Abstract

Objectivo

carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é um câncer prevalente, especialmente nos países em desenvolvimento. As antraciclinas e os seus derivados de antraquinona, tais como a doxorubicina, apresentam um efeito inibidor do crescimento de células e têm sido usados ​​como drogas anti-cancro durante muitos anos. No entanto, a cardiotoxicidade de antibióticos de antraciclina é uma grande preocupação na sua aplicação clínica. NSC745885 é um novo composto sintetizado a partir de 1,2-diaminoantraquinona, que, subsequentemente, reage com cloreto de tionilo e trietilamina. O presente estudo teve como objetivo investigar o potencial câncer de anti-oral ea segurança de NSC745885.

Métodos

Nós investigamos o potencial anti-câncer do NSC745885 em linhas celulares de carcinoma epidermóide de boca e em um

in vivo

câncer oral rato modelo de xenotransplante. A expressão de genes relacionados apoptóticas foram avaliadas por em tempo real de RT-PCR e bloting ocidental, e

in vivo

avaliação do marcador de apoptose foi medida por coloração imuno-histoquímica. A eficiência anti-tumor e de segurança entre a doxorubicina e NSC745885 também foram comparados.

Resultados

Os nossos resultados demonstraram que NSC745885 exibe actividade anti-cancro oral, através da indução de apoptose em células cancerosas e em tumores -bearing ratos, e este tratamento não induziu toxicidade significativa em camundongos experimentais. Este composto também exibe uma eficiência anti-tumor comparável e uma maior segurança em camundongos experimental quando comparado a doxorrubicina.

Conclusões

Os dados deste estudo fornecem evidência para NSC745885 como um potencial romance drogas terapêuticas para o tratamento de CCEO humana

Citation:. Chen YW, Huang HS, Shieh YS, Ma KH, Huang SH, Hueng DY, et al. (2014) um novo composto NSC745885 exerce um efeito anti-tumoral do cancro na língua SAS células in vitro e in vivo. PLoS ONE 9 (8): e104703. doi: 10.1371 /journal.pone.0104703

editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Janeiro, 2014; Aceito: 16 de julho de 2014; Publicação: 15 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan, ROC (NSC101-2320-B-016-016 para G.-J. Lin e NSC102-2314-B-016-018-MY3 para Y.-W. Chen), Tri-Service Hospital Geral, República da China (Grant Não . TSGH-C102-019, TSGH-C100-034 e TSGH- C101-009-S06) e em parte pelo CY Fundação para o Avanço da Educação, Ciência e Medicina. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Entre carcinomas de células escamosas orais (epidermóide estudados), a grande maioria dos tumores malignos são cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCCs). CEB é o sexto tipo de câncer mais prevalente em todo o mundo [1], e o terceiro câncer mais comum em países em desenvolvimento [2] – [4]. As terapias tradicionais para CEB incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, o efeito corrector de tais terapias de câncer de boca em estágio final é uniformemente pobres. Além disso, mesmo após a ressecção do tumor bem sucedida, aproximadamente 20% dos pacientes podem apresentar recorrência de tumores em outro local [5]. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para tumores orais malignas é uma questão urgente.

As antraciclinas e suas crescimento celular efeitos inibidores derivados de antraquinona expor e têm sido usados ​​como drogas anti-câncer há mais de 30 anos [6]. A daunorubicina e a doxorubicina, dois antibotics antraciclina, são frequentemente utilizados para o tratamento de leucemia mielóide aguda, bem como diversos tumores sólidos [7]. Estudos anteriores relataram que essas drogas induzem a apoptose em células tumorais [8], [9]. As acções citostáticos e citotóxicos destas drogas têm sido observados através da inibição da topoisomerase II e, subsequentemente, o início de lesões do ADN [10]. O dano oxidativo tem sido considerada um mecanismo crítico na actividade anti-tumoral de antraciclina [11]. antibióticos de antraciclina também demonstram a capacidade de reduzir a atividade da telomerase e expressão hTERT. tratamento com doxorrubicina induz a senescência na linha celular de células de tumor da mama MCF-7 através do aumento da actividade de p53, e reduz a actividade da actividade da telomerase presente na célula cancerosa [12]. Um estudo anterior relatou que a actividade de telomerase e a expressão de ARNm da hTERT foram inibidas por tratamento doxorrubicina em linhas celulares de carcinoma gástrico pai mas não em linhas de células resistentes à doxorrubicina-[13]. Os resultados destes estudos sugeriram um efeito de antraciclinas na inibição da actividade da telomerase, e este efeito contribui para a actividade anti-tumoral destes fármacos.

Embora os antibióticos de antraciclina, foram utilizados como fármacos anti-cancro para muitos anos, a sua cardiotoxicidade levanta uma preocupação terapia clínica [14]. As características de cardiomiopatia induzida pelas antraciclinas nas biópsias de pacientes tratados incluem a perda de miofibrilas, dilatação do retículo sarcoplasmático, vacuolização citoplasmática, um aumento do número de lisossomos, e inchaço da mitocôndria em cardiomiócitos [15]. Estudos anteriores demonstraram que o desenvolvimento de cardiomiopatia no tratamento de doxorubicina está associada com a dose administrada [16]. Este efeito secundário tipicamente ocorre dentro de 1 ano; No entanto, também pode ocorrer vários anos mais tarde, durante a administração do fármaco. Além disso, as antraciclinas também pode levar a infrequentes (menos de 1%) cardiotoxicidade aguda (geralmente ocorrer dentro de 1 semana) [17]. Por conseguinte, o desenvolvimento de um novo medicamento eficaz exercendo um efeito anti tumor, mas que apresenta um efeito colateral menor, tais como cardiotoxicidade, se continua a ser procurado a terapia do cancro.

NSC745885 é um novo composto desenvolvido em 2009. Este composto foi sintetizado a partir de 1,2-diaminoantraquinona, que, subsequentemente, reage com cloreto de tionilo e trietilamina [18]. Um estudo anterior descobriu que NSC745885 exibe um efeito anti-câncer, quando foi usada a tela principal linha 60 celular do Instituto Nacional do Câncer (NCI). Os resultados indicaram que a leucemia, melanoma, e linhas de cancro do ovário foram altamente sensíveis à NSC745885. câncer não pequenas células do pulmão, cancro do cólon, neuroblastoma, cancro da próstata e células de cancro da mama linhas também são sensíveis a este composto. Além disso, este estudo anterior também relatado que NSC745885 é eficaz na supressão do crescimento de células em várias linhas celulares de cancro, o que é parcialmente alcançados pela capacidade inibidora na actividade de telomerase nessas células [18]. No entanto, o

in vitro

anti-câncer potencial e o

in vivo

actividade deste novo composto no câncer oral não foi explorada.

Neste estudo, nós investigamos o potencial anti-câncer do NSC745885 em linhas celulares de carcinoma epidermóide de boca e em um

in vivo

câncer oral rato modelo de xenotransplante. Além disso, também avaliou a toxicidade de NSC745885 em outros órgãos dos ratos tratados. Nossos resultados demonstraram que este novo composto induziu apoptose das células cancerosas orais quer no

in vitro cultura de células

ou no

in vivo

xenoenxerto mouse modelo tumor. Além disso, também descobrimos que

in vivo

tratamento de NSC745885 provocou nenhuma citotoxicidade no baço, pulmão, fígado ou coração dos animais experimentais. A descoberta do nosso estudo sugere que NSC745885 poderia ser utilizado como uma droga eficaz para a terapia do cancro por via oral, e este tratamento pode apresentar um nível mais alto de segurança do que os antibióticos de antraciclina tradicionais fazem.

Materiais e Métodos

células e substâncias químicas

SAS foi obtida a partir de um carcinoma pouco diferenciado humana de células escamosas [19]. Esta linha celular foi fornecida pelo Dr. Jeng-Fan Lo, do Instituto de Biologia Oral, Departamento de Odontologia da Universidade Nacional Yang-Ming, Taiwan [20]. OECM-1 foi obtido a partir de carcinoma epidermóide gengival de um paciente de Taiwan. SCC4 e SCC25 foram obtidos a partir de células de carcinoma escamoso da língua. Todas as linhas celulares foram mantidas num meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, e 1% de penicilina /estreptomicina. MRC-5 de células é uma linha celular de fibroblastos de pulmão fetal humano normal (ATCC N: CCL-171) mantido num Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com soro de bovino fetal a 10%, 2 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, e 1% de penicilina /estreptomicina. NSC745885 [18] foi fornecida pelo Dr. Hsu-Shan Huang do Departamento de Farmácia, National Defense Medical Center, Taiwan.

Crescimento Ensaio de Inibição de

As células na fase de crescimento logarítmica foram cultivadas em uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços. As células foram expostas a várias concentrações de NSC745885 durante 24, 48 ou 72 horas. Um ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma, St Louis, MO, EUA) foi utilizado para avaliar o efeito de NSC745885 sobre o crescimento celular, como descrito anteriormente. A IC

50 valor resultou de 50% de inibição do crescimento das células, o qual foi calculado graficamente como uma comparação com o crescimento de controle.

coloração Anexina V

As células foram lavadas com PBS e ressuspensas em 1 X Binding buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA). As células ressuspensas foram coradas com FITC-anexina V conjugada (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) e a percentagem de células positivas anexina V-foi analisada por citometria de fluxo.

quantitativa PCR em Tempo Real

o ARN total foi isolado utilizando o método de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e a homogeneização das células cancerosas em tampão de lise Trizol foi seguido de extracção com clorofórmio (Life Technologies). Para a síntese de cDNA, 5 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa a 50 ° C durante 60 minutos, utilizando 200 unidades de Superscript III transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). pares de primers para caspase-3 (sentido 5′-CTG GAC TGT GGC ATT GAG AC-3 ‘; antisense 5′-ACA AAG CGA CTG GAT GAA CC-3′), XIAP (sentido 5’- GAC AGT ATG CAA GAT GAG TCA AGT CA-3 ‘; antisense 5′-GCA AAG CTT CTC CTC TTG CAG-3′) e GAPDH (sentido 5’-GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3 ‘; antisense 5’-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3 ‘) foram usadas para a amplificação do gene. O kit mestre de mistura SYBR Green /qPCR ROX (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, EUA) foi utilizado para todas as reacções com a reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Resumidamente, a PCR foi realizada como se segue: um ciclo a 50 ° C durante 2 minutos, um ciclo de 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 15 segundos cada, a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C. Os dados foram obtidos em triplicado e normalizadas com a expressão de GAPDH.

Extracção de proteínas e Western Blot Analysis

A proteína foi extraído a partir de uma célula cultivada (SAS) lisadas num lise de células contendo inibidores de protease (50 mmol /L de Tris (pH 7,5), 30 mmol /L de MgSO

4, 8 mmol /L de EDTA, 2 mmol /L de DTT, e 2% de Triton X-100). Os lisados ​​celulares foram clarificados por centrifugação a 13000 rpm, a 4 ° C durante 15 minutos. As concentrações de proteína dos lisados ​​celulares foi medida utilizando um ensaio de BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). A análise Western blot foi efectuada utilizando 50 ug de proteína a partir de extractos de células cancerosas de controlo e as células tratadas com NSC745885 foram carregados e separados utilizando 8% de dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida. Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para uma membrana de polyvinyldifluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA), que foi então bloqueada com uma solução de bloqueio contendo leite em pó a 5% não gordo em PBS mais 0,2% de Tween 20 (PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após o bloqueio foi completada, a membrana foi lavada 3 vezes com PBST. A membrana de PVDF foi transferida com os seguintes anticorpos primários em PBS: anti-XIAP; caspase-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA); e anti-actina (Sigma, St Louis, MO, EUA). Após 2 horas à temperatura ambiente, a membrana foi novamente lavada em PBST. A membrana de PVDF foi então incubadas com anti-ratinho ou anti-coelho IgG ligada com peroxidase durante 1 hora, desenvolvido utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA, EUA), e analisadas com um sistema de imagem Las-3000 ( Fujifilm, Tóquio, Japão).

xenoenxerto de tumor Modelo rato

NOD com oito semanas de idade /SCID (NOD.CB17

Prkdc

scid /J, National ratos de laboratório Centro animal, Taiwan) foram mantidas em micro-isoladores em condições livres de patógenos específicos e alimentos estéril Fed e água estéril clorada. Dezoito ratos foram divididos em 2 grupos, e cada grupo de ratinhos foi injectado por via subcutânea com 3 × 10

6 SAS. Nove ratos em cada grupo foram ainda tratados com NSC745885 ou doxorubicina (2,0 mg /kg PC /d /i.p.), E 9 ratinhos em cada grupo foram injectados diariamente com um veículo de controlo. NSC745885 foi injectado em primeiro lugar em cada grupo de ratinhos no dia 3, antes de qualquer tumor foi palpado e continuamente administrado até 10 dias em ratinhos SAS-rolamento. O tamanho dos tumores transplantados foi medida em cada terceiro dia usando pinças calibrados, e o volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: Volume (V) = 1/2 × (comprimento x largura

2). No final do tratamento, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram removidos, pesados, e fotografados.

Ética declaração

Todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com directrizes institucionais e foram aprovados pela animal Care Institucional da NDMC e do Comitê Use. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais experimentais. (Número de aprovação: IACUC-11-044)

imuno coloração

coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o método de avidina-biotina descrito como se segue. As secções de tecido foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em álcool. A recuperação de antígenos foi realizada através de incubação em 0,01 mol /L de tampão citrato (pH 6,0) a 95 ° C durante 40 minutos num banho de água. A peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 30 minutos. As secções foram então incubadas com soro normal de cavalo a 5% em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente para bloquear uma reacção não específica de anticorpos. Após a lavagem com TBS e 0,1% de Tween 20, as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com a caspase-3 anti-humano e um anticorpo de XIAP (DAKO, Osaka, Japão). Depois de ser lavado em TBS e 0,1% de Tween 20, as secções de tecido foram incubadas durante 40 minutos à temperatura ambiente com IgG anti-ratinho biotinilada, seguido de um complexo de (estojo Elite ABC Vecstatin avidina-biotina-peroxidase, Vector Laboratories, Inc., Burlingame , CA) durante 40 minutos. Subsequentemente, as secções de tecido foram coradas com 0,003% de 3,3-diaminobenzide tetrahidrocloreto e 0,005% de peróxido de hidrogénio em 0,05 mol /L de Tris-HCl (pH 7,2), contra-coradas com hematoxilina de Mayer, desidratados, e montado.

Avaliação da imuno-coloração

um procedimento imuno-histoquímico, sem a adição do anticorpo primário foi usado como um controlo negativo em cada caso. A intensidade da caspase-3 e XIAP imunorreactividade das células tumorais foram marcados em 3 grupos, e padronizado de acordo com o nível de coloração como um controlo interno positivo numa escala de 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (moderada coloração), e 3 (intensidade mais forte). A distribuição de caspase-3 e rotulagem de XIAP também foi medida como função da percentagem de células de tumor coradas positivamente (de 0 a 100) no volume total do tumor em cada secção. Para avaliar as áreas de distribuição de expressões XIAP caspase-3 e mais fácil e eficaz, 50% foi considerado o ponto de corte. Para comparar o controlo e grupo tratado com NSC745885, a percentagem de células de caspase-3 e XIAP-positivos em cada intensidade foi multiplicada pela intensidade correspondente (0-3) para se obter uma pontuação de imunocoloração variando de 0 a 300.

análise

estatística

o Statistical Package for social Sciences (SPSS versão 10.0 para Microsoft Windows, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para completar a análise dos dados recolhidos. A

t

análise -teste e one-way de variância (ANOVA) com o teste post-hoc de Scheffe foram usadas para determinar se quaisquer relações significativas existia entre os resultados quantitativos. Os valores de

P Art 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

inibidor do crescimento Efeito da NSC745885 em linhas celulares de cancro oral

Para examinar a influência do tratamento NSC745885 em carcinoma de células escamosas oral, que tratou o SAS células cancerosas por via oral com várias concentrações de NSC745885 durante 24 horas e observadas as suas alterações morfológicas utilizando um microscópio de contraste de fase. O tratamento de NSC745885 nas concentrações de 3 uM a 5 uM diminuiu significativamente as densidades de células de cultura quando comparada com células não tratadas (Fig. 1A). Para avaliar o efeito inibidor do crescimento de NSC745885, as células SAS foram realizados com várias doses de NSC745885, e os números de células sobreviventes foram medidos em diferentes pontos no tempo e comparada com as de células não tratadas pelo ensaio de MTT. Os números de células sobreviventes SAS foram significativamente reduzidos após o tratamento NSC745885 em modos tempo e dependente da dose (Fig. 1B-1D). A IC

50 de NSC745885 foi de 0,85 uM em células SAS após 72 horas de tratamento (FIG. 1D). Estes resultados indicaram que NSC745885 demonstrado um efeito inibidor do crescimento ou um efeito de promoção da morte das células em SAS. Para detectar células apoptóticas SAS, foi realizada a coloração de anexina V para avaliar as proporções de anexina V positiva sob várias doses de tratamento NSC745885 às 24 horas. As percentagens de células positivas para anexina V foram aumentadas de um modo dependente da dose (Fig. 2A-2E). Existem diferenças significativas quando a dosagem de tratamento foi maior do que 0,5 uM (Fig. 2F). Este resultado indicou que o tratamento NSC745885 apoptose induzida no início de células SAS.

(A) As alterações morfológicas nas células SAS. As células foram tratadas com as doses indicadas de NSC745885 durante 24 horas. Dosagens superiores a 3 μΜ causou a morte celular nas células SAS. A sobrevivência das células tratadas NSC745885 SAS foi avaliada pelo ensaio MTT em momentos diferentes e dosagens. (B) às 24 horas após o tratamento, a sobrevivência das células SAS mostrou uma diferença significativa nas dosagens superiores a 1? M. (C) pelo tratamento de 48 horas, em 1? M ou maior do que as dosagens de NSC745885 exibiu um efeito significativo anti-cancro. (D) Depois de 72 horas de tratamento, o valor de IC50 de 0,85 uM foi NSC745885 em células SAS. Survival proporção (%) indicou o valor relativo em comparação com grupos de controle do veículo em SAS (n = 3; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001;. NS, não significativo).

células SAS foram tratadas com (a a E) indicaram doses de NSC745885 por 24 horas. As células recolhidas foram coradas com FITC-anexina V conjugada e analisadas por citometria de fluxo. (F) As percentagens de células positivas anexina V em tratamento NSC745885 foram comparados com controles de veículos (0 ^ M) (n = 3; **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, não significativo.).

Além disso, nós também examinou o efeito inibidor do crescimento em outras linhas celulares de cancro orais, incluindo OECM-1, SCC25 e SCC4. Descobrimos que NSC745885 também exibiu um efeito inibidor do crescimento significativo nas células OECM-1, em doses de 1 uM ou superior a 24 ou 48 horas após o tratamento com fármaco (Fig. 3A e 3B). Este composto exibiu uma eficácia ainda maior inibidora em células SCC4 (Fig. 3C e 3D). Por outro lado, existem diferenças significativas apenas a 4 mM em SCC25 células em 24 ou 48 horas (Fig. 3E e 3F). A fim de investigar a influência de NSC745885 em tecidos normais, que também avaliado o efeito citotóxico deste fármaco em células MRC-5 (uma linha de células normais de fibroblasto de pulmão fetal humano) [21]. Os nossos resultados indicaram que apenas a concentrações elevadas de NSC745885 (4 uM) afectar significativamente o crescimento de células MRC-5 (Fig. 3G e 3H), indicando que NSC745885 exibe uma especificidade para as células cancerosas.

células cancerosas Oral ( OECM-1, SCC4, e SCC25) e de fibroblastos normais do pulmão de células MRC-5 foram tratados com NSC745885 durante 24 ou 48 horas com concentrações indicadas. A viabilidade destas linhas celulares foram avaliadas pelos resultados de MTT assay.The indicaram que concentrações micromolares de baixo NSC745885 morte celular induzida por (A) SAS mas não afectou o crescimento de (G e H) de células MRC-5 (n = 3; * , P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, não significativa)

NSC745885 tratamento induz a apoptose de células SAS

.. para examinar o efeito de NSC745885 na indução de apoptose em células de SAS, as células foram tratadas com várias doses de NSC745885 durante 24 horas, e os níveis de caspase-3 expressão de ARNm foram medidos utilizando em tempo real de RT-PCR. O nosso resultado indicou que a expressão da caspase-3 foi significativamente aumentada com o tratamento NSC745885 de um modo dependente da dose (Fig. 4A). Os níveis de proteína de caspase-3 e caspase-3 clivada nas células SAS também foram determinados utilizando Western blot. Houve aumentos significativos em caspase-3 e caspase-3 clivada durante o tratamento com concentrações superiores a 1 uM (Fig. 4B). Os níveis de proteína relativas entre as várias doses foram comparadas usando um medidor de densidade, apresentando resultados consistentes com a observação direta no western blot (Fig. 4C e 4D). Estes dados indicaram que o tratamento NSC745885 induzida a apoptose das células SAS.

(A) O nível de expressão de ARN relativa da caspase-3 na célula SAS tratados com dosagens indicadas de NSC745885 durante 24 horas foi avaliada utilizando-tempo real RT-PCR. A expressão da caspase-3 aumentou significativamente com o tratamento NSC745885 de um modo dependente da dosagem. (B) A níveis de proteína caspase-3 clivada da caspase-3 e nas células tratadas com SAS NSC745885 durante 48 horas foi quantificada utilizando Western blot. (C) Os resultados do Western blot em caspase-3 foram avaliadas em 3 experiências independentes e normalizado com β-actina (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ns., não significativa). O nível de proteína de caspase-3 foi mais elevada em 1,5 μΜ de tratamento NSC745885. (D) Os resultados do Western blot em caspase-3 clivada, foram avaliados em 3 experiências independentes (*, P 0,05;. NS, não significativo).

NSC745885 Diminui o ARN e a expressão da proteína XIAP em células de SAS

o inibidor ligada ao X de proteína apoptose (XIAP) tem sido identificada como uma proteína anti-apoptótica, em células de mamíferos [22]. Ela desempenha um papel crítico na inibição da apoptose em ambas a morte mediada pelo receptor e vias mediadas por mitocôndrias [23], [24]. Um estudo recente demonstrou ainda que XIAP é um preditor de resposta à quimioterapia e prognóstico para pacientes de cabeça e pescoço câncer avançado [25]. Portanto, também analisamos o efeito de NSC745885 no gene de XIAP e de expressão de proteínas em células de cancro oral, nós tratamos as células SAS cancerosas com diferentes concentrações (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 uM e 2,0 uM) durante 24 horas e, em seguida determinada a sua mudança na expressão do gene, utilizando a Q-PCR. Em comparação com as células de controlo, o gene de XIAP expressão diminuiu significativamente com o tratamento NSC745885 de um modo dependente da dose (Fig. 5A). Também as células cancerosas tratadas com diferentes concentrações de SAS (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 uM, e 2,0 uM) durante 48 horas, e, em seguida, determinada suas mudanças da expressão da proteína, utilizando Western blot. Uma diminuição significativa na XIAP foi observada durante o tratamento com concentrações superiores a 1 uM (Fig. 5B). Os níveis de proteína relativas entre as várias doses foram também comparados usando um medidor de densidade, apresentando resultados consistentes com a observação direta no western blot (Fig. 5C). Estes resultados indicaram que a NSC745885 exibiu um efeito indutor de apoptose nas células SAS.

O nível de expressão de ARN de XIAP em relação SAS células tratadas com doses indicadas de NSC745885 foi avaliada às 24 horas utilizando-tempo real RT- PCR. A expressão de XIAP diminuiu significativamente com o tratamento NSC745885 de uma forma dependente da dose. (B) A expressão de XIAP em células tratadas com SAS NSC745885 foi quantificada utilizando Western blot em 48 horas de tratamento. (C) Os resultados de Western blot foram avaliadas em 3 experiências independentes e normalizado com β-actina (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001). O nível de proteína XIAP de redução de uma forma dependente da dose.

NSC745885 Inibe SAS Crescimento Celular

in vivo

Para avaliar o potencial anti-tumoral de NSC745885 em câncer bucal

in vivo

, realizamos este tratamento em um modelo de rato portador de tumor xenoenxerto. As células foram inoculadas em SAS ratinhos NOD /SCID e NSC745885 foi injectada no dia 3 em cada grupo de ratinhos, antes de qualquer tumor foi palpado, e administrado diariamente até ao dia 10 em murganhos portadores. O tamanho do tumor foi reduzido nos ratos tratados em comparação com os ratinhos de controlo que possuem tumores que foram tratados com o veículo por si só (Fig. 6A). Os xenoenxertos SAS reduzida em peso, 23 ± 10,39% com o tratamento NSC745885 (Fig. 6B). Os pesos do corpo do controlo e murganhos tratados com NSC745885 também foram avaliadas no dia 1 e 10 após a administração da droga. Não existiam diferenças significativas no peso do corpo do controlo ou ratinhos tratados NSC745885 (Fig. 6C). Estes resultados indicaram que o tratamento NSC745885 a 2 mg /kg exibiu um efeito anti-cancro oral, e este tratamento não conduziu a toxicidade significativa em ratinhos experimentais.

(A) ratinhos A célula de cancro implantado NOD /SCID foram administrados com NSC745885 (2 mg /kg /d). tumores enxertados foram isolados no dia 10 após a administração da droga. NSC745885 tratamento reduziu significativamente o tamanho do tumor, quando comparado com o controlo de veículo. (B) O peso médio do tumor foi comparado entre o NSC745885-tratados e tratados com PBS ratinhos portadores de tumores no Dia 10 (n = 9; *, P 0,01). (C) O peso corporal dos camundongos experimental não diminuiu significativamente com o tratamento NSC745885 comparação com o PBS tratados controles.

NSC745885 induzir a apoptose em células de tumor xenoenxerto

Para observar diretamente o efeito apoptótico de NSC745885 em células tumorais in

in vivo

, foi realizada a coloração imuno-histoquímica para avaliar o estado da proteína caspase-3 apoptótica em xenoenxertos. Depois de 10 dias após o transplante, os xenoenxertos foram removidos, medido por tamanho, e examinadas com HE e coloração imuno-histoquímica. Os tumores dos murganhos tratados com NSC745885 exibiam lesões de tecido em parte do tumor (Fig. 7A) e um marcadamente maior contagem de células apoptóticas de células positivas para (caspase-3), em comparação com os tumores de controlo (Fig. 7B). Também avaliamos a expressão de XIAP nos xenoenxertos. O resultado revelou que os ratinhos tratados com NSC745885 exibiu uma contagem significativamente inferior de células anti-apoptóticas (células positivas para XIAP) em comparação com os tumores de controlo (Fig. 7C). As pontuações dos 3 caspase-células positivas de expressão foram de 1,21 ± 0,04 e 2,87 ± 0,03 no grupo controle e grupo tratado com NSC745885, respectivamente (Fig. 7D). Os escores das células positivas XIAP de expressão foram de 2,24 ± 0,03 e 1,16 ± 0,02 no grupo controle e grupo tratado com NSC745885, respectivamente (Fig. 7E). Por conseguinte, os nossos resultados demonstraram que NSC745885 reduz a proliferação de células cancerosas SAS, e exerceram efeito anti-tumoral

In vivo

através da indução de apoptose.

(A) As alterações histológicas em enxertos tumorais foram avaliados utilizando a coloração HE. Comparando-se o controlo de PBS com os grupos tratados com NSC745885 revelou uma acentuada necrose tumoral no grupo tratado com NSC745885. (B) O nível de expressão da caspase-3 em enxertos tumorais isoladas foram avaliadas utilizando coloração imuno-histoquímica. (C) O nível de expressão de XIAP em enxertos tumorais isoladas também foram avaliados utilizando a coloração imuno-histoquímica. As pontuações de expressão para a caspase-3 (D) e de XIAP, (E) foram quantificados, revelando um aumento da expressão da caspase-3 com o tratamento NSC745885 (P 0,05). Por outro lado, a expressão de XIAP em enxertos de tumor diminuiu com este tratamento (P 0,05).

Efeitos de NSC745885 em Peso Corporal em camundongos

Para determinar se as causas de tratamento NSC745885 perda de peso corporal, que monitorizada a alteração de peso corporal nos ratinhos experimentais. Um efeito citotóxico significativo de NSC745885 foi revelado com a administração diária de NOD /SCID, a uma dosagem de 40 mg /kg /d (Fig. 8A). O peso corporal dos ratinhos tratados com a dose mais elevada foi significativamente diminuída, e todos os ratinhos morreram pelo dia 14. Neste estudo, verificou-se que a dose máxima tolerada de NSC745885 em ratinhos foi de 40 mg /kg /d. Para determinar se o tratamento NSC745885 citotoxicidade nos órgãos dos ratos experimentais criado, os baços, fígados, pulmões, e os corações foram colhidas a partir de ratinhos tratados com PBS-e NSC745885-tratados no dia 14 e foram avaliados utilizando um ensaio histológico. Não existiram diferenças óbvias nos órgãos de ratos PBS-tratados ou NSC745885-tratados (Fig. 8B-8E). Este resultado indicou que o tratamento diário de NSC745885 a 2,0 mg /kg /d i.p. eliciada sem efeitos adversos acentuados nos ratinhos.

ratinhos NOD (A) /SCID foram tratados com PBS ou indicado de dosagens diárias de NSC745885, e os pesos corporais dos ratos foram medidos. A influência do tratamento sobre os órgãos NSC745885 dos ratinhos experimentais foi avaliada utilizando um ensaio histológico e coloração HE no Dia 14. Não existiram diferenças óbvias na (B) baço, (C) do pulmão, (D) fígado, ou (E) coração de ratos PBS-tratados e tratados com NSC745885.

comparações da segurança e da eficiência anti-tumor entre NSC745885 e doxorrubicina

Para comparar a segurança de NSC745885 com doxorrubicina, nós NOD tratados /SCID com estes dois compostos a 2 mg /kg /d IP durante 10 dias. A sobrevivência e o peso corporal dos ratinhos experimentais foram monitorizados diariamente. Os nossos resultados mostraram que 50% dos ratinhos tratados com doxorrubicina foram mortos no dia 11 (Fig. 9A). Em contraste, todos os ratos tratados com NSC745885 estavam sobrevivendo no dia 11 (Fig. 9A). Não há diminuição significativa nos pesos corporais dos ratinhos tratados com doxorrubicina, quando em comparação com grupos tratados com NSC745885 (Fig. 9B). Estes resultados indicaram que NSC745885 exibiu uma segurança mais elevada do que a doxorubicina. Além disso, também comparou a eficácia anti-tumoral entre estas duas drogas através da medição dos pesos de tumor no modelo de xenoenxerto de tumor de rolamento. NOD /SCID foram inoculados com células SAS e tratou-se com 2 mg /kg /d i.p. da doxorrubicina ou NSC745885 a partir do dia 3 a inoculação dia 10 célula pós. Os tumores foram colhidos no dia 11 (Fig. 9C, n = 9) e os pesos dos tumores foram medidos. Não há nenhuma diferença significativa entre os grupos tratados e NSC745885-tratados com doxorrubicina (Fig. 9D, n = 9), indicando uma eficiência anti-tumor comparável entre estes dois fármacos.

A célula cancerosa ratinhos implantados NOD /SCID