. No entanto, como Gli1 é um fator de transcrição, única expressão Gli1 nuclear foi marcado para as análises de dados subsequente e estudos de correlação. A imunocoloração foi avaliada por dois observadores independentes (GFZ e VGV) que não sabiam do diagnóstico dos pacientes. Para definir um valor de corte para Gli1, comparamos a imunorreatividade nuclear medido em tecidos normais versus tumorais. A imunorreactividade estava ausente em células epiteliais de todos, menos um ovários normais, com um único espécime mostrando uma reacção de coloração fraca em cerca de 10% das células. secções de tumor em que 10% das células foram coradas foram, assim, considerar-se positiva

Cultura celular

As linhas celulares de carcinoma do ovário A2780, SKOV-3 e OVCAR-3 foram adquiridos a. European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). células OVCAR-3 e A2780 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Lonza, Basileia, Suíça), SKOV-3 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Lonza). O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Lonza), glutamina 2 mM e antibióticos (100 mg /ml de estreptomicina e 100 IU /ml de penicilina) (Lonza). Todas as culturas foram mantidas a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 e 95% de ar.

A imunocitoquímica

As células (2,0 a 4,0 × 10

4 células /cavidade) foram banhado em slides câmara de dois poços (Nunc® Lab-Tek® II câmara slide, Nunc, Inc., Naperville, IL). As células foram cultivadas durante 24 h e utilizado para a imunocoloração. As lâminas foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraf ormaldeido e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100. A peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 durante 5 min. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram incubadas com uma solução de bloqueio contendo 20% de soro de cavalo normal em PBS, durante 30 min à temperatura ambiente. solução de bloqueio em excesso foi drenada, e as amostras foram incubadas com uma diluição de 1:50 do anticorpo anti-Gli1 (clone H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. As amostras foram então lavadas três vezes com PBS e incubadas com o anticorpo secundário, EnVision System-HRP (Dako, Carpinteria, CA), durante 30 min à temperatura ambiente. A imunorreactividade foi detectada utilizando o substrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAB sistema de substrato, Dako). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Mayer, desidratados em etanol e xileno, e, finalmente montado.

Ensaio de Proliferação

A2780 (3,0 × 10

4 por poço), OVCAR-3 (2,0 × 10

4 por poço) e SKOV-3 (2,0 x 10

4 por poço) as células foram semeadas em placas de 24 poços em meio de cultura completo. Após incubação durante a noite, o meio foi mudado para 2% de FBS contendo várias concentrações de KAAD-ciclopamina (Santa Cruz Biotechnology), ou GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). As substâncias foram dissolvidas em DMSO absoluto e diluída em meio de cultura adequado imediatamente antes da utilização. As células de controlo receberam a mesma quantidade de DMSO diluente. Após 48 h de incubação, as células foram recolhidas por tripsinização, e as células viáveis ​​foram contadas utilizando Nucleocounter (Chemometec, Allerod, Dinamarca). Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes em duplicado.

Ensaio MTT

Todas as linhas de células de cancro do ovário foram semeadas (4,0 × 10

3 por poço) em placas de 96 poços em completa cultura médium. Após incubação durante a noite, o meio foi mudado para 2% de FBS contendo várias concentrações de KAAD-ciclopamina (Santa Cruz Biotechnology) ou GANT58 (Calbiochem). A citotoxicidade foi quantificada por medição da redução de MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio, um tetrazole) para produzir um produto de formazano azul escuro. Adicionou-se MTT a cada poço 48 h após o início do insulto. Após 3 h de incubação, a solubilização /solução de paragem foi adicionado aos poços de cultura para solubilizar o produto formazan e a absorvência a 570 nm registada utilizando um leitor de placas de 96 poços (1420 Victor, Wallac, Perkin Elmer). Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes em duplicado.

Análise Western Blot

extractos celulares totais foram preparados após lise em tampão contendo Tris-HCl a 50, pH 7,4, 0,2 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 0,5% de NP-40, 10% de glicerol suplementado com inibidores de fosfato e protease. Quantidades iguais de proteína (50 ug /amostra) foram separadas por SDS gradiente de poliacrilamida de electroforese em gel (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), transferidos para membranas de PVDF (Immobilon-P transferência membrana, Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas durante 1 hora com 5% (w /v) de leite desnatado seco em tampão salino Tris que contém 0,1% de Tween 20 (TBST) e incubados com anticorpos primários (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology; p-actina: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em TBST com leite seco não gordo a 3%, a 4 ° C durante a noite. Depois de se lavar três vezes com TBST, as membranas foram marcadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano durante 1 hora à temperatura ambiente. proteínas específicas foram visualizados com o sistema ECL Ocidental blotting de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). A análise Western blot β-actina foi utilizada como controlo de carregamento de amostras iguais.

Análise ARNm in Real Time PCR

O ARN total foi extraído utilizando o total de isolamento de ARN NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel GmbH Co. KG) e foi transcritos de modo inverso, utilizando o kit RETROscript (Ambion®, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Para avaliar as alterações quantitativas em níveis de ARNm Gli1, cada mistura de reacção de RT foi então sujeito a PCR em tempo real (Q-PCR), utilizando as seguintes condições de ciclo: 35 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 20 s; emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 20 s; usando o Brilhante III ultra-rápida SYBR® verde QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). As reacções de PCR foram realizadas num volume de reacção de 20 uL de uma máquina de PCR em tempo real MX3000P (Stratagene). Os iniciadores de PCR para a detecção de transcritos específicos foram como se segue: Gli1, 5′-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 ‘e 5′-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3′; β-actina 5’-ACG TTG CTA TCC AGG CTG TCC AT-3 ‘e 5′-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3’. As concentrações de ARNm relativos foram calculados a partir do ponto de descolagem de reacções (ciclo limiar, CT) utilizando o método de quantificação comparativo realizado por um software de Stratagene e baseia-se no método -ΔΔCt. Esta análise aproxima alvo de uma determinada amostra de ARNm (Gli1) em relação ao nível médio dos níveis de ARNm alvo em controlos não tratados ( “calibrador” de valor), permitindo assim a análise estatística de desvio da média mesmo entre os controlos. Os valores Ct para expressão β-actina serviu como um sinal de normalização. Em cada ensaio, a eficiência da PCR também foi calculada utilizando uma diluição em série da amostra experimental; valores de eficiência entre 80 e 100% foram encontrados para cada conjunto de primers e tidos em conta para a análise quantificação comparativa.

Análise Estatística

A expressão de Gli1 e sua associação com os parâmetros clínico foi avaliada utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. sobrevida livre de doença e sobrevida global foram calculados a partir da data do diagnóstico da data de progressão /morte, ou a data de visto pela última vez. O efeito prognóstico dos vários parâmetros sobre o resultado clínico (ou seja, recorrência ou morte da doença) foi testado traçando curvas de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier, e comparando os grupos usando o teste de log rank, bem como pela análise multivariada utilizando o modelo de Cox . estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram gerados a partir da data do diagnóstico histológico para o tempo do último acompanhamento ou morte. Na análise univariada, cada parâmetro foi categorizada para posterior análise estatística. Apenas as variáveis ​​com ≤0.2 p-valor na análise univariada foram incluídas no modelo multivariado. Resultados obtidos em

in vitro

experimentos foram expressos como média ± SD e foram analisados ​​pelo teste t bicaudal de Student. As diferenças foram consideradas significativas se P ≤ 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism5 (San Diego, CA, EUA). análise de Cox foi realizada utilizando o StatPlus 2009.

Resultados

Expression Gli1 em avançado Serosa cancros do ovário

Um total de 56 cancros avançados serosa primárias do ovário e 12 tecidos ovarianos normais de mulheres pós-menopáusicas foram avaliados. Gli1 imunorreactividade estava ausente no epitélio de superfície, bem como em células do estroma, dos ovários normais (Fig. 1a), em todos, excepto num caso, esta última apresentando uma fraca coloração nuclear em cerca de 10% das células. Uma reacção nuclear positiva foi observada em 29% dos carcinomas serosos (Figura 1B.); imunorreactividade citoplasmática também foi observada na maioria das amostras examinadas. Estes resultados indicam que a via de sinal de Hh é activada em células de carcinoma de ovário em comparação com as células epiteliais normais.

imagens representativas para Gli1 imunomarcação que mostra a expressão em epitélio normal do ovário (A) e alta (B) ou baixo (C ) expressão em tecidos de cancro do ovário. o carcinoma de células basais foi utilizado como controlo positivo (D). Ampliação de 20x e 40x. curva de sobrevivência (E) de Kaplan-Meier para a probabilidade de sobrevivência livre de doença e (F) a sobrevivência geral de acordo com a expressão de Gli1 nuclear em pacientes de cancro do ovário avançado serosas. Positivo ( 10%) expressão Gli1 no núcleo está significativamente associado à desvantagem sobrevida global (p = 0,04)

A Tabela 2 apresenta imunorreatividade nuclear mediana de Gli1 em pacientes com câncer de ovário seroso avançados de acordo com. os parâmetros clínico. Não houve correlação entre a expressão Gli1 nuclear e qualquer um dos parâmetros analisados.

O papel prognóstico da expressão Gli1 tanto para DFS e OS foi testado em univariada e multivariada ajustados para os parâmetros clínico. modelo univariado de DFS não detectou qualquer associação entre a expressão Gli1 e o resultado clínico (Tabela 3, Fig. 1E). Por outro lado, usando a análise de Kaplan-Meier, descobrimos que os pacientes com expressão positiva Gli1 teve um prognóstico de sobrevida global desfavorável; a mediana de sobrevida global na população estudada foi de 35 meses, enquanto ele permaneceu indefinido para pacientes negativos-Gli1, pois mais de 50% deles ainda estavam vivos no momento da análise (P = 0,04) (Tabela 4, Figura 1F). Notavelmente, no modelo multivariado, Gli1 expressão nuclear mantido um papel prognóstico negativo independente para OS (p = 0,04, Tabela 4).

Fatores Prognósticos clássicas em cancros avançados seroso do ovário

O papel prognóstico da idade no momento do diagnóstico, grau histológico do tumor residual e quimio-sensibilidade para ambos DFS e OS foi testada em análises uni e multivariada (Tabelas 3 e 4). A presença de qualquer tumor residual a cirurgia primária ( 0 mm) [21] e platina-resistência foram encontrados para ser associado com um maior risco de recorrência da doença, tanto na univariada (p = 0,003 e p 0,0001, respectivamente) e análises multivariadas (p = 0,003 e p 0,0001, respectivamente). Platinum resistência também foi encontrado para ser uma variável independente de prognóstico desfavorável para OS (p = 0,002).

Gli1 é expressa em ovário Carcinoma Cells

Para investigar um papel putativo para Gli1 no câncer de ovário , determinou-se primeiro nível da proteína em três linhas celulares de carcinoma do ovário humano A2780, SKOV-3 e OVCAR-3. Análise imunocitoquímica mostraram coloração nuclear Gli1 nas três linhas celulares (Fig. 2a). A expressão proteica foi próxima confirmada por análise de Western blot utilizando um anticorpo comercial produzido contra os aminoácidos 781-1080 de Gli1 de origem humana (Figura 2A). O anticorpo reconhece diversas formas que eram quase visível em todas as linhas de células: a 130 KDa isoforma provavelmente atuando como ativador, os fracos repressor 100 kDa [22], e uma banda adicional de 70 KDa ainda não identificada, mas também relatada em células mesotelioma maligno da pleura culturas [23].

(a), três linhas de células de carcinoma do ovário humano, A2780, SKOV-3, OVCAR-3 e foram submetidos a imunocoloração com anticorpo contra Gli1. Todas as linhas celulares expressam três Gli1. A expressão da proteína foi também confirmada por análise Western Blot. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) As células foram cultivadas em meio com FBS a 2% e tratou-se com 2, 5 e 10 uM KAAD-ciclopamina (K) ou GANT58 durante 48 h. tratamento KAAD-ciclopamina inibe a proliferação celular em todas as três linhas de células enquanto que GANT58 não afecta o crescimento celular. o número de células apresentados são expressos como percentagem de células tratadas com DMSO (média ± DP de três experiências diferentes; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, teste t). expressão (C) ARNm Gli1 foi avaliada por análise de Q-PCR em células cancerosas do ovário, tratadas com 10? M KAAD-ciclopamina durante 48 h. Os dados são expressos como alteração de dobragem contra cada respectivo controlo (CTRL), tomado como calibrador para análise comparativa quantificação dos níveis de ARNm. Cada amostra foi medida em triplicado, a experiência foi repetida 2 vezes com resultados semelhantes. Gráficos mostram média ± SD.

O tratamento com KAAD-cyclopamine inibe a proliferação celular das células ovarianas carcinomas

A fim de examinar se a via de Hh ativado é essencial para a proliferação do carcinoma de ovário células, A2780, SKOV-3 e OVCAR-3 foram expostos a concentrações crescentes de KAAD-ciclopamina, um composto capaz de inibir tanto a Hh ligando-dependente e independente, a activação da via, através da interacção directa com Smo. contagem directa de células viáveis ​​mostrou que KAAD-ciclopamina induziu uma redução dependente da dose da proliferação de células tumorais do ovário (Fig 2B). Avaliação da viabilidade celular pelo ensaio de MTT confirmou o efeito inibitório de KAAD-ciclopamina sobre o crescimento de células A2780, ao passo que não se observou qualquer efeito inibidor para SKOV-3 e OVCAR-3 células (Fig. S1). Um super ou sub-avaliação dos resultados de MTT, se comparados com os resultados da contagem de células já foi relatada por vários autores, os principais factores que contribuem para esta discrepância sendo representado por diferenças no tamanho celular, morfologia celular, crescimento celular (cluster ou monocamada) ou atividade mitocondrial [24] – [26]

Efeito da KAAD-cyclopamine em Hh sinalização

Para confirmar que a redução da proliferação de células

in vitro

por KAAD-cyclopamine. foi devido a inibição especifica da via Hh, analisou-se a alteração em níveis de mRNA e proteína GLI1 em linhas celulares de carcinoma de ovário tratado com a droga. análise Q-PCR mostrou que o tratamento de A2780, SKOV-3 e OVCAR-3 com 10 uM KAAD-ciclopamina não modular significativamente os níveis GLI1 após 48 h de exposição (Fig. 2C). A falta de um efeito de KAAD-ciclopamina na actividade de sinalização de Hh foi adicionalmente confirmada por imunotransferência (dados não mostrados). Estes dados sugerem que a inibição da proliferação do cancro do ovário

in vitro

por KAAD-cyclopamine não é um evento SMO-mediada.

O tratamento com GANT58 não inibir a proliferação celular das células ovarianas carcinomas

a fim de confirmar a ausência de efeito de modulação via de Hh sobre a proliferação de células de cancro do ovário, A2780, SKOV-3 e OVCAR-3 foram expostos a concentrações crescentes de GANT58, um inibidor específico Gli1. Os resultados obtidos mostraram que GANT58 não induziu qualquer redução na proliferação de células tumorais do ovário (Fig. 2B). Estes dados foram confirmados pelo ensaio de MTT (Fig. S1).

Discussão

Embora a activação da via de Hh tem sido demonstrado em vários tipos de malignidades [5], existem apenas poucos relatórios que indiquem que em espécimes de carcinoma do ovário humanos [27] – [30], com apenas duas examinar o papel prognóstico de moléculas de sinal HH no cancro do ovário. Além disso, os resultados destes dois estudos foram conflitantes: Chen e seus colegas [27] descobriram que, entre Shh, Dhh, Ptch, Smo e Gli1, Dhh foi o único fator associado com o resultado de sobrevivência, enquanto que no estudo do Liao [29] examinar o prognóstico papel da Shh, Ptch, Smo e Gli1, esta última foi a única proteína associada de forma independente para a sobrevida dos pacientes. Não há dados disponíveis no momento em que pode ajudar a explicar esta discrepância, embora possa ser devido à análise da população diferente em termos de fase e /ou histotipo tumor. No presente estudo, investigamos o papel prognóstico do Gli1 em uma população homogénea de câncer de ovário seroso avançados que mostram que os pacientes cujos tumores expressam coloração Gli1 nuclear ( 10%) experimentam um sistema operacional mais curto em comparação com casos negativos (≤10%). O papel independente de expressão Gli1 como marcador de mau prognóstico foi sustentado pela análise multivariada, após o ajuste para tumor residual no momento da cirurgia e quimio-sensibilidade. Em geral os nossos resultados não só reforçam a hipótese de que Gli1 pode representar um novo marcador prognóstico importante no câncer de ovário, mas também sugerem que tumores Gli1 expressando mal responder a terapias de segunda linha, apoiando assim o potencial utilidade terapêutica de combinações de agente de Gli-alvo de tratamentos padrão em pacientes com câncer de ovário.

neste contexto, foram pronto para examinar se a via de Hh ativado é essencial para a proliferação de células de carcinoma de ovário. Para este fim, em primeiro lugar avaliadas por análise imunocitoquímica e imunotransferência da expressão da Gli1 em diferentes linhas celulares de cancro do ovário, isto é, A2780, SKOV-3 e OVCAR-3, estes estudos revelam a expressão da proteína semelhante em todas as 3 linhas celulares examinadas. Desde ciclopamina inibe a sinalização de Hh através da ligação e prevenindo a activação pelo Smo [31], que em seguida avaliou a contribuição de sinalização autócrina ao crescimento do tumor através do estudo do efeito da droga sobre

in vitro a proliferação de células

. Nomeadamente, verificámos que, embora este alcalóide planta induziu uma inibição dependente da dose da proliferação de células nas linhas de células testadas, no entanto, este efeito não se correlacionou com uma inibição da sinalização de Hh, como julgado pela falta de modulação Gli1 em culturas de células tratadas. Estes resultados sugerem que a inibição da proliferação de células não era o resultado da inibição da via de Hh SMO-mediada canónica, mas em vez de um efeito não específico ou tóxico. De acordo com estes dados, não foram observadas diferenças na proliferação das células quando as linhas celulares foram tratadas com GANT58, um inibidor específico Gli1. Notavelmente, a falta de resposta das células SKOV-3 e OVCAR-3 linhas celulares para inibição da via de Hh é consistente com os resultados anteriores de nosso e por outros grupos, usando ciclopamina ou um inibidor específico Gli1 [32], [33]. Além disso, Kudo

et al

. [34] também mostraram recentemente que o tratamento com anti-Gli1 shRNA não afetou a expressão Gli1 em células A2780. Por outro lado, os nossos

in vitro

dados contrastam com os estudos de Liao

et al

. [29] e Kandala e Srivastava [35], demonstrando que, após o tratamento com ciclopamina, expressão Gli1 foi diminuída em SKOV-3 e OVCAR-3 ou células A2780, respectivamente. As razões para estes resultados conflitantes permanecem obscuros, adicionando outra camada de complexidade para os esforços destinados a atribuir o crescimento do tumor de ovário à atividade Hh excessiva. Embora possam ser devido a diferenças nos sistemas experimentais (por exemplo, linhas celulares são propensas a genotípica e deriva fenotípica durante a sua cultura contínua) e /ou métodos de ensaio, é também concebível que eles possam na verdade reflectem a heterogeneidade da sinalização autócrina e parácrina no cancro do ovário . Neste contexto, é digno de nota que, juntamente com coloração de células cancerosas epiteliais, também se observou expressão nuclear esporádica de Gli1 no estroma circundante (dados não apresentados), esta descoberta sugere uma interacção celular entre estroma e epitélio, com possível ocorrência de sinalização parácrina. Infelizmente, devido ao componente estroma limitada geralmente associada a lesões de alto grau, que não foram capazes de determinar a extensão da expressão Gli1 no microambiente do tumor, e mais estudos são necessários para esclarecer o papel da parácrina Hh sinalização no cancro do ovário.

na verdade, as discrepâncias semelhantes em resultados experimentais também foram relatados em outros tumores, como o de próstata, pâncreas e cólon [36], [37]. Yauch e colegas [38] feita a interessante observação de que Smo-antagonista mediada por inibição do crescimento de um grande número de linhas celulares de cancro de origem epitelial não se correlaciona com a expressão do gene alvo Hh nestas células, sugerindo que a) o observado

in vitro

crescimento repressão pode ser devido a efeitos fora do alvo quando estes compostos são utilizados em concentrações elevadas, e b) não é um requisito parácrina para sinalização Hh ligando na tumorigénese dos cancros HH-expressam, com implicações importantes para o