Abstract

O câncer de próstata (PCA) é uma das principais causas de morte entre os homens. Estima-se atualmente que as respostas inflamatórias estão ligadas a 15-20% de todas as mortes por cancro em todo o mundo. PCA é dominado por complicações resultantes de metástases para o osso em que as células tumorais interagir com o microambiente do osso prejudicando o equilíbrio entre a formação óssea e a degradação. No entanto, a natureza molecular desta interacção não é completamente compreendido. O heme oxigenase-1 (HO-1) neutraliza o dano oxidativo e inflamação. Estudos prévios realizados em nosso laboratório mostraram que HO-1 está implicada na APC, demonstrando que endógena HO-1 inibe osso da próstata derivado células cancerosas proliferação, invasão e migração e diminui o crescimento do tumor e angiogênese

in vivo

. O objetivo deste trabalho foi analisar o impacto da HO-1 células CaP modulados sobre a proliferação de osteoblastos

in vitro

e na remodelação óssea

in vivo

. Usando um sistema de co-cultura de células PC3 com osteoblastos ratos primárias (PMOs), que demonstraram que HO-1 de indução farmacológica (tratamento hemina) anulou a diminuição da proliferação de PMOs induzida por células APC e diminuiu a expressão de factores moduladores de osteoclastos em osteoblastos . Não foram detectadas mudanças na expressão de genes envolvidos na diferenciação de osteoblastos. No entanto, a co-cultura de células pré-tratadas hemina PC3 (PC3) Hem com PMOs provocou um estado oxidativo e activado FOXO sinalização em osteoblastos. A percentagem de osteoblastos activos positivos para HO-1 aumentou em calvária explantes co-cultivadas com células PC3 bainha. Nuclear HO-1 foi detectada expressão em tumores gerados in vivo por injecção de osso de HO-1 de células PC3 transfectadas estáveis ​​(PC3HO-1) no fémur de

SCID

ratinhos. Estes resultados sugerem que HO-1 tem o potencial de alterar o microambiente do osso impacto na metástase óssea CaP

citação:. Ferrando H, X Wan, Meiss R, Yang J, De Siervi A, Navone, N. et al . (2013) O heme oxigenase-1 (HO-1) Expressão em células de cancro da próstata modula a resposta oxidativo em células ósseas. PLoS ONE 8 (11): e80315. doi: 10.1371 /journal.pone.0080315

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 29 de agosto de 2013; Aceito: 06 de outubro de 2013; Publicação: 04 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ferrando et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Universidade de Buenos Aires, Argentina, UBACyT (20020100100179) e ANPCyT (PICT RAICES 2010-0431). M. F. realizada bolsas de CONICET e UICC Technology International Cancer Transferência Fellowship. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as metástases ósseas dominam o quadro clínico de câncer de próstata avançado (APC) e são responsáveis ​​pela maior parte da mortalidade e morbidade da doença. Metástases para osso pode ter ou uma osteolítico (reabsorção óssea) ou um osteoblástica fenótipo (osso produzindo). CaP caracteristicamente produz lesões osteoblásticas em osso, embora um componente osteolíticas está sempre presente.

Tem sido sugerido que a inflamação aumenta tumorigênese prostática [1]. As citocinas, quimiocinas e metaloproteinases de matriz são parte de uma rede pró-inflamatória que contribui para a progressão maligna [2]. De fato, fatores pró-inflamatórios secretadas por APC e células ósseas ea subsequente lançado de fatores a partir da matriz orgânica do osso, mediar a /interação autócrina parácrina entre CaP células, osteoblastos e osteoclastos, o que acaba por determinar o fenótipo óssea e progressão do CaP [3 , 4].

O stress oxidativo é uma consequência natural do processo inflamatório e atua como um modulador da função dos tecidos mineralizados [5]. Ela afecta a formação de osso por inibição da diferenciação de osteoblastos e promovendo a apoptose [6]. Estes efeitos são mediados, em parte, por espécies de oxigénio reactivas (ROS) gerados no contexto de estresse oxidativo. Células neutralizar os efeitos adversos dos ROS por activação de vários mecanismos de defesa, incluindo a indução de enzimas eliminadoras de radicais livres, tais como superóxido-dismutase de manganês (MnSOD), catalase, e também os genes de reparação do ADN. Esta resposta requer a ativação de uma família de factores ubíquos conhecidos como caixa de transcrição forkhead O (FOXO) [7], que através da interação com β-catenina reduz o stress oxidativo e promove a sobrevivência osteoblastos [6].

Heme oxigenase 1 (HO-1), a enzima que limita a taxa de degradação do heme, foi demonstrado para conferir citoprotecção contra o stress oxidativo e inflamação em vários modelos animais [8]. Os relatórios anteriores de nosso laboratório documentados pela primeira vez a expressão nuclear de HO-1 em carcinomas da próstata primários humanos [9]. Nós também documentado que HO-1 inibe a proliferação celular, migração e invasão

in vitro

e prejudica o crescimento do tumor CaP

in vivo

[10]. Além disso, nós anteriormente estabelecido um papel chave para HO-1 como um modulador do interruptor angiogénico na carcinogénese da próstata [11]. Além disso, mostrámos evidência de que a função de anti-angiogénico de HO-1 foi mediada pela repressão do factor nuclear kappa-luz de cadeia-potenciador de células activadas B (NF-kB) via [11] de sinalização. Recentemente, nós relatamos uma função nova para HO-1 em CaP. Nós demonstramos que HO-1 down-modula AR atividade transcricional, interferindo com a sinalização STAT3 e forneceu evidências de seu papel para além da degradação do heme [12].

Os estudos aqui apresentados foram realizadas utilizando um osteolítico linha de células CaP ossos derivadas (PC3) que foi mostrado para inibir a proliferação de osteoblastos

in vitro

num sistema de co-cultura com osteoblastos primários de ratinho (PMOs) [13]. Neste trabalho, relatamos os dados que suportam uma função nova para HO-1 na interação entre as células APC e osso. Verificou-se que a indução de HO-1 em células PC3 restaurada a proliferação de osteoblastos, o qual foi inibida durante a co-cultura com células PC3 parentais. Nossos estudos sugerem que estes efeitos são mediados através da activação de sinalização FOXO em osteoblastos. células PC3 que sobre-expressam de HO-1 (PC3HO-1) que cresce no osso de ratos, produziram tumores com localização nuclear de HO-1 como detectado por imuno-histoquímica. Estes dados indicam que HO-1 desempenha um papel na progressão de CaP no osso. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à interacção entre as células APC e microambiente ósseo pode ajudar a identificar novos alvos para intervenção farmacológica nesta doença.

Materiais e Métodos

culturas de células e anticorpos

a linha celular PC3 cancro da próstata foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e rotineiramente cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). PC3 células transfectadas estáveis ​​(PC3HO-1 e PC3βgal) foram geradas como descrito anteriormente [10]. A linha celular de mioblastos C2C12 de rato foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e foi cultivada em DMEM de baixa glicose (Invitrogen, CA, EUA) com 10% de FBS. As culturas primárias de osteoblastos ratos (PMOs) foram estabelecidas através de um procedimento publicado anteriormente [13], e foram obtidos a partir de calvária de ratos recém-nascidos CD1 sacrificados 4 dias após o nascimento. As células isoladas foram plaqueadas em α-MEM (Invitrogen, CA, EUA) mais 10% de FBS durante 48 h. Os PMOs foram então subsequentemente tripsinizadas e novamente semeadas em placas de cultura para realizar experimentos. Anticorpos: anti-HO-1 foi de Stressgen Biotechnologies, Corp (San Diego, CA, EUA), anti-β-catenina foi de BD Transduction Laboratories ™ (CA, EUA), anti-β-actina foi de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA), anti-ciclina B1, anti-ciclina A, anti-ciclina D1, os anticorpos secundários anti-p21, anti-β-tubulina, anti-ratinho e anti-coelho foram de Santa Cruz Biotechnology Inc. ( anticorpo secundário CA, EUA) e Alexa Fluor® 594 conjugado de Invitrogen (CA, EUA).

Hemin pré-tratamento das células APC e sistema de co-cultura

O

in vitro

bicompartment sistema de cultura foi utilizado como um modelo de metástases ósseas de CaP como anteriormente descrito ligeiramente modificado [13]. Em resumo, no dia 0, as células PC3 foram semeadas (10,500 células /cm

2) em inserções de cultura celular (0,4 mm de poro, Falcon /Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA) e no 1 ° dia que eram tratadas com hemina (80 uM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), um potente indutor de HO-1 (PC3 Hem). Os controlos receberam meio fresco. Os PMOs também foram semeadas no dia 1 em placas de cultura de tecidos (7.300 células /cm

2). No dia 2, as pastilhas que contêm as células PC3 (pré-tratados ou não com hemina) foram extensivamente lavadas com PBS. Em seguida, as pastilhas foram colocadas em placas de cultura de tecidos contendo as PMOs para que os dois tipos de células diferentes partilhada no meio de cultura, mas não estavam em contacto físico. Co-cultura de células PC3 com PMOs foi realizada com α-MEM mais FBS a 2% durante 24 h. No dia 3, as células foram recolhidas e diferentes parâmetros foram analisados. Como controlo, cada tipo de célula (células PC3 pré-tratados ou não com hemina e PMOs) foi cultivado sozinho. Co-culturas de células C2C12 e PC3 foram feitas nas mesmas condições como PMOs e células PC3. As culturas foram feitas em triplicado e cada experiência foi testada três vezes.

ensaio mitogénico

A proliferação e síntese de DNA foram avaliadas pela adição de [

3H] -timidina (Amershan Biosciencies) durante a final 3 h de co-cultura e a incorporação foi medida tal como descrito noutro local [14].

isolamento de ARN e RT-qPCR (transcrição reversa PCR quantitativo)

o ARN total foi isolado com o Kit RNeasy Mini (Qiagen). Os cDNAs foram sintetizados com RevertAid RT (Fermentas) e amplificado por em tempo real a amplificação por PCR com Taq DNA polimerase (Fermentas). Os iniciadores foram concebidos usando Beacon Designer 5 e testado com UCSC Genome Browser de Página URL. A PCR foi realizada em um motor Opticon DNA (MJ Research). sequências iniciadoras humanos foram dadas como se segue: 5′-ACTB AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′-5’e CATACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′; HO-1 5′-3′-GAGTGTAAGGACCCATCGGA e 5′-GCCAGCAACAAAGTGCAAG-3′; PTHrP 5′-3′-GTCTCAGCCGCCGCCTCAA e 5′-GGAAGAATCGTCGCCGTAAA-3′; uPA 5′-3′-GAGATCACTGGCTTTGGAAAA e 5′-CCAGCTCACAATTCCAGTCA-3′; TGF-β1 5′-3′-TACCTGAACCCGTGTTGCTC e 5′-3′-GCGAAAGCCCTCAATTTCCC. sequências iniciadoras de ratinho foram dadas como se segue: 5′-ACTB CCGCACGACAACCGCACCAT-3′-5’e CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3′; RUNX-2 5′-3′-CCGCACGACAACCGCACCAT e 5′-AGGCATTTCGGAGCTCGGCG-3′; ALP 5′-3′-AACCCAGACACAAGCATTCC e 5′-GAGACATTTTCCCGTTCACC-3′; COL1A1 5′-3′-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT e 5′-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3′; COL1A2 5′-3′-GCAGGTTCACCTACTCTGTCCT e 5′-CTTGCCCCATTCATTTGTCT-3′; OCN-5′-3’GCAGCTTGGTGCACACCTAG e 5′-GGAGCTGCTGTGACATCCATAC-3′; RANKL 5′-3′-TGATTCATGTAGGAGAATTAAACAGG e 5′-GATGTGCTGTGATCCAACGA-3′; OPG 5′-GAAGGGCGCTACCTTGAGAT-3 ‘e 5′-GCAAACTGTATTTCGCTCTGG-3′; CSF-1 5′-3′-CAACAGCTTTGCTAAGTGCTCTA e 5′-CACTGCTAGGGGTGGCTTTA-3′; OPN 5′-3′-CTTTCACTCCAATCGTCCCTA e 5′-GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT-3′; CCL2 5′-3′-TGCTACTCATTAACCAGCAAGAT e 5′-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′; IL-6 5’-3 ‘e CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-5′-GAAGTAGGGAAGGCCGTGG-3′; MnSOD 5′-3′-CCACACATTAACGCGCAGATC e 5′-TAACATCTCCCTT GGCCAGAGC-3′; catalase 5′-3′-TTGCTGAAGTTGAACAGATGG e 5′-3’-ATCACGCTGGTAGTTGGC.

análise Western blot

Para transferência western, 50 ug de proteína foram separados em géis de poliacrilamida a 12% Tris-glicina e transferido para membranas de nitrocelulose (BioRad POWERPAC de base). As proteínas específicas foram detectados por quimioluminescência (Amersham) conforme previamente descrito [10].

plasmídeos, transfecções e ensaio de luciferase repórter

Uma construção de gene repórter TOP-flash contendo quatro locais de ligação de consenso TCF, um site mínima Fos ligação e um repórter luciferase foi utilizado [15]. Um FOP-flash construir com um local de ligação mutado TCF foi utilizado como um controlo negativo. Um plasmídeo repórter contendo 6 cópias da proteína de 16 DAF-família de ligação elemento (FOXO-Luc) no vector de luciferase de pirilampo pGL3-basic com um mínimo de caixa TATÁ [16] foi gentilmente fornecida por B. Burgering, Centro Médico da Universidade de Utrecht, Holanda . construções repórter de luciferase foram introduzidos em células C2C12 por transfecção transiente utilizando 8 g de PEI e 4 ug de plasmídeo. Após 6 h, o meio foi removido e a C2C12 foram co-cultivadas com células PC3 pré-tratados ou não com hemina ou cultivados sozinhos durante 24 h. células C2C12 foram então colhidas e lisadas com 40 ul de constante Glo Luciferase Sistema (Promega, Madison, WI, EUA). A actividade de luciferase foi medida num luminómetro (Glomax Sistema de detecção de múltiplos; Promega). Como controlo positivo da ligação TCF activação locais, PMOs foram tratados com LiCl 10 mM durante 24 h e de activação FOXO-Luc, as células foram expostas a H

2O

2 100 uM durante 24 h. Cada transfecção foi feita em triplicado e cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Os dados foram normalizados para proteína total determinado pelo ensaio de Bradford.

Avaliação de espécies de oxigénio reactivas por citometria de fluxo

Após a co-cultura, as PMOs foram lavadas com PBS e incubadas com 10 uM de 2 ‘, 7’- diclorofluoresceína diacetato (CM2-DCFHDA; Invitrogen Molecular Probes

TM) durante 1 h a 37 ° C. As células foram ressuspensas e tripsined com PBS. Os níveis de H

2DCFDA foram medidos por citometria de fluxo no canal FITC.

ciclo celular

Após a co-cultura, PMOs foram fixadas e coradas com iodeto de propídio (PI), e analisadas por células activadas por fluorescência (FACS), como descrito anteriormente [17].

imunofluorescência

PMOs foram co-cultivados tal como descrito anteriormente, mas semeadas em lamelas. As análises de imunofluorescência foram realizadas como anteriormente descrito [12]. microscopia de campo de largura foi realizada utilizando um microscópio Olympus IX71 com uma objectiva de imersão em água (1,2 UPLSAPO 60XW AN, Olympus). As imagens foram tiradas com a câmera Hamammatsu Orca-ER usando o software Andor QI e foram processadas para apresentação com ImageJ (https://rsb.info.nih.gov, National Institutes of Health).

análises imuno-histoquímica

técnica imuno-histoquímica foi realizada como previamente descrito [9,10]. Para a análise quantitativa, o número total de osteoblastos em, pelo menos, 6 campos foram contadas e foi calculada a percentagem de osteoblastos com imunorreactividade positiva para o gene estudado.

cultura de órgão

Calvaria de 4 dias de idade filhotes de rato CD1 foram especiais de consumo, cortada ao meio e colocados em meio BGJ (Sigma Aldrich) contendo 0,1% de albumina do soro bovino em uma inserção de cultura de células que suspende o órgão óssea entre a atmosfera e meio para CO ideal

2 de câmbio. Metade de cada calvária foi co-cultivadas com células PC3 pré-tratadas com hemina e a outra metade com células não tratadas PC3. Outros calvária foram colocadas em meio BGJ contendo 0,1% de albumina de soro bovino e utilizados como controlos. Outros metades tratados com insulina 20 ug /ml foram utilizados como controlos positivos da formação óssea. A cultura PC3 correspondente e o meio foram trocados a cada 2 dias e a experiência foi terminada no final de 7 dias. Naquele tempo, as metades calvária foram fixadas, descalcificadas, parafina-embedded, seccionado, corado com hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica stainned e analisados ​​como descrito anteriormente [13].

In vivo

próstata modelo intrabone câncer

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os padrões aceitos de cuidados com os animais e foram aprovados pelo Institutional animal Care e Use

Comitê da Universidade do Texas MD Anderson cancer Center. células PC3HO-1 ou PC3βgal foram injetadas nos fémures de ratos machos SCID (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA) como previamente descrito [13]. 3 × 10

5 CaP células por ratinho foi injectado com uma agulha de calibre 28 para as extremidades distais dos fémures direitos de 6 a 8 semanas de idade, ratinhos SCID machos intactos (n = 7 por grupo) de acordo com procedimentos descrito noutro local. A formação de osso foi avaliada por análise de raios-X. No final da experiência, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical depois de anestesia com isoflurano, (entregue pela abertura * método de gota *) após o qual as patas traseiras foram removidos e dissecados os tecidos musculares dos ossos de ambos o controlo e injectado membros posteriores de ratinhos portadores de xenoenxertos femorais. Os ossos dissecados foram então processados ​​para análises histológica.

A análise estatística

Todos os resultados são dados como média ± DP de 3 experiências independentes e separados, a menos que indicado de outra forma. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística com um limiar de

P Art 0,05 (*),

P Art 0,01 (**) e

P 0,001 (***)

Resultados

HO-1 em células PC3 prejudica o crescimento efeitos inibidores de células tumorais na proliferação de osteoblastos

In vivo

, as células PC3 predominantemente produzem efeitos de reabsorção óssea que levam a lesões ósseas osteolíticas [18].

In vitro

, foi bem documentado que quando PMOs foram co-cultivadas com células PC3 o número de PMOs diminuiu significativamente [13]. A fim de analisar o efeito de HO-1 na interacção entre as células APC e osteoblastos, HO-1 em células PC3 foi induzida pelo pré-tratamento com hemina (PC3 Hem) (80 pM, 24 h). PC3 Hem e células de controlo foram, então, co-cultivadas com PMOs durante 24 h. Confirmou-se o efeito inibidor de células PC3 na proliferação de osteoblastos como avaliado por

3H-timidina e o número de células (57% e 28%,

P

0,05; respectivamente) (Figura 1 A B ). Notavelmente, a co-cultura de PMOs com PC3 Hem restaurado proliferação de osteoblastos em níveis encontrados em PMOs crescimento sozinho (Figura 1 A B), enfatizando o papel pro-homeostático de HO-1. A indução de HO-1 em células PC3 foi confirmada em ARNm e os níveis de proteína (Figura 1).

As experiências foram efectuadas em PMOs cultivados sozinhos (PMO), co-cultivados com PC3 (PMO PC3) ou com PC3 pré-tratadas com hemina (PMO PC3 Hem). Um: A proliferação celular foi medida por

incorporação de 3H-timidina em PMOs após cultura de 24 horas. Os resultados são expressos como uma percentagem da monocultura PMOs fixado em 100%. B: número de células PMOs. C: análise Western blot foi efectuada utilizando anti-ciclina B1, A, e D1 e anti-p21

anticorpos WAF1 /Cip1. Os números sob as bandas indica a quantificação normalizada para p-tubulina e PMOs sozinho. Um representante de pelo menos três experiências independentes é mostrado (Diferença significativa, *

P Art 0,05; Não houve diferença significativa, NS)

As análises das proteínas envolvidas no ciclo celular. regulação por imunotransferência em PMOs após a co-cultura com Hem PC3 mostraram um aumento nos níveis de ciclina a, ciclina B e ciclina D1, com uma diminuição concomitante na p21

expressão WAF1 /CIP1, em comparação com PMOs cultivadas em co-cultura com células de controlo PC3 (Figura 1C). Além disso, a análise citométrica de fluxo de PMOs após a co-cultura com Hem PC3 demonstraram aumento significativo na acumulação de G2 /M, em comparação com a co-cultura com células de controlo PMOs PC3 (

P

0,05) (dados não mostrados) . Todos estes dados sugerem que HO-1 em células CaP induz a progressão do ciclo celular em PMOs, restaurar a taxa de crescimento de PMOs sozinho. Vale a pena observar que o número de células PC3 não foi modificado nas condições de co-cultura diferente ensaiadas (dados não mostrados).

HO-1 em células PC3 não altera os efeitos das células tumorais sobre osteoblastos diferenciação

níveis

transcrição de vários osteoblastos genes específicos foram avaliados por RT-qPCR. A expressão do factor de transcrição específico osteoblastos Runx-2, de um marcador de diferenciação precoce (fosfatase alcalina, ALP), de marcadores de final de diferenciação envolvidas na deposição de matriz de colagénio (colagénio do tipo I e colagénio de tipo II) e a deposição de matriz não colagenosa (osteocalcina , OCN) foi analisado. Descobrimos que Runx-2 expressão foi aumentado em PMOs co-cultivadas com Hem PC3 (130%,

P Art 0,05) (Figura 2 A), mas não foram detectadas diferenças nos níveis de ALP, colágeno tipo I e II, em PMOs crescimento isoladamente ou em co-cultura com Hem PC3 ou células de controlo PC3 (Figura 2 BD). níveis OCN foram significativamente menores em PMOs co-cultivadas com controles Hem PC3 ou PC3 (81% e 68%,

P Art 0,01; respectivamente) (Figura 2 E). De acordo com relatórios anteriores [13,19,20], PMOs co-cultivadas com células PC3 exibiram uma diminuição da formação da matriz calcificada como avaliado por coloração de von Kossa comparação com PMOs crescimento sozinho (Figura 2). Nenhuma alteração foi detectada na matriz calcificada quando PMOs foram co-cultivadas com Hem PC3 (Figura 2). Estes resultados demonstram que os factores secretados-PC3, descrita como responsável da inibição da diferenciação dos osteoblastos [13], não são alterados quando se HO-1 expressão é induzida em células tumorais.

As experiências foram efectuadas em PMOs cultivados sozinhos (PMO), co-cultivados com PC3 (PC3 PMO) ou com PC3 pré-tratadas com hemina (PMO Hem PC3). O ARN total foi extraído e Runx-2 (A), os níveis de ALP (B), colagénio do tipo I (C), colagénio de tipo II (D) e OCN (E) de ARNm foram analisadas por RT-qPCR. Os dados foram normalizados para a p-actina e foram expressos como relação de indução de dobragem para PMOs. Um representante de pelo menos três experiências independentes é mostrado (Diferença significativa, *

P Art 0,05; **

P Art 0,01).

HO -1 expressão em células PC3 diminuiu os níveis de factores moduladores de osteoclastos em osteoblastos

activador do receptor do factor nuclear kappa B ligando (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) são produzidos por células do estroma osteoblásticas /. RANKL foi mostrado para activar os osteoclastos maduros e mediar a osteoclastogénese. OPG actua como um receptor de engodo para RANKL [21]. A co-cultura de células Hem PMOs e PC3 produziu um aumento na RANKL e uma diminuição nos níveis de transcrito de OPG em osteoblastos; O mesmo resultado foi observado após a co-cultura de PMO com as células de controlo PC3 (Figura 3 A B).

As experiências foram efectuadas em PMOs cultivados sozinhos (PMO), co-cultivados com PC3 (PMO PC3) ou com PC3 pré-tratadas com hemina (PMO Hem PC3). O ARN total foi extraído e RANKL (A), OPG (B), CSF-1 (C), a OPN (D), os níveis de CCL2 (E) e IL-6 (F) de ARNm foram analisadas por RT-qPCR. Os dados foram normalizados para a p-actina e foram expressos como relação de indução de dobragem para PMOs. Um representante de pelo menos três experiências independentes é mostrado (Diferença significativa, *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P . 0.001)

Os osteoblastos também produzem citocinas e outros fatores de crescimento que promovem o desenvolvimento de osteoclastos e activação, como factor estimulador de colónias-1 (CSF-1), osteopontina (OPN), quimiocina (motivo CC ) de ligando 2 (CCL2) e interleucina-6 (IL-6). Descobrimos que PMOs co-cultivadas com PC3 Hem expressaram níveis significativos de transcritos menores de CSF-1, OPN e CCL2, em comparação com PMOs cultivadas isoladamente (52%,

P

0,01; 53%,

P Art 0,001 e 52%,

P Art 0,05; respectivamente). Não foram detectadas diferenças nos níveis de IL-6 níveis (Figura 3 C-F).

células CaP também expressam genes indiretamente envolvidos em osteoclastos modulação. Portanto, decidimos investigar a expressão em células PC3 de peptídeo paratireóide relacionada ao hormônio (PTHrP), uroquinase do tipo ativador do plasminogênio (UPA) e fator transformador de crescimento beta 1 (TGF-β1) por RT-qPCR ea atividade de metaloproteases de matriz 9 (MMP9) por zimografia. Não foram observadas diferenças nas transcrições níveis dos genes seleccionados ou na actividade de MMP9 (Figura 4), indicando que estes genes implicados em osteoclastos de modulação não estão alteradas em células PC3, nas condições experimentais, quer pré-tratados ou não com crescimento hemina sozinhos ou em co-cultura.

células PC3 foram pré-tratadas com hemina (80 iM, 24 h, colunas pretas) ou não (controlo, colunas brancas) e co-cultivadas com PMOs ou não. O ARN total foi extraído e PTHrP (A), uPA (B) e TGF-β1 níveis de ARNm (C) foram analisadas por RT-qPCR. Os dados foram normalizados para a p-actina e foram expressos como relação de indução de dobragem para PC3. Gelatina zimografia foi feito para avaliar a actividade de MMP9 em meio condicionado a partir de PC3 cultivados sozinhos (PC3), pré-tratadas com hemina (PC3 Hem) e de PMOs cultivados sozinhos (PMO) e co-cultivadas com PC3 pré-tratados ou não com hemina ( PMO PC3 Hem e PMO PC3, respectivamente). bandas claras foram quantificados usando software ImageJ 1.37.v (NIH) e normalizadas para proteína total. Um representante de pelo menos três experiências independentes é mostrado (NS: Não houve diferença significativa; RV: valores relativos).

O início do status de osteoblastos oxidativo por co-cultura com células PC3 hemina pré-tratados

relatórios anteriores indicam que o estresse oxidativo leva à diminuição do número de osteoblastos e taxa de formação óssea [22]. A fim de investigar se as células CaP induzir o stress oxidativo em osteoblastos, utilizou-se o nosso sistema de co-cultura para analisar a expressão de genes de resposta antioxidante (MnSOD, catalase e HO-1). A co-cultura de PMOs com Hem ou PC3 controles PC3 aumentou os níveis de transcrição de MnSOD (134% e 206%,

P Art 0,05; respectivamente) e catalase (95% e 35%,

P

0,05; respectivamente) em PMOs (Figura 5 a B). Curiosamente, HO-1 em osteoblastos expressão da proteína co-cultivadas com Hem PC3 ou PC3 controlos foi fortemente induzida em comparação com PMOs crescimento sozinho (Figura 5 C). Para determinar os níveis de estresse oxidativo, a geração de ROS foi medida por citometria de fluxo de monitoramento H

oxidação 2DCFDA. o aumento dos níveis significativos de ROS foram encontrados em PMOs co-cultivadas com Hem PC3 em comparação com PMOs crescimento sozinho (15%,

P

0,01) (Figura 5 D). Em conjunto, estes resultados sugerem que induziu HO-1 em células PC3 lançamentos fatores solúveis que levam ao estresse oxidativo em PMOs. Este, por sua vez induz uma resposta anti-oxidante, provavelmente, favorecendo a proliferação de osteoblastos [6].

As experiências foram feitas em PMOs cultivados sozinhos (PMO), co-cultivados com PC3 (PMO PC3) ou com PC3 pré-tratadas com hemina ( PMO PC3 Hem). O ARN total foi extraído e MnSOD (A) e catalase (B) os níveis de ARNm foram analisadas por RT-qPCR. Os dados foram normalizados para a p-actina e foram expressos como relação de indução de dobragem para PMOs. os níveis de proteína HO-1 (C) foram determinados por análise de Western blot. Os números sob as bandas indica a quantificação normalizada para p-actina sozinho e PMOs. níveis de ROS (D) foram determinados em PMOs incubadas com CM2-DCFHDA e medido por citometria de fluxo no canal FITC (Diferença significativa, *

P Art 0,05; **

P Art 0,01).

HO-1 em células PC3 activa a sinalização FOXO em células C2C12

A fim de identificar as vias ativadas pelo estresse oxidativo em osteoblastos sinalização, analisamos β-catenina /eixo Foxo. Embora canónica via Wnt /β-catenina desempenha um papel fundamental na regulação da diferenciação de osteoblastos e formação de osso, sabe-se bem que solúvel β-catenina interage com factores de transcrição FOXO em resposta ao estresse oxidativo [6]. Para estudar esta via de sinalização foi utilizada uma construção repórter com elementos de resposta de seis FOXO. Devido à dificuldade para transfectar PMOs, usamos uma linha de células mesenquimais não confirmadas, C2C12, capaz de diferenciar na linhagem osteoblástica [23]. A co-cultura de células C2C12 com PC3 Hem estimulou fortemente a actividade do gene repórter (Figura 6 A). Como controlo positivo C2C12 culturas foram expostas a H

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2 (100 uM) (Figura 6 A). Os resultados descritos aqui sugerem que os fatores solúveis produzidos por Hem PC3 induzir FOXO sinalização em osteoblastos.

Painel superior. As experiências foram efectuadas em C2C12 cultivados sozinhos (C2C12), co-cultivados com PC3 (C2C12 PC3) ou com PC3 pré-tratadas com hemina (C2C12 Hem PC3). A: As células foram transfectadas com uma construção de gene repórter FOXO (FOXO-Luc). H

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2 foi utilizado como um controlo positivo. B: As células foram transfectadas com um constructo repórter gene TCF (TOP-flash) ou o seu controlo negativo (FOP-flash). LiCl foi um controlo positivo. Seis horas após a transfecção, as células C2C12 foram co-cultivados e 24 horas após as células C2C12 co-cultura foram lisadas e ensaio de actividade de luciferase foi feito. Os dados foram normalizados para os valores de proteína. Um representante de pelo menos três experiências independentes, está mostrado (Diferença significativa, *

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0,05). painel inferior. C: distribuição celular p-catenina foi visualizado por coloração de imunofluorescência (vermelho) de PMOs cultivados sozinhos (PMO), co-cultivados com PC3 (PMO PC3) ou com PC3 pré-tratadas com hemina (PMO Hem PC3). O núcleo foi rotulado usando corante Hoescht (verde). Mesclar representa as imagens sobrepostas. Uma imagem representativa de cada grupo é mostrado. Barra de escala: 30 ^ m.

Na via de Wnt canónica, os resultados de activação β-catenina em estabilização da translocação de proteína para o núcleo, onde interage com TCF (factor de células T, a caixa HMG) e activa a transcrição de genes alvo [24]. Tem sido sugerido que Foxo desviar β-catenina da via canonical Wnt [6]. Para avaliar se via canônica Wnt em PMOs é alterada após co-cultura com células APC, examinamos β-catenina localização subcelular e ativação TCF em PMOs crescimento sozinho ou em co-cultura com células Hem PC3 e controle PC3. As imagens mostram na Figura 6 C demonstram que β-catenina localiza-se tanto no núcleo e no citoplasma, em todas as condições analisadas. Para avaliar a activação do β-catenina /via TCF foi utilizado um gene repórter. Nós co-cultivadas células PC3 pré-tratados ou não com hemina com células C2C12 que tinham sido transfectadas com uma construção de gene repórter TCF (TOP-flash) [15]. células C2C12 tratadas com LiCl (20 mM) foram usados ​​como um controlo positivo e a actividade repórter FOP-flash como um controlo negativo. Não houve diferença na actividade repórter TCF foram detectados quando as células C2C12 foram cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com células de controlo Hem PC3 ou PC3 (Figura 6 B).

explante de osso de co-cultura com células PC3 induz a HO-1 expressão

Para estender estes resultados, foi utilizado um ensaio de cultura de órgãos óssea. PC3 Hem ou células de controlo PC3 foram co-cultivadas com explantes de rato calvária. A análise histológica não mostraram diferenças na formação do osso quando calvária foram cultivadas sozinho (controle) ou em co-cultura (Figura 7 A-C). Usando a técnica de imuno-histoquímica que próxima explorou a expressão de HO-1. Como mostrado na Figura 7 (E-H) a percentagem de osteoblastos activas com HO-1 reactividade positiva era maior na co-cultivadas com as células de tumor do que em controlos calvária.