: PLOS ONE

Sumário

Para explorar a diversidade e consistência das vias de sinalização que regulam a migração de células tumorais, escolhemos três linhas celulares de tumores humanos que migraram após o tratamento com EGF. Em seguida, quantificaram o efeito de inibidores de quinze sobre os níveis de expressão ou os níveis de fosforilação de nove proteínas que foram induzidas por estimulação por EGF em cada uma destas linhas celulares. Com base nos dados obtidos neste estudo e pressupostos químico-biológicos, deduzimos caminhos de migração de células em cada linha de células tumorais, e, em seguida, comparou-os. Como resultado, verificou-se que tanto o MEK /ERK e vias JNK /c-Jun foram activadas em todas as três linhas de células que migram. Além disso, a GSK-3 e p38 foram encontrados para regular a via PI3K /Akt em apenas células EC109, e JNK foi encontrada a crosstalk com p38 e via relacionada Fos nas células apenas TT. Tomados em conjunto, o nosso sistema analítico pode facilmente distinguir entre as vias específicas do tipo comuns e celulares responsáveis ​​pela migração de células tumorais

Citation:. Magi S, Saeki Y, Kasamatsu M, Tashiro E, Imoto M (2014) Chemical As análises genômicas Caminho-Based para a sinalização Fator de Crescimento epidérmico-Mediated em células cancerosas migratórias. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10.1371 /journal.pone.0096776

editor: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 10 de novembro de 2013; Aceito: 11 de abril de 2014; Publicado em: 12 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Magi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Grant-in-Aid para contestar Investigação exploratória e JSPs Fellows, o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, no Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a migração celular é essencial para muitos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, respostas imunológicas, bem como a invasão da célula tumoral e metástase [1]. Quando uma célula tumoral move-se, de várias vias de sinalização são iniciados através de tirosina-quinases receptoras (RTKs), receptores acoplados à proteína G (GPCRs), integrinas, e outros receptores. Um exemplo notável de uma RTK é o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que é activada por ligação do seu ligando, o factor de crescimento epidérmico (EGF) [2]. A activação do EGFR conduz à activação de um ou mais ramos de rede de sinalização intermédios que regulam a motilidade celular, tais como a cinase (ERK) via extracelular regulado [3], a fosfoinositida 3-OH quinase (PI3K) [4], a quinase Janus (Jak) via [5], o c-Jun NH2 do terminal quinase (JNK) caminho, e da via p38 [6], [7].

os elementos centrais da migração de sinalização intracelular rede foram demonstradas em estudos anteriores. No entanto, é provável que as moléculas de sinalização que regulam a migração celular em uma célula cancerosa pode não regulam a migração celular nas outras células cancerosas geneticamente distintas. Vários relatórios anteriores indicaram que cada tipo de célula de cancro inicia migração em diferentes contextos usando repertórios moleculares distintas, embora o mesmo processo básico da migração das células é induzido [8], [9]. Portanto, compreender a diversidade e a generalidade das vias de sinalização que regulam a migração de células tumorais em vários tipos de células é importante não apenas para a investigação básica em migração de células, mas também para o desenvolvimento de drogas anti-tumorais anti-metastáticos.

para abordar esta questão, que anteriormente investigou o efeito de inibidores de pequenas moléculas sobre tipos de sistemas de migração de dez celulares. Distinguimos entre os sinais específicos do tipo comuns e celulares responsáveis ​​pela migração de células [10]. Pesquisas anteriores indicaram que as moléculas estão realmente envolvidos na migração de células de cada tipo de células cancerígenas. No entanto, as redes de sinalização destas moléculas que regulam a migração celular permanecem obscuros. Neste relatório, para resolver este problema, utilizamos uma abordagem que combina genética química e biologia de sistemas, que tem sido gradualmente reconhecido como um método útil para deduzir sinalização redes via [11]. No nosso relatório anterior, verificou-se que linhas de células de três cancro (ou seja, células de carcinoma epidérmico A431, células de carcinoma EC109 esofágicas, e células da tiróide carcinoma TT) adquirido a motilidade celular através da estimulação EGF, mas análise de agrupamento quimiossensibilidade mostrou que as células A431 e células EC109 são cluster no mesmo grupo, por outro lado, as células T são classificados em diferentes cluster. Portanto, neste estudo, para revelar a diversidade e uniformização da via de sinalização induzida por EGF regula a migração de células nestes três células, que quantitativamente examinou o efeito de inibidores químicos sobre os níveis de expressão induzida por EGF ou o nível de fosforilação de várias moléculas de sinalização para identificar que actua molécula de sinalização a montante de outras moléculas de sinalização. Usando os resultados destas experiências, que mapeada uma via migração de células em cada linha celular de cancro, e comparado os mapas de vias para revelar a topologia de rede como sendo ou comum a todas as células cancerosas ou específica para certos tipos de células.

resultados

os padrões de ativação diferentes de sinalização de EGF entre linhas de células cancerosas três

em primeiro lugar, nós detectamos a fosforilação ou a expressão de moléculas de sinalização induzida por EGF em três linhas celulares de cancro ao longo de um curso de tempo (Figura 1 e S1). A autofosforilação do receptor de EGF e subsequente fosforilação induzida por EGF de p38 ambos observados em todas as linhas de células depois de 5 minutos a seguir à estimulação do EGF, tal como é bem conhecido. O aumento na expressão de c-fos e a fosforilação de c-Jun foram observadas em todas as linhas de células de 1 h após a estimulação EGF. Por outro lado, várias outras moléculas mostraram diferentes perfis de activação dependentes do tempo entre as três linhas de células de cancro. Por exemplo, foi induzida a fosforilação de Akt (resíduos P-Akt, S473 e T308) entre 5 minutos e 1 hora após a estimulação EGF em células EC109 e células TT. No entanto, os níveis de fosforilação de P-Akt (S473) e P-Akt (T308) em células A431 foram um pouco constante, mesmo após estimulação por EGF de até 12 h. Além disso, a intensidade relativa de P-Akt (T308) mostraram uma intensidade máxima 5 minutos após a estimulação por EGF em células T, mas depois de 1 h em células EC109. O padrão de fosforilação de ERK (ERK-P) também é diferente entre as três linhas de células de cancro. ERK foi transitoriamente fosforilada por estimulação por EGF em todas as três células, ao passo que o seu pico foi observado cinco minutos após a estimulação EGF em células A431 e células EC109, e depois de 1 h em células TT. O nível de expressão de EGFR começou a diminuir após a estimulação EGF em células EC109 e células T, mas não em células A431.

células A431, células EC109, e as células T foram estimuladas por EGF (30 ng ml

-1) durante o tempo indicado e os lisados ​​celulares totais foram submetidas a transferência de western. A.U., unidade arbitrária normalizados pela intensidade da actina. Os meios e SDS de três experiências independentes são apresentados. As cores do gráfico representam cada dados de linha de células: células A431 (vermelho), as células EC109 (verde), e as células T (azul). A linha pontilhada indica que a estimulação EGF não causar uma mudança significativa de A.U. de cada molécula (One-way ANOVA). imagens immunoblot originais são mostrados na Figura S1.

Os efeitos dos inibidores de migração sobre a migração induzida por EGF sinalização

Em seguida, examinou os efeitos de 15 inibidores, o que afetou a capacidade de células para migrar no nosso relatório anterior [10], sobre a fosforilação ou a expressão destas moléculas de sinalização no ponto de tempo que mostram a maior intensidade de cada molécula de sinalização induzida por EGF, tal como indicado pelos dados do curso do tempo (Tabela S1) em cada linha celular de cancro ( Figura S2). Tabela S2 lista os nomes e as concentrações experimentais utilizados os inibidores de transdução de sinal de químicos utilizados no presente estudo, e os seus modos de acção. As imagens de imunotransferência da Figura S2 incluem bandas de cada uma de quatro condições: controlo negativo (EGF – e inibidor -, pista 1), controlo positivo (EGF + e inibidor -, pista 2), ambos EGF e inibidor-tratada condição (EGF + e inibidor +, pista 4) – e inibidor +, pista 3), e o estado (EGF inibidor-tratada. Para quantificar o efeito dos inibidores, que, em seguida, normalizou a intensidade de sinal de modo que a pista 1 (isto é, condição de não-tratado) foi designado como 0, e a pista 2 (isto é, a condição tratada-EGF) foi designado como 1. Com base em estes padrões, quantificou a intensidade relativa do sinal de pistas 3 e 4, e, finalmente, obtido conjunto de dados quantitativa do efeito de inibidores químicos de sinalização migração induzida por EGF em cada linha de células (Figura 2).

mapas de calor descrevem os efeitos de inibidores de moléculas pequenas sobre a sinalização induzida por EGF em células A431 (parte superior), as células EC109 (meio), e as células T (de fundo). Os dados foram normalizados por centragem condição não mimo como 0, e escamação condição tratadas com EGF para 1. Todas as linhas celulares foram tratadas com o EGF após pré-tratamento com os inibidores durante 15 min. Após o tempo indicado, as células foram recolhidas e submetidas a transferência de Western. AMD; Actinomicina D, CHX; Cycloheximide, HMA; Herbimicina A. A concentração de inibidores químicos são listados na Tabela S2. imagens immunoblot originais são mostrados na Figura S2.

Dedução de sinalização migração em linhas celulares de três cancro

Em seguida, tentou deduzir a rede de sinalização que regula a migração de células em cada linha de células de câncer de base sobre os perfis obtidos a quimiossensibilidade sobre o estado de expressão de EGF-induzida moléculas de sinalização. No campo da biologia química, uma via de sinalização pode ser deduzida utilizando o conceito descrito na Figura 3 (ver também, Procedimentos experimentais). Para determinar se os inibidores perturbado as moléculas de sinalização ou não, que definido ± 0,5 como um limiar. No caso da Figura 3a, o U0126 inibidor MEK suprimiu a fosforilação induzida por EGF de ERK (ERK-p) por mais de 50%. Nesses casos, foram definidos dois regulamentos sinal positivo; um de EGFR para MEK, e o outro a partir de p-MEK de ERK. No caso da Figura 3b, o inibidor de PI3K LY294002 aumento induzido por EGF expressão de c-fos por mais do que 50%. Nestes casos, que definiu a existência de uma relação positiva de regulação do EGFR c-Fos e um relacionamento regulação negativa de PI3K a c-Fos. No caso da Figura 3C, a SB415286 inibidor de GSK-3 aumentou a expressão de c-Jun, sem estimulação EGF. Nestes casos, que definiu a existência de uma relação positiva de regulação de EGFR em c-Jun e uma relação de regulação negativa de GSK-3 a C-jun. Desta forma, com base no perfil semi-quantitativo (Figura 2 e o conceito descrito na Figura 3), que deduz uma rede de sinalização para cada linha celular de cancro como um grafo orientado assinado (Figura 4). A via de migração induzida por EGF em células A431 consistiu de 19 nós e 39 extremidades (Figura 4A), a via em células EC109 consistiu de 22 nós e 62 extremidades (Figura 4b), e a via em células TT consistiu de 21 nós e 51 bordas (Figura 4c). A razão pela qual o número de percursos em células A431 é menor do que nas outras duas linhas celulares pode ser que os níveis de P-Akt (T308) e P-Akt (S473) não podia ser avaliada em células A431.

descrição detalhada é apresentada na seção seção resultados e Procedimentos experimentais.

rede de sinalização migração no (a) células A431, (b) células EC109, e (c) as células T induzida por EGF. O limite foi fixado em ± 50% do controle positivo. A cor da borda é decidido com base no sinal de arestas; vermelho indica a sinalização positiva e azul indica sinalização negativa. O tamanho do nó indica o número de arestas de ligação. A cor do nó indica o número de vias de saída:. Uma escala de cores de gradiente de verde para vermelho, interpolados sobre o amarelo

Comparação das vias de sinalização em cada linha de células de câncer de

Based nestes mapas pathway, extraímos a estrutura comum das vias de sinalização para a migração celular em todas as três linhas celulares de cancro examinadas neste estudo. A Figura 5a representa a topologia comum entre as três linhas de células. Esta via comum inclui a via MEK /ERK /c-Fos e JNK /c-Jun via, que ambos têm sido amplamente pesquisada no campo da migração celular [6], [7], [12], [13]. Nós também descobrimos que os níveis de MEK regulada de c-fos e p21 de expressão, e que a PI3K suprimiu os níveis de expressão de c-fos em três linhas de células de cancro. Por outro lado, outros sinais regulados por EGFR, tais como a rocha e CysLT1 não têm quaisquer vias de saída, o que sugere que os sinais a jusante destas moléculas pode variar entre cada linha celular de cancro. Em seguida, avaliou-se as estruturas específicas das vias de sinalização relacionados com a migração de cada uma das linhas celulares de cancro (Figura 5b~d). A via específica em células A431 inclui apenas 11 vias, incluindo p-JNK → expressão de c-Jun e 5-lipoxigenase (5-LO) → c-Fos. O número de vias específicas em células EC109 e em células T são 24 e 13, respectivamente, o que indica que cerca de um quinto a um terço dos percursos em vias essas células são dependentes de células-tipo-.

(um ) comum EGF-induzida rede de sinalização entre as três linhas celulares de cancro. (B~d) rede de sinalização induzida por EGF específica em (b) células A431, (c) células EC109, e (d) células TT. A cor da borda é decidido com base no sinal de arestas; vermelho indica a sinalização positiva e azul indica sinalização negativa.

Em um estudo anterior, que previu que as vias semelhantes induzir e regular a migração celular em células A431 e células EC109, mas estes caminhos podem ser diferentes de TT células [10]. Para clarificar a diferença nas vias de sinalização entre os dois grupos, que, em seguida, em comparação as vias de sinalização de células EC109 e células T, que inclui todos os mesmos nós (Figura 6). A Figura 6a mostra a topologia do percurso sobreposto em ambas as linhas celulares. O mapa via PI3K inclui → P-Akt, JNK → P-Akt (S473) e ROCHA → p-p38, o que sugere que estas vias desempenham um papel na migração celular consistente. A Figura 6b, c apresenta as topologias via específica em células EC109 e células T, respectivamente. Um total de 29 vias (47% das vias em células EC109), tais como MEK → c-Jun, a GSK-3 → P-Akt (S473) e HMG-CoA → pAkt (T308), são específicos para células EC109, e 18 vias (35% das vias em células T), incluindo p-JNK → p-p38, e ROCHA → c-Fos, são específicos para as células T. A fosforilação de P-Akt é sobre-regulada por p38, a GSK-3, e inibidores de HMG-CoA em células EC109, ao passo que não houve via específica positiva para o P-Akt em células TT. Por outro lado, a JNK é necessário para aumento de tanto a expressão de c-fos e a fosforilação da p38 em células T, ao passo que tal regulação não foi observada em células EC109. Além disso, há um ciclo de feedback positivo EGFR-p38 em células T, mas não existe tal via em células EC109. Estes resultados indicam que a activação de Akt pode ser essencial para a migração de células de células EC109, mas via de activação de Akt depende de tipos de células de cancro. Além disso, via MAPK estresse-responsive pode ser dominante na via reguladora da migração celular de células TT.

(a) rede de sinalização comum entre as células EC109 e células TT. (B) rede de sinalização induzida por EGF específica em células EC109. (C) rede de sinalização induzida por EGF específica em células TT. A cor da borda é decidido com base no sinal de arestas; vermelho indica a sinalização positiva e azul indica sinalização negativa.

Discussão

Neste estudo, mapeamos as vias de sinalização de regulamentação para a migração celular em células A431 de carcinoma epidérmico, células EC109 carcinoma de esôfago e células de carcinoma da tiróide TT. Por comparação, que revelou as vias comuns nas três linhas celulares, tendo identificado as vias de sinalização celular específico do tipo-, com base em uma abordagem genética e biologia sistemas químicos. Para alcançar este objetivo, em primeiro lugar, comparou os padrões de ativação dependentes do tempo de moléculas de sinalização em cada linha de célula envolvida na migração celular induzida por EGF. Os padrões de activação de algumas moléculas de sinalização são parcialmente diferente entre as três linhas de células de cancro (Figura 1). Por exemplo, os padrões de activação de c-fos e p-p38 são bastante semelhantes entre as três linhas celulares tumorais testadas, ao passo que os padrões de p-ERK e P-c-Jun são diferentes. As intensidades relativas dos sustentada p-ERK e P-c-Jun em células T são mais elevados do que aqueles em células A431 e células EC109. Curiosamente, esta diferença é consistente com as classificações previamente relatados de os perfis de quimiossensibilidade estas três linhas celulares de [10], sugerindo que a fosforilação de ERK sustentada e c-Jun estão envolvidas nas vias específicas do tipo de célula para a migração celular em células TT. Considerando-se um mecanismo de feedback positivo pelo qual sustentada actividade de JNK pode promover ERK sinalização através do IRS-2 [14] foi relatado, estes mecanismos podem operar na migração de células TT. Em contraste, a fosforilação de Akt foi induzida por estimulação por EGF em células EC109 e células T, mas os níveis de fosforilação de Akt foram um pouco constante em células A431 no seguimento da estimulação EGF. Anteriormente, relataram que a migração induzida por EGF de células A431 é suprimida pela adição de inibidores de PI3K [10]. Portanto, embora o EGF não induziu significativamente a fosforilação de Akt, em estado estacionário fosforilada e activada Akt é necessária para a migração induzida por EGF de células A431. Outra diferença entre os dados do curso de tempo entre as três linhas de células de cancro é mostrado por o nível de expressão de EGFR. estimulação EGF diminuiu o nível de expressão de EGFR em células EC109 e células T, mas não em células A431. Quando o EGF se liga a EGFR, EGFR é conhecido por ser rapidamente internalizado a partir da superfície da célula por meio de várias vias, incluindo poços revestidos por clatrina [9], [15]. receptores internalizados são ou reciclado para a superfície celular ou transportado para os lisossomas para a degradação. É bem sabido que o destino dos receptores é controlado por várias proteínas sobre interiorização, tais como Cbl e LRRK1 [16], [17]. Assim, nossos resultados podem indicar que a regulação da degradação do receptor induzida por EGF é diferente entre as três linhas celulares de cancro, e esta diferença determina a ativação sustentada de alvos de sinalização a jusante.

caminhos regulatórios para a migração de células em cada câncer a linha celular foi determinada por análise do efeito de inibidores de migração de células sobre as moléculas de transdução de sinal (Figura 4). A topologia via sobreposta em todas as três linhas celulares testadas inclui JNK → P-c-Jun, que é prevista como um regulador comum num estudo anterior. Isto sugere que a sinalização do regulador para a migração de células de cancro por JNK através da fosforilação de c-Jun é realmente um mecanismo comum em todos os tipos de células cancerosas. Uma vez que não conseguimos detectar significante sobre-regulação de P-Akt em células A431 estimulada por EGF no presente estudo, o EGF mapa via de sinalização em células A431 não pode incluir a regulação da P-Akt e, assim, inclui menos nós e arestas do que no EC109 e células T no nosso método analítico. Portanto, uma interpretação da comparação entre os mapas via entre linhas de células cancerosas três devem ser feitas com cautela.

Para discutir e confirmar os resultados da análise de cluster em nosso relatório anterior [10], nós finalmente comparação do mapa via responsável para a migração celular entre as células EC109 e células T e determinou-se a topologia sobrepostas ou de tipo específico de célula (Figura 6). ondas de fosforilação de Akt em células EC109 são mais lentos do que em células de TT (Figura 1 e Tabela S1), sugerindo que as proteínas mais intermediários regular a fosforilação de Akt em células EC109 do que as células T. De facto, o nível de fosforilação de Akt estava sobre-regulada por p38, a GSK-3, e inibidores de HMG-CoA em células EC109, enquanto que estas vias não foram incluídos em células de TT (Figura 6b, c). Por outro lado, as ondas de fosforilação de ERK em células T são mais lentas e mais contínuo do que em células EC109 (Figura 1 e Tabela S1), sugerindo que as proteínas mais intermediários regular a fosforilação de ERK em células T do que as células EC109. Mas não conseguimos detectar qualquer regulamentação específica, o que pode sustentar o nível de fosforilação de ERK em células TT. Consideramos que uma outra molécula não avaliamos neste estudo podem contribuir para a fosforilação ERK sustentado. Estas diferenças na via de sinalização induzida por EGF pode reflectir diferenças no modo de migração de células com base na morfologia celular. Em nosso estudo anterior, verificou-se que as células EC109 movidos mantendo contatos célula-célula (migração coletiva), mas as células TT movido como células individuais (migração individual) [10]. À luz dos resultados acima, é provável que as células cancerosas se mover como uma única célula quando via da MAPK activada é continuamente, ao passo que, as células migram em conjunto e manter a adesão célula-célula quando a via PI3K /Akt é continuamente activada por p38 e GKS- 3. Estes papéis distintos das vias MAPK e PI3K para os modos de migração também são suportados pelos seguintes relatórios anteriores. activação de MAPK consequentemente induz a ativação RhoA e epitelial-mesenquimal-transição, enquanto a ativação PI3K suprime a atividade RhoA no câncer de cólon [9]. Além disso, a PI3K é recrutado para complexos de adesão [18] onde a sua activação através de impactos de sinalização caderina caderina função e reforça a adesão célula-célula [19], [20]. Isto poderia envolver a activação induzida por PI3K Rac1, porque E-caderina estimulada por reorganização do citoesqueleto de actina e requer activação Rac-PI3P activado GEF Tiam1 [21].

Tomados em conjunto, a análise via química com base em três genómico de células de cancro linhas de demonstrar a consistência e variedade na via de sinalização induzida por EGF reguladora para regular a migração de células de cancro entre os tipos de células que utilizam uma abordagem de combinação da biologia química e biologia de sistemas. Em particular, a GSK-3 e p38 regulam P-Akt em apenas células de carcinoma EC109 esofágicas, por outro lado, regula a via de JNK, p38 e Fos relacionada apenas em células de carcinoma da tiróide TT. Estes resultados indicam que algum migração celular regulação via de sinalização específicos do tipo de célula seriam alvos moleculares terapêuticos para o tipo de célula a metástase de cancros específicos: a GSK-3 e p38- vias relacionadas em carcinoma esofágico, e vias de stress responsivo-MAPK-relaterd no carcinoma da tiróide . No entanto, para compreender a coerência ea variedade de via de sinalização regulamentar mais precisamente, há várias questões que devemos lidar com no futuro. Embora utilizando um inibidor contra uma molécula de sinalização no presente estudo, vários inibidores contra uma molécula de sinalização deve ser usada para confirmar a especificidade dos inibidores. Além disso, o momento em que avaliam os efeitos de inibidores sobre a fosforilação ou a expressão destas moléculas de sinalização induzida por EGF deve ser verificada. Deve também ser concebido como distinguir via regulatória para a migração celular daquele para outras respostas celulares, tais como o crescimento celular. No entanto, no presente estudo, nós fornecemos uma nova abordagem para a compreensão das características de sinalização da migração de células de cancro, e abrir o potencial de revelar uma nova via molecular como um alvo para terapia de cancro.

Materiais e Métodos

Cultura celular

células A431 (obtido da ATCC CRL-1555) foram mantidas em DMEM suplementado com 5% de soro de vitelo (CS), 0,1 gl

-1 canamicina, 100 unidades ml

-1 penicilina G, 0,6 gl

-1 L-glutamina, e 2,5 gl

-1 NaHCO

3. EC109 (dotado de Dr. Doki, Universidade de Osaka, Japão), as células T (dotado de empresa KIRIN, Japão) foram mantidas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio de 1640 suplementado com 5% de FBS, 0,1 gl

-1 canamicina , 100 unidades ml

-1 penicilina G, 0,6 gl

-1 L-glutamina, e 2,5 gl

-1 NaHCO

3. Para cultura de rotina, as células foram incubadas numa incubadora humidificada padrão a 37 ° C em 5% de CO

2.

Reagentes

AG1478 (inibidor de EGFR), rapamicina (inibidor de mTOR), e Y27632 (inibidor ROCHA) foram adquiridos a partir de Calbiochem. MK571 (inibidor de CysLT1) foi adquirido a partir de Cayman. AA861 (inibidor de 5-lipoxigenase), actinomicina D (inibidor da transcrição), ciclo-heximida (inibidor de tradução), LY294002 (inibidor de PI3K), Mevastatina (HMG-CoA redutase), MG132 (proteassoma inibidor), SB203580 (inibidor de p38), SB415286 ( inibidor de GSK-3), SP600125 (inibidor de JNK), U0126 (inibidor da MEK), e Fator de Crescimento epidérmico (EGF) foram adquiridos da Sigma. Herbimicina A (inibidor da Hsp90) foi purificada a partir de culturas de

Streptomyces

sp. em nosso próprio laboratório.

Western Blot

Na sequência de pré-tratamento com qualquer veículo ou inibidores para 15 min, as células foram tratadas com EGF durante o tempo indicado. As células foram lisadas em tampão RIPA (25 mM de Hepes pH 7,8, 1,5% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 0,5 M de NaCl, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, vanadato de sódio 0,1 mM, PMSF 1 mM, e 0,1 mg ml

-1 de leupeptina) a 4 ° C com sonicação. Os lisados ​​foram centrifugados e os sobrenadantes foram recuperados. Após determinação da concentração da proteína em cada ligado, e ebulição num volume igual de tampão de carga (Tris 150 mM, pH 6,8, 30% de glicerol, 3% de SDS, 15 mg mL

-1 corante bromofenol, e 100 mM de 2 -mercaptoetanol), as amostras foram, em seguida, a electroforese num gel de poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF, e coradas imunologicamente. Os anticorpos utilizados para imunotransferência foram: anticorpo anti-receptor de EGF (# 2232), anticorpo anti-Akt (# 9272), anticorpo anti-fosfo-Akt (Thr308) (# 9275), anticorpo anti-fosfo-AKT (Ser473) (# 9271), o anti-anticorpo de c-Jun (# 9165), anticorpo anti-fosfo-p38 (# 9211), anti-MAPK (ERK 1/2) anticorpo (# 9102), anti-fosfo-MAPK (ERK 1/2 ) anticorpo (# 9101) (Cell Signaling); anti-c-Fos anticorpo (sc-7202), anticorpo anti-p38 (sc-7972), anticorpo anti-p21 (SC-397) (Santa Cruz Biotechnology); anticorpo anti-fosfo-tirosina (05-321) (Upstate); anti-fosfo-c-Jun anticorpo (558.036) (BD Pharmingen); -Anti-β actina anticorpo (A5316) (Sigma).

A análise estatística

One-way ANOVA foi utilizado para determinar diferenças significativas nos conjuntos de dados de séries temporais. Um coeficiente de correlação produto-momento de Pearson foi utilizado para confirmar a reprodutibilidade dos dados. Essas análises estatísticas foram calculadas usando a R (www.r-project.org/).

dedução de rede baseada na biologia química

A rede dirigida assinado foi deduzida a partir de uma diferença na fosforilação de proteínas ou níveis de expressão entre mock-tratada e inibidor tratados de dados, de acordo com a regra mostrado na Figura 3. Esta regra inclui três suposições simples que são comumente usados ​​em biologia química: a) que existe uma regulação positiva da molécula de X para Y molécula quando o nível de molécula de Y na presença de ambos EGF e de um inibidor de X é mais do que 50% inferior do que na condição tratadas com EGF; b) Existe uma regulação negativa da molécula para molécula X Y quando o nível de molécula de Y na presença de ambos EGF e inibidor de X é mais do que 50% maior do que em condições tratadas com EGF; c) Não existe uma regulação negativa da molécula para molécula X Y quando o nível de molécula de Y na presença de inibidor de X é maior do que a metade do nível na condição tratados com EGF. O processamento de dados, que finalmente produz informações via consistem em nó de origem, o nó de destino e tipo de regulamentação (positivo ou negativo) foi realizado usando R. Este arquivo é importado para o software Cytoscape (www.cytoscape.org/), e sinalização da via mapas foram gerados. A comparação da topologia da via também foi realizada utilizando Cytoscape avançado plug-in merge rede.

Informações de Apoio

Figura S1.

imagens immunoblot representativos apresentados na Figura 1. (A) células A431, (b) células EC109, e (c) as células TT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s001

(PDF)

Figura S2.

imagens immunoblot representativos apresentados na Figura 2. (A) células A431, (b) células EC109, e (c) as células TT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s002

(PDF)

Tabela S1. .

O cronograma de avaliação dos efeitos de inibidores

doi: 10.1371 /journal.pone.0096776.s003

(DOCX)

Tabela S2.

concentrações e metas de inibição composto utilizado neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s004

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