Abstract

pancreáticas adenocarcinomas ductal contêm um subconjunto de células-tronco cancerosas exclusivamente tumorigênicos (CSCs), que são capazes de repovoamento todo o câncer heterogêneo populações de células e são altamente resistentes à quimioterapia convencional. Aqui demonstramos que a metformina ablated selectivamente CSCs pancreáticas como evidenciado pela expressão diminuída de genes associados à pluripotência e marcadores de superfície CSC-associados. Posteriormente, a capacidade dos CSCs tratados com metformina para expandir clonalmente

in vitro

foi irreversivelmente revogada através da indução de apoptose. Em contraste, não respondeu CSCs preferencialmente por paragem do ciclo celular, mas não foram eliminadas pelo tratamento com metformina. Mecanicamente, a metformina aumento da produção de espécies reativas de oxigênio na CSC e reduziu o seu potencial transmembrana mitocondrial. A indução subsequente de crise energética letal em CSCs foi independente da AMPK /mTOR. Finalmente, em tecido de cancro modelos de xenotransplante de metformina primário efetivamente reduziu a carga tumoral e impediu a progressão da doença; se combinado com um inibidor alisado de metas de estroma para a penetração do tecido reforçado, enquanto gemcitabina realmente apareceu dispensável

Citation:. Lonardo E, Cioffi M, Sancho P, Sanchez-Ripoll Y, Trabulo SM, Dorado J, et al . (2013) Metformina Metas do Calcanhar de Aquiles metabólica de células estaminais do cancro do pâncreas humano. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10.1371 /journal.pone.0076518

editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2013; Aceito: 01 de setembro de 2013; Publicação: 18 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lonardo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado pela ERC avançada Investigator Grant (Pa-CSC 233460), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 /2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 256974, a Subdirección Geral de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria ( PS09 /02129), eo Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105, ambos Ministerio de Ciencia e Innovación, Espanha). E. L. é apoiada pelo Programa de Bolsas Pós-Doutorais Roche. M. C. é apoiada pelo Programa de Bolsas Predoctoral La Caixa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) continua a ser um dos cancros mais devastadores, e é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos países industriais, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 5% [1]. Muitos fatores de risco como tabagismo, consumo de álcool e pancreatite crônica têm sido reconhecidos como fatores de risco para o desenvolvimento de PDAC [2]. Estudos epidemiológicos também sugerem que a diabetes mellitus, em particular do tipo 2, está associado com risco aumentado de PDAC [3], [4]. Por isso, os investigadores iniciaram encontrar uma suposta ligação entre o uso de drogas anti-diabéticos e uma redução do risco para o desenvolvimento e /ou progressão de PDAC. Surpreendentemente, em uma análise retrospectiva, a administração oral de metformina em doentes com diabetes mellitus tipo II foi encontrado para ser associado com um risco reduzido de desenvolver PDAC [5], bem como melhor resultado em pacientes com estabelecida PDAC [6].

O efeito sistémico primária de metformina (Met) representa uma diminuição nos níveis de glicose no sangue através reduzida gliconeogênese hepática e aumento da captação de glicose nos tecidos periféricos [7]. Mecanisticamente, a metformina ativa indirectamente proteína cinase AMP-activada (AMPK) [8] sinalização e, subsequentemente, inibe a actividade da mTOR, que é frequentemente aumentada em células cancerosas [9], incluindo as células estaminais do cancro do pâncreas (CSCs) como uma subpopulação altamente tumorigénicas [10]. Este efeito inibidor de metformina em AMPK resultados /mTOR sinalização na síntese de proteínas reduzida e a proliferação de células [11], [12]. Além disso, em linhas de células estabelecidas PDAC metformina é também capaz de inibir PDAC [13]. Curiosamente, um outro estudo recente sugeriu que CSCs poderia ser alvo de metformina via re-expressão de miRNAs envolvidos na diferenciação, embora esses dados são baseados em CSCs derivado da linha de células de câncer não validados [14].

Ao contrário do maioria das células diferenciadas dentro do tumor, CSCs têm sido mostrados para serem altamente resistentes à quimioterapia [15]. Portanto, as drogas que alvejam seletivamente CSCs podem representar uma abordagem mais eficaz para superar a resistência e /ou recaída tratamento no PDAC. Aqui, nós agora fornecer evidências convincentes de que CSCs derivados de um conjunto diversificado de PDACs humanos primários são altamente vulneráveis ​​a reprogramação metabólica pela metformina resultando na sobrevivência a longo prazo de modelos pré-clínicos de rato.

Resultados

Nós temos mostrado previamente que CSCs pancreáticas primárias pode ser enriquecido

in vitro

como esferas tridimensionais independente de ancoragem, que são enriquecidas em células com propriedades semelhantes a células-tronco [15]. Um número total de nove xenoenxertos PDAC humanos foram usadas com A6L, 163, 185, 215, 247, 253, e 286 a ser descrito anteriormente [16], [17], bem como 354 e JH029, que foram obtidas usando a mesma metodologia. Importante, para a

in vitro

experimentos todas as células foram isoladas de fresco a partir de xenoenxertos passagem precoce e cultivadas em passagens baixas como células aderentes ou esferas independente de ancoragem. As esferas são enriquecidos em células CD133

+ células (Fig. S1A) e vários outros marcadores que têm sido associados a um fenótipo CSC, em comparação com células aderentes [18].

A metformina reduz a expressão de marcadores CSCs

primeiro, foi estabelecida a expressão do transportador catião orgânico 1, 2, e 3 (OCT1-3) nas células PDAC primários (Fig. 1A), que são cruciais para a absorção celular de metformina. A metformina foi usado em concentrações que não são directamente tóxicas para as células PDAC primárias e células não transformadas pancreáticas (CPS, as células estreladas pancreáticas; HDPE, ductal humano células epiteliais pancreáticas) (Figura 1B.), Que são significativamente mais baixos em comparação com as concentrações utilizadas em estudos anteriores com linhas celulares PDAC (10-30 mM) [14]. Em seguida, encontramos alterações significativas nos níveis de mRNA de genes CSCs (CD133, ALK4, nodais, Activina e Smad2) e genes associados à pluripotência (Nanog, Oct4 e Sox2) após o tratamento com metformina (Fig 1C;. Iniciadores utilizados estão listados na Tabela S1), que também foram confirmados ao nível da proteína (Fig. 1D). Surpreendentemente, a metformina apareceu para eliminar preferencialmente CSCs como células positivas CSC-marcador CD133, CD44, CXCR4 e SSEA-1 diminuiu, enquanto o epitélio EpCAM fabricante de diferenciação aumentou (Fig. 1E).

células PDAC primárias

(A) , mas não células de pâncreas normal expressar catião orgânico transportador 1, 2 e 3 (n = 3). (B) Definição do intervalo terapêutico para a metformina em células PDAC primários. Número de células crescidas na presença das concentrações indicadas de metformina durante 24 h (n = 6). Análise (C) qPCR de genes CSCs-associados em esferas tratadas com 3 mM de metformina durante 7 dias. Os dados estão normalizados para o gene de manutenção e são apresentados como a mudança vezes na expressão de genes em relação às células de controlo (n = 6). (D) mancha de Western representativas que ilustram a expressão reduzida de proteína Oct4 em resposta ao tratamento com metformina (n = 3). (E) fluxo representativas para análise de citometria de CSCs marcadores em esferas tratadas durante 7 dias com 3 mM de metformina, em comparação com as esferas não tratadas (painel superior). Resumo dos dados para PDAC-185, A6L, 215, 253, e 354 é mostrado (painel inferior; n = 6)

Metformina diminui seletivamente in vitro e in vivo tumorigenicidade

a seguir, examinou os efeitos funcionais da metformina sobre a capacidade de auto-renovação das CSCs. O ensaio de formação de esfera mostrou uma forte diminuição no tamanho das esferas formadas por metformina (Figura 2A . S1B) através da inibição da expansão da prole de CSCs, que representam a maior parte das células das esferas formadas. Ainda mais importante, verificou-se que a metformina diminuiu significativamente o número de esferas, na verdade, formada com a mesma eficiência em 3 e 10 mM (Fig. 2B). A fim de examinar o efeito a longo prazo do tratamento com metformina sobre a capacidade de auto-renovação das células que não apresentaram diferença significativa durante a primeira passagem esfera formação (Panc-185 e Panc-215), esferas secundárias e terciárias foram iniciadas sem mais metformina tratamento. A formação de esferas na segunda e terceira passagens foi drasticamente dificultado o que sugere que o tratamento com metformina irreversivelmente tinham eliminado a maioria das CSCs por inibição ou revogação da sua capacidade de auto-renovação (Fig. 2C). Consistentemente, pré-tratamento com metformina, resultou na formação de colónias mais pequenas e menos, em comparação com o controlo (Fig. 2D). O padrão-ouro para a atividade CSC representa

in vivo

tumorigenicidade. A frequência de células tumorigénicas derivadas de PDAC-354, 215, e esferas A6L foi regularmente muito alta, com valores abaixo 1:500 e tornou-se marcadamente rarefeito por tratamento com metformina (Fig. 2E). Finalmente, descobrimos que o pré-tratamento com metformina de CSCs pancreáticas posteriormente reduzida a sua migratório (Fig. S2A) e capacidade invasiva (Fig. 2F).

(A) Metformina diminui o tamanho das esferas. Imagens representativas de esferas obtidas após o tratamento com metformina durante 7 dias. Quantificação do tamanho da esfera (n≥6). capacidade de formação de (B) da esfera na presença ou ausência de metformina durante 7 dias (n≥6). (C) capacidade de auto-renovação das células-tronco cancerosas isoladas de tumores que respondem mal em termos de primeira esfera passagem capacidade de formar. As células foram continuamente passagem como esferas secundárias e terciárias tratados com metformina ou veículo apenas durante a formação esfera primeira geração (n = 6). (D) A formação de colónias por PDAC-185, A6L, 215, 253, e 354 evidenciado por 0,05% de violeta de cristal, após 21 dias (n = 3). (E) rarefação de

in vivo

células-tronco cancerosas tumorigênicos em esferas tratados com metformina, em comparação com veículo. (F) Invasão de células derivadas da esfera após 24 h de tratamento com metformina ou controle (n = 3).

Metformina elimina especificamente CSCs pancreáticas

duplicação da população de células aderentes foi marcadamente reduzida por metformina com forte variação intertumoral (Fig. 3A). Consistentemente, expressão de Ki67 foi diminuída sugerindo a inibição da proliferação celular (Fig. 3B), o que foi confirmado pela redução da expressão de ARNm em cyclinD1 (Fig. 3C) e o nível de proteína (Fig. S2B). Em seguida, analisou-se o perfil do ciclo celular de células aderentes contra CSCs por citometria de fluxo. Curiosamente, os dados mostraram que o efeito funcional de metformina sobre a progressão do ciclo celular foi muito mais marginal para células derivadas de esfera, sugerindo um mecanismo distinto responsável pela sua subsequente perda durante o tratamento prolongado (Fig. 3D). Na verdade, enquanto a metformina não alterou de forma significativa a taxa de células aderentes apoptóticas como evidenciado por coloração com AnnexinV /DAPI (1,23 ± 0,37 mudança vezes), que resultou numa forte indução de apoptose em células derivadas de esfera (2,95 ± 1,10 a mudança de dobragem; P 0,01) (Figura 3E).. Estes dados estão de acordo com uma eliminação preferencial das CSCs por metformina, ao passo que os seus efeitos sobre a progenia diferenciada são principalmente relacionadas com a inibição de proliferação.

(a) número de células crescidas na presença das concentrações indicadas de metformina durante 24 h. (N = 3). (B) Quantificação de Ki67 e DAPI em células aderentes após 7 d de tratamento com metformina ou de controlo (n = 3). Análise (C) qPCR para CyclinD1 em células aderentes e derivados de esfera após 7 d do tratamento com metformina ou controle. Os dados estão normalizados para o gene de manutenção e são apresentados como a mudança vezes na expressão de genes em relação a células não tratadas (n = 6). Análise (D) ciclo celular determinada por coloração com iodeto de propídio em células aderentes e esferas após 7 d de tratamento com metformina ou de controlo (n = 3). análise (E) Citometria de células apoptóticas por coloração dupla para anexina V /DAPI após o tratamento com metformina ou de controle para aderente contra células derivadas da esfera (n = 3).

Mecanismo de acção

metformina uniformemente redução do nível de ATP tanto em células aderentes e esferas ao longo do painel de tumores investigados incluindo respondedores tardias (Fig. 4a). Consistentemente, metformina induziu um aumento dependente do tempo de pAMPK em CSCs (Fig. 4B, painel superior) com nenhuma diferença aparente para não-CSC (dados não mostrados). Além disso, observou-se uma diminuição líquida similar em p70S6K, sugerindo um bloqueio eficiente da via mTOR (Fig. 4B, painel inferior). Como a via mTOR é um regulador central da autofagia, analisamos se a metformina pode induzir marcas características de autofagia em CSCs versus não-CSCs, mas nossos resultados não suportam a noção de que a eliminação selectiva de CSCs pela metformina pode ser racionalizado por alterações autofagia (Fig. S3A /B). Para fornecer evidência adicional de que a AMPK via /mTOR não medeia os efeitos deletérios da metformina sobre CSCs, investigou-se os efeitos da metformina são imitados pelo activador directo AMPK A769662 e /ou o inibidor de mTOR rapamicina (Rapa). Surpreendentemente, nem formação de esfera (Fig. 4C), nem a formação de colónias (Fig. 4D) foi significativamente inibida pelos dois inibidores, essencialmente, descartando AMPK /mTOR como o mecanismo de condução para a metformina na segmentação CSCs pancreáticas.

( A) os níveis celulares de ATP em células aderentes e esferas após 7 d de tratamento com metformina ou de controlo (n = 3). (B)

Painel superior

: análise de Western blot de pAMPK, AMPK e GAPDH nas esferas tratados com metformina ou controle.

Baixa painel

: análise de Western blot de pAMPK, pp70S6K e GAPDH nas células aderentes e esferas tratados com metformina ou de controlo por 7 dias (n = 3). (C) Efeito geral de metformina (3 mM), a inibição de mTOR (rapamicina; 100 ng /ml), e a activação direcção de AMPK (A769662; 10 uM) sobre a formação de esfera e (n = 6). (D) para a formação de colónias PDAC-215, 253, e 354 células (n = 3). (E) Total e mitocondrial de produção (Mito) ROS após 8 horas de controlo ou tratamento com metformina. potencial de membrana (F) mitocondrial após 8 horas de controlo ou tratamento com metformina.

Em seguida, a hipótese de que a sensibilidade especial dos CSCs à metformina pode ser atribuído às propriedades anti-oxidantes à metformina [19]. Na verdade, o tratamento com metformina aumentaram significativamente a produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) em CSCs derivadas de todos os tumores utilizados, mas essas mudanças foram mais acentuadas em respondedores rápidos (PDAC-253 e 354), em comparação com os respondedores atrasados ​​PDAC-215 e 286 (onde os efeitos da metformina não são detectáveis ​​na formação esfera primeira geração) (Fig. 4E). Curiosamente, os dados consistentes foram obtidos para o potencial transmembranar mitocondrial, o que foi o mais proeminente reduzida em respondedores rápida (Fig. 4F). Usando a sonda mitocondrial TMRE, demonstra-se que nestes tumores metformina diminuiu o seu potencial transmembranar mitocondrial (utilizado como um marcador geral de toxicidade mitocondrial e indução de apoptose), enquanto se manteve inalterada ou apenas ligeiramente reduzida em respondedores tardias. Este efeito direto sobre a mitocôndria pode também explicar a sensibilidade diferencial entre não-CSCs e CSCs como o último parece ser mais dependente da sua mitocôndria para a geração de energia, enquanto os não-CSCs principalmente contam com fontes independentes de mitocôndrias, como glicólise aeróbica (efeito Warburg) [20]. Além disso, também confirmou que o efeito da metformina na mitocôndria era independente da AMPK /mTOR como nem o activador AMP A769662 nem o inibidor de mTOR rapamicina directa eram capazes de mimetizar os efeitos da metformina (Fig. S4A /B).

metformina barracas progressão PDAC in vivo

primeiro, estudamos os efeitos da metformina

in vivo

usando uma breve de 7 dias o tratamento com metformina de PDAC-185. Durante o acompanhamento subsequente de 40 dias observou-se uma redução significativa no crescimento do tumor e uma remissão completa em 3 fora 8 tumores para a metformina tratados com camundongos em oposição a nenhuma remissão no grupo controle (Fig. S5). Dados consistentes foram obtidos para outros PDACs com metformina monoterapia sendo altamente eficaz em induzir a regressão da doença (Fig. 5A-F). Várias observações importantes foram feitas durante estes estudos. Em primeiro lugar, não se observou qualquer toxicidade grave durante o tratamento com metformina prolongada como o peso corporal manteve-se inalterada (Fig. 5A, painel da direita). Em segundo lugar, os tumores lentamente, mas regularmente recaída após a retirada da metformina no dia 100 (Fig. 5A, painel esquerdo). Em terceiro lugar, enquanto a adição de gemcitabina

in vitro

mostraram um efeito aditivo sobre a população CSC (Fig. 5C), nenhum efeito aditivo pode ser notado

in vivo Compra de metformina mais gemcitabina (Fig. 5D)

(A)

painel esquerdo

:. tecido PDAC-215 foi implantado e tratamento foi alocado após tomada tumor inicial foi verificada. Os ratinhos foram tratados com gemcitabina (Gem) e metformina (MET). A metformina foi descontinuado em D100 para testar o potencial das lesões restantes para iniciar a recidiva da doença. Depois de recidiva da doença documentada, o tratamento com metformina foi re-administrado.

Painel direito

: O peso corporal durante o tratamento. (B)

Painel esquerdo

: A análise histológica: Hematoxilina Eosina (H E), CyclinD1, e Caspase3.

Painel direito

: Conteúdo para as células CD44 +. (C) Efeitos do

in vitro

tratamento como indicado na capacidade de formação de esfera. tecido (D) PDAC-A6L implantado em ratos e tratadas como indicado. (E) de conteúdo para células CD44 + (

Painel

superior) e capacidade de formação de esfera (

painel inferior

). (F) A análise histológica:. H E e cytokeratin19 (CK19; n = 6)

Estes dados nos levou a supor que a gemcitabina não foi entregue de forma adequada para o tecido PDAC [21] e /ou o estroma protegeu as CSCs dos efeitos deletérios da metformina, promovendo a sua stemness e, posteriormente, de resistência [22]. Portanto, nós adicionamos o inibidor alisado SIBI-C1 como um agente de estroma /estreladas células-alvo para a combinação de gemcitabina com metformina. Desde que nós temos mostrado previamente que a combinação de gemcitabina mais alisado inibidor não impede a recidiva [10] e gemcitabina representa atualmente o tratamento padrão para PDAC, só testado esta combinação. Além de melhorar a prestação de tecido de gemcitabina, [21] a combinação tripla também resultou em uma duplicação da concentração de metformina tecido (23,1 ± 0,82 contra 10,8 ± 1,9 mg /g). Subsequentemente observou-se a regressão da doença reprodutível (Fig. 6A-C) e, mais importante ainda, esta combinação também foi eficaz em tumores previamente mostrado ser resistentes à inibição de mTOR (Fig. 6D) [23].

( a) tecido PDAC-185 implantado em ratos e tratadas como indicado, incluindo o inibidor de C1-SIBI smoothened. (B) Conteúdo para EpCAM + e CD133 + células, respectivamente, (

painel superior

) e capacidade de formação de esfera (

painel inferior

). (C) A análise histológica: Hematoxilina Eosina (H E) e cytokeratin19 (CK19). resistente (D) inibidor de mTOR tecido PDAC-253 implantadas em ratos e tratadas como indicado (n = 6).

Discussão

Aqui demonstramos que as populações heterogéneas de células cancerosas abrigava em tecidos PDAC humanos primários diferem na sua resposta à metformina, dependendo do seu nível de stemness. Enquanto a maior parte das células cancerosas mais diferenciadas reagiram ao tratamento com metformina com a paragem do ciclo celular, um subconjunto de células com características stemness distintas, a saber, os CSCs realmente submetidos a morte apoptótica rápida devido a crise energética. Embora o efeito mais aparente para o tratamento com metformina em esferas primárias se uma redução acentuada no tamanho de esfera de acordo com uma taxa de proliferação reduzida das células mais diferenciadas abrigavam nestas esferas, após passagens em série das esferas revelaram claramente a sua perda quase completa e irreversível de clonogénico capacidade de propagação, não obstante o facto de o tratamento com metformina foi já interrompida após a primeira passagem. Estes dados demonstram que a metformina praticamente esgotada a fração CSC, mas também são consistentes com a noção de que não CSC não encher a piscina CSC pancreático após o término do tratamento com metformina. Consistentemente, o transplante das células pré-tratadas em ratinhos imunocomprometidos revelou que a tumorigenicidade das células foi de facto drasticamente reduzida por exposição a curto prazo a metformina. O mais importante, no entanto,

in vivo

tratamento de cancros estabelecidos humanos primários responderam fortemente à metformina com a regressão da doença e doença estável subsequente.

O mecanismo de acção definidas para metformina em CSCs permaneceu desconhecida . A maioria das investigações em células tumorais em massa apoiar um modelo de trabalho simplificado em que a metformina exerce efeitos anti-tumorais pelo indiretamente ativar a AMPK seguido de posterior supressão da mTOR [8]. Directamente segmentação mTOR com rapalogs também tem sido considerada como um alvo para o desenvolvimento de drogas anti-cancro. Enquanto isso foi eficaz em pacientes com vários tipos de câncer [24], os estudos pré-clínicos em PDAC não sugerem uma alta taxa especial de resposta (23%) [23]. É importante ressaltar que um dos tumores insensíveis em que o estudo foi PDAC-215, que fomos capazes de testar também no presente estudo com metformina. CSCs derivados deste tumor mostrou uma inibição robusta de formação esfera secundária

in vitro Comprar e regressão do tumor eficiente

in vivo

. Por outro lado, a activação directa de mTOR por A769662 ou inibição de mTOR por rapamicina não imitam os efeitos fortes que obtivemos com metformina sugerindo que os efeitos do tratamento de metformina no CSCs pancreáticas são independentes de alterações do eixo AMPK /mTOR.

células PDAC Humanos são conhecidos por sua tolerância inerentes à nutrição fome, o que lhes permite sobreviver em um microambiente tumoral hipovascular (austeridade). É um paradigma emergente que as células estaminais normais são caracterizados por glicólise aeróbica predominante e suprimiu oxidação mitocondrial com posteriormente inferior a produção de ATP mitocondrial e libertação ROS [25]. Nossos dados estão em linha com a noção de que CSCs pancreáticas, na verdade, ter um perfil metabólico altamente dependente do mitocondrial, que está em flagrante contraste com as células-tronco normais, mas também os distingue as células cancerosas a granel. Foi previamente mostrado que a metformina é lentamente acumulado de 1000 vezes dentro da mitocôndria e inibe directamente Complexo 1 (NADH desidrogenase), que transloca quatro protões a partir da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar, produzindo, assim, um gradiente de protões. A cadeia de transporte de electrões e fosforilação oxidativa são acoplados por este gradiente de protões através da membrana mitocondrial interna, e a sua inibição parece ser particularmente letal para os CSCs [26]. Portanto, drogas como a metformina que visam o metabolismo mitocondrial oxidativa representam poderosas ferramentas terapêuticas para atacar a piscina CSC.

A capacidade de metformina para eliminar selectivamente CSCs está em contraste gritante com os efeitos da gemcitabina, um medicamento quimioterápico que mata as células cancerosas a granel, mas não as células-tronco do câncer [15]. Com base nas suas propriedades distintas, metformina deveria sinergia com gemcitabina para reduzir ambos os não-CCC CCC e na população mista. Na verdade, só recentemente foi mostrado em quatro tipos geneticamente diferentes de linhas celulares de cancro da mama que a metformina mata seletivamente CSCs e que a combinação de metformina e do agente quimioterápico doxorrubicina padrão matou ambos os CSCs e não CSCs

in vitro

como bem como massa tumoral reduzida e remissão prolongada de forma mais eficaz

in vivo

do que apenas uma ou outra droga [27]. Enquanto nós poderíamos confirmar esta hipótese para PDAC

in vitro

, nosso

in vivo

tratamento estudos sugerem que a gemcitabina é realmente dispensável desde que a metformina é continuado ao longo do estudo. Embora estes dados ainda mais certamente garante validação, parece razoável especular que a monoterapia com metformina poderia representar uma opção novo tratamento para pacientes que são demasiado frágeis para tolerar os efeitos colaterais do agente quimioterapêutico gemcitabina [28].

Infelizmente, no entanto , todos os tumores testados progrediu eventualmente sob tratamento com metformina. Ele continua a ser determinado se CSCs expostos ao tratamento com metformina longo prazo mudar seu fenótipo metabólico tornando-as resistentes aos efeitos da metformina sobre mitocôndrias (resistência adquirida) ou se uma subpopulação preexistente de CSCs é realmente resistente à metformina e, eventualmente, torna-se o clone dominante (herdado resistência). Esta questão deve ser abordada em estudos futuros, comparando CSCs isoladas de tumores que regrediram em tratamento com metformina e CSCs isoladas de tumores que eventualmente progrediram nas mesmas condições. caracterização extensa de clones resistentes devem fornecer informações cruciais sobre se este é realmente opções de tratamento linha evitáveis ​​ou segundo poderia ser oferecido.

Importante, inibidor no entanto, a adição de um estroma segmentação alisado aparece obrigatória para alcançar mais forte e mais taxas de respostas duradouras. A explicação mais provável pode ser de duas vezes. Um factor que contribui para o fracasso das terapias sistémicas podem ser o conteúdo do estroma tumoral abundante que é a característica de PDAC. O estroma representa a maior parte da massa do tumor, e é composto por uma variedade dinâmica de componentes da matriz extracelular e células não neoplásicas, incluindo fibroblastos, vasculares e células do sistema imunológico. Um trabalho recente tem revelado que o estroma suporta CSCs, [18], [22], [29] promove a capacidade de invasão e metástase, assim como ao mesmo tempo serve como uma barreira física para a entrega de drogas [21]. Portanto, inibição da via hedgehog, além de proporcionar um melhor acesso para a droga administrada sistemicamente, também pode revogar a tornando-os mais suscetíveis aos efeitos do tratamento da metformina e /ou gemcitabina nicho CSC. Futuro mais extensos estudos terão de mostrar se o desenvolvimento de resistência pode ser eficientemente impedidos por esta estratégia de tratamento.

Pode-se argumentar que as concentrações de metformina utilizadas em nossos

in vitro

estudos, embora já significativamente inferiores aos utilizados em estudos anteriores, ainda não são realizáveis ​​

in vivo

e, portanto, irrelevante do ponto de vista mecanicista. No entanto, é importante notar que a metformina se acumula nos tecidos e em particular na mitocôndria em concentrações várias vezes mais elevada do que os medidos no sangue [26]. Isto é particularmente verdade para células que estão equipados com os respectivos transportadores relevantes para a absorção de metformina, nomeadamente OCT1-3. Como mostramos aqui, as células PDAC expressam todas as três isoformas, mas mostram particularmente elevada expressão de OCT1. Embora seja difícil avaliar as verdadeiras concentrações de metformina intracelulares em células PDAC devido ao conteúdo estroma maciça e áreas de necrose em tumores colhidos, a nossa análise da concentração de metformina revelou maiores concentrações de metformina no tecido PDAC (10,8 mg /g de tecido) do que no fígado (8,9 mg /g) e mais ainda se a metformina foi administrada em combinação com o inibidor de smoothened SIBI-C1 (23,1 mg /g). Portanto, a nossa mecanicista

in vitro

estudos são de fato altamente relevante para o

in vivo

definição.

A metformina carrega um perfil de segurança excepcional como apenas hepatócitos, mas não outras não células transformadas (STEM) expressar outubro eficiente para a absorção celular de metformina. Vários ensaios clínicos (NCT01210911, NCT01167738 e NCT01488552) estão testando metformina em PDAC localmente avançado e metastático. Esperamos que possa fornecer uma avaliação definitiva dos efeitos clínicos de metformina no PDAC. Seria de particular interesse se os pacientes serão em última análise, também o progresso durante o tratamento com metformina e se esta pode ser avaliada e /ou o previsto pela análise de células cancerosas (STEM) que circula. Seu isolamento prospectivo durante a recaída pode fornecer insights mecanicistas importantes sobre a causa da recaída.

Materiais e Métodos

amostras tumorais

Depois de consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes, tecidos excesso de carcinomas pancreáticos ressecado foi xenoenxerto na Johns Hopkins Medical Institutions (Ética aprovação do conselho: JHMIRB: 05-04-14-02 “um estudo de viabilidade para Individualizado tratamento de doentes com cancro do pâncreas avançado”) e Hospital de Madrid – Centro Integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 “Criação de banco de tumores e tecidos saudáveis ​​em pacientes com câncer”), respectivamente, no âmbito dos protocolos Institutional Review Board aprovados indicados [30]. Resumidamente, excesso tecidos tumorais que não são necessários para o diagnóstico clínico durante ressecções Whipple de rotina realizados por cirurgiões que não estavam envolvidos no presente estudo foram posteriormente implantadas em ratinhos imunocomprometidos. Todas as informações paciente foi feita de forma anónima pela remoção de qualquer informação, que identifica, ou pode levar à identificação do doente. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a radioterapia ou quimioterapia neoadjuvante antes da ressecção do tumor.

células PDAC humanos primários

Para os estudos in vitro, fragmentos de tecido foram picados, enzimaticamente digeridos com colagenase (Stem Cell Technologies, Vancouver, Colômbia Britânica) durante 90 min a 37 ° C [10] e após centrifugação durante 5 min a 1200 rpm, os peletes foram ressuspensas e cultivadas em RPMI, 10% de FBS e 50units /ml de penicilina /estreptomicina. Para alguns experimentos, a linha celular humana PDAC L3.6pl foi usada como descrito anteriormente [15].

-tronco do câncer de cultura de células-enriquecedora

esferas PDAC foram gerados e ampliado em DMEM-F12 ( Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com B-27 (Gibco, Karlsruhe, Alemanha) e bFGF (PeproTech CE, Londres, Reino Unido). 10

3 células /ml foram semeadas em placas de fixação ultra-baixo (Corning BV, Schiphol-Rijk, Holanda), como descrito anteriormente [31] Depois de 7 d de incubação, as esferas foram tipicamente . 75 um grande com ~ 97% CD133high. Para passagens em série, esferas 7 dias de idade foram colhidas utilizando 40 mm filtros celulares, dissociado de células individuais com tripsina, e então re-cultivadas por 7 d.