Abstract
Os resultados promissores de quinase de linfoma anaplásico (ALK) inibidores mudaram o significado das fusões ALK em vários tipos de câncer. Estas fusões já não são apenas objectivos de investigação ou marcadores de diagnóstico, mas são agora directamente ligado ao benefício terapêutico de pacientes. No entanto, a maioria dos tecidos tumorais disponíveis em ambientes clínicos são fixados em formalina e (FFPE) embebidos em parafina, e isso limita significativamente estudos genéticos detalhados em muitos casos clínicos. Apesar de recentes melhorias técnicas permitiram a análise de algumas mutações conhecidas em tecidos FFPE, identificando genes de fusão desconhecidos usando somente tecidos FFPE continua difícil. Desenvolvemos uma amplificação 5′-rápida de cDNA sistema otimizado para tecidos FFPE fins-de-base e avaliado este sistema em um tecido de câncer de pulmão com
ALK
rearranjo e sem os 2 fusões ALK conhecidos EML4-ALK e KIF5B-ALK . Com este sistema, foram identificados com sucesso um romance de fusão ALK, KLC1-ALK. O resultado foi confirmado pela reação reversa da cadeia de polimerase e fluorescência
in situ
hibridização. Em seguida, sintetizamos o ADNc de comprimento completo putativo de
KLC1-ALK
e demonstraram o potencial de transformação da quinase de fusão com os ensaios utilizando células 3T3 de ratinho. Para o melhor de nosso conhecimento, KLC1-ALK é o primeiro romance de fusão oncogénica identificados usando apenas tecidos FFPE. Esta descoberta vai ampliar o valor potencial de tecidos FFPE arquivamento e proporcionar um maior discernimento biológicos e clínicos em câncer de pulmão ALK-positivo
Citation:. Togashi Y, Soda M, Sakata S, Sugawara E, Hatano S, Asaka R , et ai. (2012) KLC1-ALK: uma fusão Novel em Câncer de Pulmão identificado através de um tecido parafina-encaixado fixado em formol Only. PLoS ONE 7 (2): e31323. doi: 10.1371 /journal.pone.0031323
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 17 de outubro de 2011; Aceito: 05 de janeiro de 2012; Publicação: 08 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Togashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, bem como por doações da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência; o Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão; a competência do veículo Fundação Comemorativa do Japão; Fundo de Investigação princesa Takamatsu Câncer; ea Fundação Memorial Uehara. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
quinase do linfoma anaplástico (ALK) é um receptor tirosina-quinase que foi descoberta em linfomas de células grandes anaplásicas (ALCL) sob a forma de uma proteína de fusão, a NPM-ALK [1], [2]. A formação de uma proteína de fusão com um parceiro através de translocações cromossómicas é o mecanismo mais comum de ALK ALK sobre-expressão e activação do domínio quinase. resultados promissores recentes de ensaios clínicos com um inibidor da ALK, crizotinib, mudaram o significado das fusões ALK no cancro do pulmão [3], [4], [5], [6], tumores inflamatórios miofibroblásticas (IMTS) [7], e ALCL [8]. fusões ALK já não são alvos mera investigação ou marcadores de diagnóstico e agora estão diretamente ligados ao benefício terapêutico dos pacientes.
No cancro do pulmão, 3 parceiros de fusão de ALK foram relatados-EML4, TFG, e KIF5B-embora a presença de TFG-ALK no cancro do pulmão não foi ainda provada com a evidência histopatológica [9], [10], [11]. Além de câncer de pulmão, ALK tem ainda mais foi encontrado para gerar fusões em ALCL (fundidos a NPM, TPM3, TPM4, ATIC, TFG, CLTC, MSN, MYH9 ou ALO17) [1], [2], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], IMT (TPM3, TPM4, CLTC, carros, RANBP2, ATIC, ou SEC31A) [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], linfoma de culas B grandes ALK-positivo (CLTC, a NPM, SEC31A, ou SQSTM1) [25], [26], [27], [ ,,,0],28], e cancro renal (VCL, TPM3 ou EML4) (Tabela 1) [29], [30]. Além TFG-ALK no cancro do pulmão, algumas fusões ALK foram relatados sem evidência histopatológica:. TPM4-ALK em carcinoma de células escamosas do esôfago [31], [32] e EML4-ALK no cólon e da mama carcinomas [33]
Anti-ALK imunohistoquímica desempenhou um papel importante na identificação desses parceiros de fusão ALK. Vários fusões ALK exibem um padrão de coloração característico em imunohistoquímica anti-ALK porque a localização subcelular de proteínas de fusão ALK depende do parceiro de fusão. Por exemplo, a NPM-ALK, que representa a fusão mais comum em ALK-positivo ALCL (85%), exibe um padrão de coloração nuclear e citoplasmática porque o heterodímero de NPM e NPM-ALK localiza no núcleo e o homodímero da NPM-ALK no citoplasma; CLTC-ALK exibe um padrão granular citoplasmática porque localiza nas pequenas vesículas. Se um tumor exibe um padrão reconhecido coloração anti-ALK, o paciente pode ter um parceiro de fusão romance. Além da diferença de localização subcelular, a diferença na intensidade de coloração é a chave para a identificação de novos parceiros. EML4-ALK é dificilmente manchado por imunohistoquímica convencional anti-ALK [11], [34]. Para superar esta limitação, foi desenvolvido o método intercalada polímero-anticorpo melhorada (IAEP), a qual aumenta moderadamente a sensibilidade do sistema de detecção imunohistoquímica, e EML4-ALK foi consistentemente corados com este método de [11]. Isto indicou que um tumor que é positivamente imunocoradas para ALK apenas por um método de imuno-histoquímica sensíveis, mas não por meio de métodos convencionais podem albergar uma fusão ALK romance. Com base nesta hipótese, foram identificados com sucesso PPFIBP1-ALK em 2 casos de TMI que eram positivos em imunohistoquímica anti-ALK apenas quando coradas pelo método IAEP [35].
Anti-ALK imunohistoquímica pode, assim, ser útil para detectar tumores candidatos para um romance de fusão ALK. No entanto, para identificar o parceiro de fusão, outras técnicas de biologia molecular são geralmente necessários, tais como a amplificação 5′-rápida de extremidades de ADNc (5′-RACE) ou inverso de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR). Para o melhor do nosso conhecimento, não há novas fusões oncogênicos foram descobertos usando tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) só porque os ácidos nucleicos extraídos de tecidos FFPE são severamente degradados durante o processo de fixação. No presente estudo, foi desenvolvido um método 5′-RACE otimizado para
ALK
fusão detecção de parceiro que era aplicável aos tecidos FFPE e identificou uma fusão novela, cinesina cadeia leve 1 (KLC1) alc, no cancro do pulmão usando apenas um tecido FFPE.
Métodos
Materiais
um bloco de tecido FFPE de adenocarcinoma pulmonar in situ, não-mucinoso (anteriormente chamado de carcinoma bronquioloalveolar) [36], que foi excisadas a partir de um paciente do sexo feminino de 47 anos de idade, foi utilizado [37]. Este carcinoma foi negativo para EML4-ALK e ALK-KIF5B, embora a presença de
ALK
rearranjo foi confirmada por anti-ALK IAEP imuno-histoquímica e uma fluorescência dividida em hibridação in situ (FISH) para ensaio de ALK (daqui em diante referido como o caso de fusão desconhecido ALK-positivos) (Figura 1) [37]. Também foram utilizados dois blocos de tecido FFPE de casos de tumor ALK-positivos, para o qual já tinha sido confirmada a presença de EML4-ALK ou KIF5B-ALK. O ARN total foi extraído a partir de cada tecido FFPE com a utilização do kit de isolamento de RECOVERALL ™ Ácido Nucleico total para FFPE (Applied Biosystems Japão, Tokyo, Japão). As idades dos 3 blocos FFPE utilizadas (tempo de produção de tecido FFPE para extração de RNA) foram 65, 40 e 51 meses para o caso de fusão positivo ALK desconhecida, EML4-ALK, e KIF5B-ALK, respectivamente. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Cancer Center Shizuoka (aprovação ID 22 J132-22-1) ea Fundação Japonesa para Pesquisa do Câncer (ID aprovação 2010-1011).
O painel A mostra a resultados de imunohistoquímica anti-ALK com o método IAEP em adenocarcinoma pulmonar in situ, não-mucinoso. O padrão de coloração foi difusamente citoplasmática. O lado basal de células tumorais foi mais fortemente corados, indicando uma localização subcelular da proteína desigual KLC1-ALK. As análises FISH revelou que este caso foi positivo no ensaio de divisão para
ALK
(Painel B: são observados individuais 5′- e 3′-sinais) e negativa em
EML4-ALK
e
KIF5B-ALK
ensaios de fusão (Painel C:
EML4
, vermelho;
ALK
, verde; Painel D:
KIF5B
, verde;
ALK
, vermelho).
Modificado 5′-RACE para fusões ALK aplicáveis aos tecidos FFPE
5′-RACE foi realizada com o SMARTer RACE Kit cDNA Amplification (Clontech ) de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Em resumo, em vez dos iniciadores incluída no kit, ALK-3242R (5′-CTCAGCTTGTACTCAGGGC-3 ‘) foi utilizado para a síntese de cDNA. O ADNc foi submetido a 5′-RACE PCR utilizando Polimerase de ADN Primestar HS (Takara) e os seguintes iniciadores: Iniciador Universal uma mistura de o kit e ALK-3206R (5’-ATGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTT-3 ‘). A condição de PCR consistia em 5 ciclos a 94 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 3 min; 5 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 70 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 3 min; e 30 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 3 min.
FISH
análise FISH de genes de fusão foi realizada com sondas de ADN para KLC1 e ALK. seções não coradas (4 mm de espessura) foram submetidos a hibridização com um conjunto de sonda ALK-split (Dako, Tóquio, Japão) ou com cromossomo artificial (BAC) sondas bacterianos derivados de clones para ALK (RP11-984I21 e RP11-62B19) e KLC1 (RP11-186F6). lâminas hibridadas foram então coradas com DAPI e examinadas usando um microscópio de fluorescência BX51 (Olympus, Tóquio, Japão).
Síntese do cDNA putativo da
KLC1-ALK
Dois PCRs independentes foram realizados utilizando ADNc sintetizado a partir de um tecido tumoral que expressa KIF5B-ALK com os seguintes conjuntos de iniciadores: KLC1-NheI-H (5′-GCGCTAGCGAATGTATGACAACATGTCCAC-3 ‘) e KLC1-BPR (5′-GTGCTTCCGGCGGTACACATCTACAGAACCAAACTC-3′), e ALK-FBP (5’-GGGAGTTTGGTTCTGTAGATGTGTACCGCCGGAAGC-3 ‘) e ALK-EcoRI (5′-GATAGAATTCTCAGGGCCCAGGCT-3’). Em seguida, a segunda PCR foi realizada utilizando uma diluição de uma mistura dos primeiros produtos de PCR tal como um modelo com os iniciadores KLC1-NheI-M e ALK-EcoRI (Figura 2) 1/100.
Dois primeiro- os PCRs foram realizados separadamente redondos utilizando ADNc sintetizado a partir de um tecido tumoral que expressa KIF5B-ALK com os seguintes conjuntos de iniciadores: KLC1-NheI-M e KLC1-BPR, e ALK-FBP e ALK-EcoRI. KLC1-BPR e ALK-BPF teve sequências a jusante do ponto ALK quebra (exão 20) e a montante do ponto de quebra KLC1 (exão 9) como sequências adoptante, respectivamente. Em seguida, a segunda PCR foi realizada utilizando uma diluição da mistura dos primeiros produtos de PCR como modelo com os iniciadores KLC1-NheI-M e ALK-EcoRI 1/100. Os primeiros produtos de PCR foram emparelhados, estendido com o outro, e, em seguida, amplificado com os primers.
Transformação ensaio para
KLC1-ALK
Análise do transformador actividade de fusões de quinase foi realizada como descrito anteriormente [9], [38], [39]. Um plasmídeo de expressão baseado no pMXS para cada fusão foi utilizada para gerar os retrovírus recombinantes ecotrópicas [40], que foram, então, utilizados individualmente para infectar fibroblastos 3T3 de ratinho. A formação de focos transformados foi avaliada após cultura das células durante 4 dias. O mesmo conjunto de células 3T3 foi injectada por via subcutânea em ratinhos nu nu /, e a formação do tumor foi examinado após 14 dias. Os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Medicina Jichi (ID aprovação 1135).
Resultados
Identificação
KLC1-ALK
como novo
ALK
gene de fusão
Os nossos fragmentos de cDNA 5′-RACE fielmente isoladas modificados para
EML4-ALK
ou
KIF5B-ALK
de tumores positivos ALK conhecidos (Recurso Figura S1A e B). Em seguida, tentou isolar fragmentos de cDNA abrangendo os pontos de fusão a partir do caso de fusão positivo desconhecido ALK. O seqüenciamento de tais produtos 5′-RACE revelou que 2 de 10 clones continha o extremo 3 ‘do exão 9 de
KLC1
(ENST00000348520) fundido ao primeiro nucleotídeo do exon 20 do
ALK
(ENST00000389048), indicando a presença de uma fusão romance entre
KLC1
e
ALK
. Como este rearranjo constituía uma fusão em grelha entre os 2 genes, a todo o comprimento
KLC1-ALK
ADNc provavelmente produz uma proteína de 984 aminoácidos contendo um grupo amino-terminal de dois terços de KLC1 e uma região intracelular de ALK (Figura 3A). isolamento de RT-PCR mediada por um ponto de fusão confirmou com sucesso a fusão em grelha entre os 2 mensagens (Figura 3A e B). Além disso, para confirmar o rearranjo genómico responsáveis pela fusão, um ensaio de FISH foi realizada de fusão (Figura 3C). Estes resultados eram consistentes com a presença de t (2; 14) (p23; q32.3), que conduz à geração de
KLC1-ALK
O painel A mostra a estrutura esquemática de. KLC1, ALK e KLC1-ALK proteínas e a sequência de cDNA em torno do ponto de fusão. azul escuro, laranja e peças vermelhas representam espiral enrolada, transmembrana e domínios quinase, respectivamente. Os exões de pontos de quebra e o número de amino ácidos são indicados. ALK-específica KLC1-RT-PCR usando RNA extraído de tecido FFPE do processo de fusão ALK-positivo desconhecida amplificado um fragmento de tamanho esperado do produto (140 pb, painel B) com a sequência de fusão consistente (Painel A). Um ensaio de FISH de fusão para
KLC1-ALK
revelou um sinal de fusão (amarelo) em várias células tumorais (painel C). M, marcador (escada de 100 pb); S, amostra (no caso de fusão-positiva desconhecido ALK); N, nenhum controle modelo.
Transformar o potencial de
KLC1-ALK
O cDNA completo putativo da
KLC1-ALK
foi sintetizado a partir do tecido congelado com expressão de fusão KIF5B-ALK (Figura 2, Figura suplementar S2), e foi utilizado para gerar um retrovírus recombinante que exprime a proteína de fusão com um epitopo marcador FLAG no terminal amino. A infecção de células 3T3 com o vírus expressando KLC1-ALK facilmente produzidos múltiplos focos transformados em cultura e tumores subcutâneos do rato num ensaio de tumorigenicidade nu (Figura 4), confirmando a capacidade de transformação potente de KLC1-ALK.
painéis superiores : fibroblastos de rato 3T3 foram infectadas com retrovírus que codificam KLC1-ALK ou EML4-ALK ou com o vírus vazio correspondente (Mock). As células foram fotografadas após 4 dias de cultura. barra de escala, 1 mm. painéis inferiores: ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com células 3T3 correspondentes, e a formação do tumor foi examinado após 14 dias. O número de tumores formados por injeções é indicado na parte inferior.
Discussão
Aqui, por meio da análise única dos tecidos FFPE, descobrimos com sucesso um romance de fusão ALK, KLC1-ALK. Enquanto snap-congelados materiais amostrados a partir de espécimes biopsiados ou removidos cirurgicamente pode ser usado para vários tipos de análises moleculares, eles não são rotineiramente amostrado na maioria dos ambientes clínicos. Em contraste, as amostras FFPE geralmente são produzidos e histopatologia diagnóstica arquivos são uma extremamente grande de recursos de tecidos FFPE em laboratórios de patologia de diagnóstico comuns. No entanto, o ADN e o ARN extraído de tecidos FFPE são severamente degradada durante a fixação de formalina e geralmente não são apropriados para os ensaios que necessitam de muito tempo de ADN /ARN de alta qualidade. avanços técnicos recentes permitiram que algumas análises de mutações pontuais conhecidos e genes de fusão conhecidas, mas ainda é difícil identificar uma aberração gene não reconhecido utilizando apenas um tecido FFPE.
Na maioria
ALK
fusões, o ponto de ruptura de
ALK
está localizada dentro do intrão 19, e o ponto de fusão em ARNm é tipicamente o primeiro nucleótido no exão 20. por conseguinte, se os iniciadores de 5? -RACE são colocados imediatamente a jusante do primeiro nucleótido de
ALK
exão 20, tais 5′-RACE pode isolar com sucesso produtos de PCR contendo a sequência do gene parceiro mesmo usando tecidos FFPE. Com base nesta hipótese, foi estabelecido um sistema de 5′-RACE para
ALK
fusões otimizados para tecidos FFPE. Com este sistema, identificamos um romance
ALK
fusão,
KLC1-ALK
. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro romance de fusão oncogénica identificados utilizando apenas um tecido FFPE.
Cuidado, no entanto, é necessário. Em alguns casos raros, a
ALK
fusão, o ponto de quebra de
ALK
fusão mRNA pode não estar na extremidade 5 ‘do exão 20. Por exemplo, na variante 4 de
EML4-ALK
, exão 14 do
EML4
é fundida com uma sequência desconhecida de 11 pb, que por sua vez está ligado ao nucleótido 50 da
ALK
exão 20 (E14; ins11; del49A20) [38]. Nosso sistema de 5′-RACE não iria funcionar em tal caso, porque o iniciador inverso ALK-3206R corresponde aos nucleótidos 12-34 de
ALK
exão 20. Portanto, se o nosso modificado 5′-RACE não consegue isolar fusão cDNAs de casos com um rearranjo de ALK confirmada, outras configurações de iniciadores pode ser tentada.
cinesina é um heterotetrâmero da cinesina 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves de cinesina e move-se sobre os microtúbulos para a sua realização mais termina várias cargas . As cadeias pesadas abrigar a actividade motora, enquanto que as cadeias leves desempenham um papel na ligação de carga e na modulação da actividade e localização subcelular das cadeias pesadas. KLC1 liga-se aos cinesina cadeias pesadas com um domínio N-terminal e a várias cargas através dos domínios de repetição tetratricopeptide [41], [42]. Dos 3 histopatologia confirmou parceiros de fusão ALK em cancro do pulmão, EML4 colocaliza com microtúbulos e podem contribuir para a estabilização de microtúbulos [43], KIF5B se move sobre os microtúbulos como uma cadeia pesada de cinesina [44], e KLC1 se liga a cinesina cadeias pesadas como uma cadeia leve cinesina. Por isso, é interessante que todos os 3 fusões ALK no câncer de pulmão são susceptíveis de colocalize com microtúbulos.
A fusão ALK mais frequente no cancro do pulmão é EML4-ALK (4-7%) [9], [ ,,,0],38], eo segundo é KIF5B-ALK (0,5%) [11]. Um caso com TFG-ALK é relatada [10]. KLC1-ALK pode ser raro, mas existe no adenocarcinoma de pulmão, e os pacientes com esta fusão são altamente susceptíveis de beneficiar do tratamento com inibidores da ALK assim como pacientes com outras fusões ALK. A incidência pode ser baixo, mas o significado dessa fusão é muito elevada a partir da perspectiva de uma opção terapêutica feito sob medida para o paciente. Outro ponto importante é que KLC1-ALK foi encontrado no adenocarcinoma in situ, não-mucinoso (anteriormente chamado de carcinoma bronquíolo, BAC). BAC é reconhecido raramente a abrigar fusões ALK, embora um pequeno número de casos de TAS foi examinado para a fusão ALK comparação com adenocarcinoma invasivo. Seria interessante do ponto de vista pathobiological para examinar uma coorte de larga escala de BAC e outras condições pré-malignas de fusão ALK
3 Existem métodos para a detecção de fusões: ALK. RT-PCR, ALK dividir FISH, e de alta sensibilidade imunohistoquímica anti-ALK. Para RT-PCR, o “gene parceiro 5 deve ser conhecida. Nossos achados deste estudo identificou mais um gene parceiro que devem ser alvo de detecção de ALK-fusion usando RT-PCR em câncer de pulmão. Os outros 2 métodos pode detectar todas as fusões de ALK independente do parceiro de fusão e, por conseguinte, são adequados para o rastreio de ALK-fusão. Em outras palavras, esses métodos 2 não pode identificar o parceiro de fusão e necessitam de ser conseguido por específica do parceiro de RT-PCR e /ou FISH de fusão para esta finalidade. Se é revelado que o gene parceiro no caso testado é desconhecida, um novo gene parceiro é altamente susceptível de ser descoberto, como foi demonstrado no presente estudo. Na verdade, utilizando alta sensibilidade anti-ALK imuno-histoquímica (método IAEP) como triagem, foram identificados vários novos fusões ALK em vários tipos de cancros, incluindo o adenocarcinoma do pulmão [11], linfoma [28], do sarcoma [35], e de células renais carcinoma [30].
Muitas ferramentas eficientes foram estabelecidos para a detecção de casos de fusão positivo ALK usando tecidos FFPE, incluindo anti-ALK imunohistoquímica e FISH. Nossas descobertas irá expandir ainda mais o valor potencial de tecidos FFPE de arquivamento e proporcionar novas perspectivas clínicas e biológicas em cancros ALK-positivo na próxima era da terapia com inibidor da ALK.
Informações de Apoio
Figura S1. produtos a partir de 5′-RACE usando tecidos FFPE. Nossa modificado 5′-RACE isolado fielmente fragmentos de cDNA para
EML4-ALK
(A) ou
KIF5B-ALK
(B) a partir de tumores positivos ALK conhecidos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031323.s001
(TIF)
Figura S2.
sequência de ADNc putativos de KLC1-ALK. O cDNA completo putativo da
KLC1-ALK
foi sintetizado a partir do tecido congelado com expressão de fusão KIF5B-ALK
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031323.s002
(PDF)
Reconhecimentos
Agradecemos ao Sr. Motoyoshi Iwakoshi, Ms. Keiko Shiozawa, Ms. Tomoyo Kakita, e Ms. Kimie Nomura para a sua assistência técnica, e Ms. Sayuri Sengoku para a prestação de assistência administrativa.