Abstract

progressão metastática é um processo de várias etapas que envolve o crescimento de tumores e sobrevivência, motilidade e invasão e proliferação subsequente em um ambiente inadequado. A Src de tirosina proteína quinase tem sido implicada em muitas das vias bioquímicas que dirigem estes comportamentos. Apesar de o próprio Src está apenas raramente mutado em tumores humanos, a sua actividade aberrante tem sido observado em vários cancros, sugerindo a servir como um barómetro do potencial metastático. Com estas características em mente, examinámos Src quinase na regulação estrutural, enzimático, e os níveis de expressão como uma função de linhas celulares de cancro da próstata progressivamente invasivos. Surpreendentemente, o conteúdo e atividade da quinase Src diminuição total, com crescente agressividade linha de células, uma observação que parece ser incompatível com o papel bem documentado de Src nas vias de sinalização que impulsionam o crescimento e invasão. No entanto, nós observamos uma correlação direta entre Src quinase

atividade específica

(actividade total quinase Src /conteúdo total de Src) e agressividade metastático, possivelmente sugerindo que em linhas celulares altamente agressivos, enzimas de sinalização chave são globalmente recrutados para conduzir o fenótipo canceroso. Além disso, embora a fosforilação aumentada de Src esperado em Tyr-416 (local de activação) está presente nas linhas celulares de cancro da próstata mais agressivos, níveis inesperadamente elevadas no local de fosforilação inibidora de Tyr-527 são observados bem. Este último, ao invés de representante da enzima inibida, é mais um indicativo de Src preparado sensível a parceiros de ligação fosforilados locais

Citation:. Xu W, Allbritton N, Lawrence DS (2012) Src Regulamento Kinase na Progressivamente câncer invasivo. PLoS ONE 7 (11): e48867. doi: 10.1371 /journal.pone.0048867

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 20 de junho de 2012; Aceite: 1 de outubro de 2012; Publicação: 07 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health conceder 5R01CA140173 para DSL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína quinase Src é o membro fundador da quinase da subfamília Src de tirosina-quinases de proteína nonreceptor. A actividade catalítica destas enzimas é regulada, em parte, via fosforilação [1]. Especificamente, a activação completa do Src está dependente da fosforilação de Tir-416. Em contraste, Tyr-527 a fosforilação inibe a actividade catalítica, promovendo uma interacção intramolecular com domínios SH2 da enzima (e SH3). De facto, o nível de fosforiladas Tyr-527, como foi revelado pela análise de transferência de Western ou imunocoloração, é muitas vezes tomada como uma medida da enzima inactiva. Por exemplo, a actividade de quinase de Src foi relatado para ser regulados positivamente em cancro da próstata refractário a hormonas tal como avaliado por conteúdo fosforilada Tyr-416 [2]. No entanto, esta interpretação é cheia de perigos. Embora o

in vitro

atividade catalítica baixa de pTyr-527 Src é indiscutível, a actividade correspondente da mesma enzima em um ambiente biológico é menos certo. Após a interacção dos domínios SH2 ou SH3 da enzima Src com outras proteínas, o resíduo pTyr-527 inibidor é libertado, o que gera totalmente activa pTyr-Src 527 [3] – [5]. Com efeito, este processo, se condensa por péptidos contendo Ptyr curtos que, por ligação ao domínio SH2 de Src, perturbam a intramolecular inibidora pTyr-527 interacção e, desse modo activam a actividade da quinase [6] – [8]. Por conseguinte, o estado pTyr-527 não é necessariamente indicativa de uma enzima inibida

per se

, mas em vez de uma enzima que é, potencialmente, preparado e pronto para ser “ligado” por interacção com uma proteína acessória apropriado. Em suma, os níveis elevados pTyr-527 Src poderia representar enzima inibida, enzima ativada, ou alguma variante in-between. Esta incerteza destaca a necessidade de provar Src quinase

diretamente através de sua capacidade de fosforilar um substrato alvo. Além disso a fosforilação, a quinase Src é regulada ao nível da proteína através de ubiquitinação e assim a degradação pela via mediada por proteassoma [9]. Por conseguinte, em muito da mesma maneira que o estado de fosforilação é um prenúncio questionável da actividade da quinase, os níveis de ARNm não estão necessariamente indicativo de teor de Src quinase ou actividade.

Src está fortemente implicada nas vias que controlam a característica de muitos comportamentos de células responsáveis ​​pela invasão e progressão tumoral. Por exemplo, Src medeia a adesão e dinâmica do citoesqueleto e desse modo controla a migração de células [10], [11]. migração invasiva é aumentada por uma transição de Src-dependente epitelial-mesenquimal [12] e a activação de proteases que degradam a matriz [13] – [16]. Src fosforilação da caspase 8 é anti-apoptótico [17] enquanto que a activação STAT mediada por Src promove o crescimento celular e sobrevivência [9]. Em suma, Src está implicado em uma infinidade de caminhos que são up-regulamentados em muitas das formas mais agressivas e invasivas de câncer. No entanto, desde Src só é raramente mutado em tumores humanos, comportamento aberrante Src é o mais frequentemente uma consequência da sua regulação anormal. Examinámos regulação Src quinase no limite, catalíticos, e os níveis de expressão estruturais através de uma plataforma de linhas celulares de cancro da próstata que variam no comportamento de não-invasiva altamente invasivo para e a partir de androgénio-dependente e independente de androgénio. Surpreendentemente, descobrimos que os níveis de actividade catalítica e Src de proteína são significativamente reduzida nas linhas de células mais agressivas. Por outro lado, estas linhas celulares agressivos exibir actividade específica elevada Src e aumentar os níveis de fosforilação em relação aos seus congéneres menos agressivos Tir-527 (o assim chamado local de inibição). Estes resultados são discutidos no contexto do mecanismo da actividade de Src em ambientes altamente proliferativas.

Resultados

concepção e síntese da proteína-quinase Src sensor

Com base, em parte, em uma sequência de substrato de Src identificados a partir de uma biblioteca de péptidos orientada [18], foi construída a sequência marcada com fluororo: 5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Orn ( Ac) amida (1), em que Tyr é o local de fosforilação. Além disso, os resíduos (Orn ornitina) foram colocados em cada extremidade da sequência do péptido, no caso em que o péptido mostrou exibir fraca selectividade para Src versus outras proteína quinases. Nós mostramos anteriormente que a modificação da cadeia lateral dos péptidos dirigidos ao sítio activo com substituintes não naturais pode melhorar dramaticamente a selectividade para a proteína quinase alvo (

vide infra

) [19] – [25]. Tanto o não-fosforilada e as formas fosforiladas [5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-Orn (Ac) -amida (2)] do péptido foram preparadas através de síntese de péptidos em fase sólida. 5-FAM (5-carboxifluoresceína) foi escolhido como o fluororo para substrato e de detecção do produto por LIF.

A separação do substrato não-fosforilado e o produto fosforilado por CE-LIF é mostrado na Fig. 1A. Uma mistura 01:01 dos péptidos foi carregada no capilar. Sob as condições de separação descritos em Materiais e Métodos, péptido substrato 1 emerge a 240 seg, enquanto que o produto fosforilado 2 aparece a 290 seg. O crescimento deste último foi monitorada, como uma função do tempo, por incubação do substrato (1) com Src quinase activa. O pico de 290 seg foi confirmada como sendo o produto fosforilado pela adição com fosfo-péptido sintético 2. A cinética de fosforilação foi obtido através da avaliação de amostras de pontos de tempo recolhidos através CE-LIF e quantificar o grau de fosforilação através de integração dos picos individuais. Péptido 1 fosforilação é essencialmente completa dentro de 3 min sob as condições de ensaio que empregaram enzima Src puro (Fig. 1B). Por outro lado, experimentos posteriores, em lisados ​​celulares (

vide

infra) prosseguir a um ritmo mais vagaroso. Neste último caso, a cinética inicial de taxa ( 10% de fosforilação de péptido) foram adquiridos dentro de 10 min de incubação lisado celular

(a) separação do CE-LIF e visualização do substrato péptido Src 1 e a sua constituição química. contraparte fosforilada sintetizado 2. (b) Src fosforilação catalisada por quinase de um péptido como uma função do tempo, conforme avaliado por CE-LIF.

Estabilidade da quinase Src substrato peptídico da próstata 1 em Lisados ​​Celulares

Peptídeos geralmente sofrem a degradação catalisada por protease em células bem como em lisados ​​celulares. Consequentemente, antes de se analisar a fosforilação catalisada por Src-quinase de um péptido com lisados, que monitorizada a estabilidade do péptido em função do tempo. As células foram lisadas utilizando tamp de lise de mamífero M-PER da Pierce e, na ausência de ATP e Mg

2+ (isto é, sem actividade de quinase observável), o lisado foi adicionado ao péptido 1. Apenas aproximadamente 10% do péptido é degradada depois de 1 h (Tabela S1). Uma vez que a taxa de fosforilação é medido no prazo de 10 min de incubação (Fig. S1), o péptido é suficientemente estável para as nossas necessidades.

Avaliação da Actividade de Src na linha de células de próstata Lisados ​​

Os nossos estudos iniciais centrada nas linhas de células não-invasivos imortalizadas normais epiteliais da próstata PZ-HPV-7 e RWPE1 e as linhas celulares de CaP altamente invasivos DU145 e PC3. Investigou-se também actividade de Src na linha celular CWR22Rv1 não metastático, o qual exibe o crescimento independente de androgénio, um comportamento característico de CaP fase avançada [26] correlacionada com a quinase Src [2]. Foram avaliadas a cinética inicial de taxa (ou seja, 10% da formação do produto) de fosforilação peptídeo (Fig. S1) e foram surpreendidos ao descobrir que a atividade quinase Src (em função do montante total extrato de proteína) é significativamente menor no cancro da próstata agressivo linhas celulares (CWR22Rv1, DU145 e PC3) do que as linhas de células não-cancerosas da próstata (PZ-HPV-7 e RWPE1) (FIG 2;. barras cinzentas; P 0,001). Esta tendência geral está em desacordo com a noção geral de que a alta atividade de Src se correlaciona com a próstata linha celular agressividade (comportamento invasivo ou seja e crescimento andrógeno-independente). Relatórios anteriores notaram que altos níveis de pTyr-416 estão presentes nas tampas mais agressivos e assumiu-se, em toda a literatura, que a atividade Src pTyr-416 e se correlacionam diretamente um com o outro. Uma eventual conclusão derivada de nossos dados é que a noção geralmente aceite que pTyr-416 níveis de servir como um barômetro da atividade Src está com defeito. No entanto, nós investigamos se pode haver explicações alternativas para a relação inesperada entre a atividade Src e linha de células de agressividade. Uma possibilidade é que o substrato de Src 1 é fosforilada por outras quinases da proteína tirosina tornando assim a relação inversa entre a actividade de Src evidente e agressividade célula enganosa.

barras cinzentas são taxas de fosforilação do péptido 1 de lisados ​​de células inteiras (normalizado pela quantidade de extracto de proteína total). As barras brancas são as taxas de fosforilação por lisados ​​celulares devido a Src quinase sozinho depois de subtrair Src não-fosforilação fundo de 1. Comparação entre linhas celulares de cancro agressivo não-câncer (PZ-HPV-7, RPWE1) e (CWR22Rv1, DU145, PC3) mostraram níveis reduzidos significativos de actividade de Src-quinase associada com o mais tarde (p 0,001). Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. As barras de erro são SEM.

Avaliação da Seletividade de Peptide 1 para Src em linhas de células da próstata

Foi examinada a Src-seletividade de 1 utilizando lisados ​​de células CaP desprovidas de Src (Fig . S2). Embora os lisados ​​celulares por Src livres são capazes de fosforilar um péptido, fazem-no em menor extensão ( 30%) do que com os lisados ​​de células inteiras contendo Src (Figura 2, as barras brancas.). As tirosina-quinases contaminantes que podem ser responsáveis ​​para o baixo nível de péptido 1 fosforilação na ausência de Src pode ser um ou mais dos outros oito membros das cinases da família Src (SFK). De facto, vários membros da família SFK tais como Fyn,, Brk, Lyn e Yes Lck são conhecidos por apresentar em linhas de células da próstata [27]. No entanto, dado o nível relativamente modesto de peptídeo 1 fosforilação por-SRC livre lisados, decidimos que o péptido 1 é, para as nossas necessidades atuais, suficientemente Src seletiva.

Nós também avaliou a capacidade do peptídeo Src 1 /método de EC-LIF para detectar actividade de Src, utilizando uma combinação de dois inibidores da Src conhecidos. Imatinib (comercializado como Gleevec), que é utilizado para tratar leucemia mielóide crónica e outros cancros, é um inibidor Abl selectivo com actividade anti-Src fraco demonstrada. blocos de imatinib actividade de quinase, servindo como um inibidor competitivo da ATP. Tal como imatinib, saracatinib (AZD0530) é um inibidor competitivo do ATP, mas exibe uma alta selectividade e potência robusta para Src. Por exemplo, o

IC

50 valores de imatinib e saracatinib com a enzima Src isolado são 24,4 mM [28] e 2,7 nM [29], respectivamente. Usando lisados ​​celulares DU145, descobrimos que os potentes Src blocos saracatinib peptídeo inibidor 1 fosforilação com um submicromolar

IC

50 (0,35 ± 0,08 M), enquanto que o correspondente pobres imatinib inibidor de Src exibe um

IC

50, que é superior a 100 mm (Fig. S3). Estes resultados são consistentes com a noção, exemplificada pelas experiências de depleção Src que o método /CE-LIF peptídeo Src 1 serve como um Src modalidade de detecção de atividade eficiente e seletiva. actividade de Src-quinase também foi avaliada em células únicas vivas, tanto na ausência e na presença de imatinib e saracatinib (Fig. S3).

Src níveis de expressão e estado de fosforilação nas linhas de células da próstata

src actividade é mais elevada nas linhas de células não-agressivas e inferior em linhas celulares agressivas (Fig. 2), o que é inconsistente com a noção geral que a Src desempenha um papel importante na carcinogénese, metástase, e a transição para o estado independente de androgénios. No entanto, ocorreu-nos que o conteúdo total de Src pode variar de uma linha celular para o outro, o que poderia a aparente (mas equivocadas) relação inversa entre a atividade Src e Cap agressividade.

conteúdo Src foi quantificada por western blot análise (Fig. 3A) e em relação normalizada para cc-tubulina. Descobrimos que as linhas de células invasivas, bem como a linha celular independente de androgénios, exibem menos do que a Src correspondente não-invasiva, as linhas celulares dependentes de androgénio (Fig 3B, p. 0,001). Com esses dados em mãos, nós posteriormente plotados atividade específica Src (atividade ou seja, total de Src conteúdo total de Src /) versus linha de células de agressividade. Este último revela actividade específica Src é significativamente mais elevada em linhas celulares agressivos (CWR22Rv1, DU145, PC3) do que em linhas não agressivos /normais de células (PZ-HPV-7, RWPE1) (fig. 4, p = 0,0015).

(a), lisados ​​de células da próstata foram sondadas para o total de Src, pY416 e pY527 Src Src, onde α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. (B) As intensidades de cada banda dos western blots foram medidos e normalizados para o controlo α-tubulina correspondente, e, em seguida, em comparação com linha celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Comparação entre o não-cancro (PZ-HPV-7, RPWE1) e linhas celulares de cancro agressivo (CWR22Rv1, DU145, PC3) mostraram níveis reduzidos significativos de expressão de Src na segunda (p 0,001). Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e são a média com o SEM.

actividade específica de quinase de Src foi calculado dividindo-se a actividade de Src (Fig. 2) pelo teor total de proteínas Src (Fig. 3). actividade específica src é significativamente mais elevada em agressivo do que em linhas de células não-cancerosas (P 0,0001). As barras de erro são SEM.

Também examinamos o relacionamento, se houver, existe entre os níveis de pTyr-416 e pTyr-527 Src e atividade específica Src. A fosforilação em 416 é necessária para a activação completa da actividade de Src ao passo que a fosforilação em Tyr-527 é inibidor, devido à formação de uma interacção intramolecular que bloqueia a actividade de Src-quinase [1]. Ptyr-416 níveis fraccionárias (pTyr-416 /teor total de Src) (Fig. 5A) está altamente correlacionada com a actividade de Src específico (Fig. 4) (r = 0,89), sugerindo que pTyr-416 conteúdo é um bom barómetro da actividade de Src e linha de células de agressividade (Fig. 5A). No entanto, como se verá, esta correlação não se estende a todas as linhas celulares. Em contraste, pTyr-527 conteúdo, um indicador presumido de Src inibido, é mais pronunciado em linhas celulares agressivas (Fig. 5B). Esta observação é inconsistente com a noção geral de que activado Src se correlaciona com a linha de células de agressividade. Em resumo, o estado de fosforilação de Tyr-416 e Tir-527, tomados em conjunto, não fornecem uma imagem consistente de actividade de Src através de uma variedade de linhas celulares de CaP.

(a) níveis de pY416 foram derivados a partir da intensidades de bandas nas transferências de western (Fig. 3a), normalizados para o controlo α-tubulina correspondente, e, em seguida, em relação à linha celular RWPE1 (RWPE1 como 1). os níveis de (b) pY527 foram derivados das intensidades de bandas em transferências de Western (Fig. 3A), normalizados para o correspondente controlo α-tubulina, e, em seguida, em comparação com linha celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e estão apresentados como média com SEM. valores de p são indicados.

Src atividades, os níveis de expressão e fosforilação Estado em linhas de células de próstata RWPE1 Derivados

Além das linhas de células da próstata normais avaliadas na Fig. 2, 3, 4, e 5, foi avaliada uma série de linhas celulares que foram obtidas por exposição de RWPE1 a N-metil-N-nitrosoureia. As linhas celulares de aumentar a capacidade de invasão foram identificados por meio de uma série de

in vitro

e

in vivo

experimentos de seleção: RWPE1, WPE1-NA22, WPE1-NB14, WPE1-NB11 e WPE1-NB26 [ ,,,0],30]. Esta série mostra a actividade de quinase de Src e as correlações agressividade análogos aos descritos acima para as linhas de células da próstata normais. Em primeiro lugar, a actividade total de Src exibe uma tendência significativa na diminuição (p = 0,018) como uma função do aumento da agressividade linha celular (Fig. 6A). Em segundo lugar, com a excepção de WPE1-NB26, teor total de Src também diminui linearmente (p = 0,01) como uma função da linha de células de agressividade (Fig. 6B e Fig. S5). Em terceiro lugar, de novo com a excepção de WPE1-NB26, actividade específica de quinase Src (teor de actividade de Src-quinase /total de Src) exibe uma tendência crescente linear significativa (p 0,001) como uma função do aumento da linha de células de agressividade (Figura 6C.). Finalmente, em nítido contraste com os resultados apresentados na Fig. 5A, a correlação entre pTyr-416 níveis fracionados (pTyr-416 /conteúdo total de Src) e Src atividade específica é fraca (r = 0,58), sugerindo que é perigoso depender exclusivamente dos pTyr-416 conteúdo como um barômetro da atividade de Src (Fig. 6D). Curiosamente, nós observamos uma correlação muito forte no que diz respeito ao conteúdo pTyr527 fraccionada e actividade de Src específica em série RWPE1 de linhas de células (Fig. S6, r = 0,99), semelhante ao da fig. 5B (r = 0,88).

O aumento da capacidade invasiva é representada graficamente ao longo do eixo-x. (A), barras cinzentas são taxas de fosforilação do péptido 1 de lisados ​​de células inteiras (normalizado pelo conteúdo de proteína total). As barras brancas são as taxas de fosforilação por lisados ​​celulares devido a Src quinase Src sozinho após subtracção não-fosforilação de fundo 1. (b) Teor total de Src tal como determinado por análise de Western blot (Fig. S5) (c) actividade específica de Src-quinase tal como avaliado pela medida da actividade de Src (Fig. 6A) dividido teor de proteínas Src total (Fig. 6B). (D) os níveis de pY416 foram derivadas a partir das intensidades das bandas nas transferências de Western (Fig. S4), normalizados para o controlo α-tubulina correspondente, e, em seguida, em comparação com linha celular RWPE1 (RWPE1 como 1). Os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes e são apresentados como média com SEM.

ELISA- genérico e γ-

baseada 32P ATP-Discussão

[31] [32] métodos são duas das estratégias mais comuns utilizados para avaliar a atividade com a enzima puro sob

in vitro

condições. Além disso, os péptidos marcados com fluoróforo [33] – [37], bem como à base de proteínas GFP [38], [39], foram descritos que exibem uma resposta fluorescente para a fosforilação, permitindo assim a actividade de Src-quinase a ser continuamente amostrados em células vivas através de microscopia de fluorescência. Embora estas tecnologias de fornecer uma janela para a base bioquímica do comportamento das células, que são menos facilmente traduzidos para, uma metodologia multi-plataforma de rotina (enzima pura, lisados ​​de células, e células intactas), que também pode ser aplicado para o número limitado de células primárias disponível em amostras de doentes. A este respeito, um método de CE é ultra-sensível, através da qual pequenas quantidades de analitos são separados e quantificados, por meio da aplicação de um campo eléctrico e subsequente detecção dos analitos [40]. Uma vez que a Src quinase catalisa a transferência do grupo γ-fosforilo de ATP para o resíduo de tirosina do substrato, a diferença de carga entre o substrato e o produto deve permitir que essas espécies a serem separados, visualizado e quantificado através de um desvio na mobilidade electroforética [41 ] – [43]. Com efeito, o substrato de Src substituído com fluoresceína e um seu homólogo fosforilado são facilmente diferenciados mediante exposição a ambos os Src quinase puro (Fig. 1) e os lisados ​​de células de próstata (fig. 2). Neste último caso, em quase todas as linhas de células, a grande maioria da actividade observada fosfotransferase ( 70%) é devido ao Src quinase (Fig. 2). O ensaio CE foi ainda validado pelo exame da potência inibitória Src de saracatinib e imatinib, em que este último é de quatro ordens de magnitude mais fraca (

IC

50 = 24,4 mM) do que o anterior (

IC

50 = 2,7 nM) contra a enzima pura [28], [29]. Consistente com estes resultados, observou-se uma diferença na potência inibitória entre saracatinib (

IC

50 = 0,35 ± 0,08 mM) e imatinib ( 100 �) durante Src em DU145 lisados ​​celulares análogas à relataram diferença em condições de buffer simples. Finalmente, nós investigamos se a estratégia CE pode ser utilizada para observar a inibição da actividade de Src e em células individuais (Fig. S4). células DU145 foram microinjectados com Src substrato 1, as células subsequentemente incubadas durante 2 min, individualmente lisadas usando um laser de Nd focado: YAG laser, e, em seguida, o lisado proveniente de cada célula separadamente a electroforese. A formação do produto fosfopéptido foi observada a partir de células que não tinha sido pré-incubado com inibidor (14 ± 2% do teor total de péptido) ou em células pré-incubadas com 1 uM do inibidor fraco de imatinib (

IC

50 100? M; 15 ± 3% de teor total de péptido). Em contraste, nenhuma fosforilação péptido foi observada em células que tinha sido pré-incubado com 1 uM do inibidor potente saracatinib (

IC

50 = 0,35 ± 0,08 uM).

Com a capacidade para provar a actividade de Src usando enzima purificada, em lisados ​​celulares e em células individuais, examinámos actividade de Src a partir de linhas de células de próstata não invasivos, invasivas, e independente de androgénios (Fig. 2). Inesperadamente, verificou-se que a atividade de fosfotransferase Src é mais elevada nas linhas de células não-invasivos, o que parece ser contrária à noção geral de que a Src desempenha um papel importante na potenciação potencial metastático e a transição para e manutenção de crescimento independente de andrógeno no cancro da próstata. No entanto, ocorreu-nos que os níveis de Src quinase pode diferir entre as linhas celulares. Mais uma vez, de forma inesperada, verificou-se que linhas de células invasivas e independente de androgénios exibem significativamente menos do que os seus homólogos de Src dependentes de androgénio não-invasiva (Fig. 3). Por outro lado, a proporção de actividade de Src para o conteúdo de Src (actividade específica) revelou que as linhas celulares agressivos e independente de androgénios exibir uma actividade específica mais elevada do que as linhas de Src não agressivos dependentes de androgénio celulares (Fig. 4). Além disso, esta tendência se mantém para a série de linhas celulares de N-metil-N-nitrosoureia derivados de RWPE1 (a partir da zona periférica de uma próstata humana normal). Especificamente, observou-se diminuição da actividade total de Src e teor de Src, e actividade específica aumentada de Src como uma função do aumento da capacidade de invasão linha celular (RWPE1 WPE1-NA22 WPE1-NB14 WPE1-B11) (Fig 6A-B.). Fazemos notar uma exceção a essa correlação, ou seja, a linha de células RWPE1 derivado mais agressivo, WPE1-NB26. Este último tem recebido atenção significativa, devido ao seu fenótipo altamente invasivo [30], [44] – [53]. Usando conteúdo Src total e a actividade específica como medidas de agressividade, teríamos atribuído um fenótipo não-invasivo para WPE1-NB26 (isto é, semelhante ao da linha de células progenitoras RWPE1). No entanto, uma vez que este é claramente errada, a agressividade associada com esta linha de células de N-metil-N-nitrosoureia pode ser devido, pelo menos em parte, de mecanismos que são independentes da sinalização Src.

Porque é o total teor de src diminuiu nas linhas celulares mais agressivos? Uma explicação possível é a sensibilidade conhecida de Src activado, em relação ao seu homólogo não-activado, a degradação mediada por ubiquitina [54], [55]. Consequentemente, as linhas celulares que estão sob intensa pressão Src activado pode, ironicamente, apresentar menor teor de Src do que as células menos agressivas. Além disso, dois estudos recentes sugerem um mecanismo dependente de micro-ARN (MIR), pela qual os níveis de Src são regulados. Bhatnagar

et ai mostraram que quanto mais invasiva a linha de células de próstata quanto maior o nível de miR-205 [48]. miR-205 é conhecida para regular negativamente a expressão de Src [56]. A nossa observação de que os níveis de Src são menores em linhas de células de próstata agressivo é consistente com os dois mecanismos de miRNA ubiquitina e. Além disso, a actividade específica mais elevada nas linhas de células mais agressivas indica que, nestas células, embora haja menos Src presente, uma maior fracção de ele reside na forma activa.

estado de fosforilação de Src tem sido assumido correlacionar com actividade onde pTyr-416 é tomado como formas activas como inactivos e pTyr-527 da enzima. Com isto em mente, nós medimos os níveis de pTyr-416 via análise de Western blot e plotados pTyr-416 Src total /Src (fractional pTyr-416) versus linha de células de agressividade. Como é evidente a partir da Fig. 5A e 6D, linhas celulares altamente agressivos exibir uma maior proporção de pTyr-416 para totalizar Src do que as suas contrapartes não agressivas. Isto é consistente com um relatório recente da Evans e colegas demonstrando que o saracatinib inibidor de Src é mais eficaz contra linhas de células de próstata que têm a maior proporção de Src activa em relação ao total [57]. Neste último estudo, “Src activa” foi feita para ser pTyr-Src 416. Estes investigadores também relataram que as células com os menores índices (pTyr-416 Src /Src total) expressar o mais Src.

A alta pTyr-527 /rácio de Src deve ser, de acordo com o modelo convencional, indicativa de uma fração menor geral de enzima activa. No entanto, descobrimos que essa proporção é mais elevada em linhas agressivas, bem como (Fig. 5B e Fig. S5). Uma possível explicação para este resultado inesperado é a conhecida capacidade da enzima Src pTyr-527 para ser activado pelos péptidos fosforilados e proteínas. Em suma, embora pTyr-527 Src está inativo na sua forma isolada, purificada, o oposto pode ser verdade quando potenciais parceiros de ligação fosforilados estão presentes. Por conseguinte, conclui-se que os níveis de pTyr-Src 527 não são um barómetro útil de Src inactiva e, em vez disso, pode na verdade ser um prognosticador mais apropriada de actividade de Src. Como um aparte, nota-se que as transferências de Western empregados neste estudo para detectar o estado de fosforilação Src usado populações de células grandes. No entanto, os avanços recentes, impulsionada pela tecnologia CE, permitir que o estado de fosforilação de proteínas a ser resolvido e detectada a partir de tão poucos como 25 células [58]. Com efeito, CE como um sistema de transferência de Western em microescala tem recebido atenção significativa [59]. Por conseguinte, pode vir a ser viável para provar simultaneamente os níveis de enzimas fosfo-isoformas específicas, bem como a atividade enzimática em algumas células usando a tecnologia CE.

Não foi e continua a ser um esforço hercúleo para identificar CaP marcadores que se correlacionam com hereditariedade bem como mutações somáticas. Por exemplo, mais de 40 loci de susceptibilidade foram atribuídos a cerca de 25% do risco hereditárias. [60] Além disso, tanto a região codificadora e análises do genoma inteiro foram realizados para identificar aberrações genéticas que se correlacionam com CaP somaticamente adquirido. Por exemplo, um estudo recente todo genoma foi realizada utilizando amostras tumorais de pacientes com PAC agressivo. Estes investigadores identificaram quase 4.000 mutações de base somática e 90 rearranjos cromossômicos por tumor, bem como correlações entre uma matriz de pontos de interrupção de rearranjo e várias marcas epigenéticas. [61] Os autores observam que um “espectro de mecanismos de gênese do câncer de próstata direta e progressão” [61] e, portanto, nenhuma alteração única em atividade enzimática é responsável pelo aparecimento, progressão e /ou agressividade da doença. Por exemplo, os rearranjos genômicos complexos prevalentes em Cap são pensados ​​para colidir com a eliminação e amplificação de uma matriz de genes que codificam supressores de tumor conhecidos e oncogenes, respectivamente. No entanto, nossos dados sugerem que a atividade específica Src pode servir como um barômetro de Cap agressividade. Esta é provavelmente uma consequência do facto de a própria Src é um participante-chave nas vias que medeiam o crescimento celular e motilidade, que por sua vez pode refletir as mudanças estruturais genómicas maciços e complexos prevalentes no PAC. Além disso, embora descobrimos que pTyr-416 Src total /Src é um indicador confiável da atividade específica Src, os resultados com pTyr-527 são, à primeira vista, inesperado. Fosforilada Tyr-527 é geralmente considerada como reflexo da enzima inativa. No entanto, descobrimos que a proporção de pTyr-527 /total de Src é um mau indicador do

em

Src activa em linhas celulares PAC. Em vez disso, esta última razão parece ser muito melhor preditor de Src activa. De um ponto de vista mecanicista, isso pode refletir a presença de proteínas fosforiladas que podem ser associadas a (via domínio SH2 de Src) e, assim, activar rapidamente a enzima inibida. Consequentemente, o estatuto de pTyr-527 Src atividade deve ser visto como “preparado para a atividade” em vez de estaticamente inativo.

Em resumo, temos desenvolvido um sistema de detecção de atividade sensível e selectivo quinase Src. Usando uma série de linhas de células de próstata não agressivos, agressivos, e andrógeno-independente, descobrimos que a actividade total Src diminui em função do aumento da próstata linha celular agressividade. Fmoc-Orn(Aloc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Tyr(PO(OBzl)OH)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Orn(Aloc)-amide-Resin