Sumário

Fundo

miR-26a desempenha um papel fundamental na tumorigénese, quer como um supressor de tumor, ou como um miARN oncogénica, dependendo de diferentes tipos de tumores. No entanto, a função de miR-26a em câncer pancreático não foi claramente elucidada. O presente estudo foi desenhado para determinar os papéis de miR-26a em câncer de pâncreas e sua associação com a sobrevida de pacientes com câncer pancreático.

Métodos

A expressão de miR-26a foi examinada em 15 pares de adenocarcinoma pancreático conduta (PDAC) e seus tecidos pancreáticos benignas adjacentes (ABPT), por qRT-PCR. Os resultados foram confirmados por

In situ

hibridação utilizando dois painéis de 106 e os seus PDACs microarray ABPT. Determinou-se a associação da expressão de miR-26a com a sobrevida global. A distribuição do ciclo de proliferação celular e de Capan-2, SW-1990 e células Panc-1, transfectadas com imita miR-26a ou um inibidor de miR-26a, foram avaliados utilizando o ensaio celular Counting Kit-8 e citometria de fluxo, respectivamente. A tumorigenicidade de células foi avaliado através de ensaios de xenoenxerto de murinos. A ciclina D2, E2, EZH2, PCNA e os níveis foram analisadas por transferência de Western e imuno-histoquímica.

Resultados

miR-26a foi expressa no citoplasma das células epiteliais do ducto pancreático, enquanto que a sua expressão foi significativamente regulada negativamente nos tecidos PDAC comparada com a de ABPT. Os pacientes com baixa expressão de miR-26a tiveram uma sobrevida significativamente menor do que aqueles com alta expressão de miR-26a. O

in vitro

e

In vivo

ensaios mostraram que a superexpressão de miR-26a resultou na interrupção do ciclo celular, proliferação celular inibida, e diminuiu o crescimento do tumor, que foi associado a ciclina E2 downregulation.

Conclusões

miR-26a é um supressor importante do carcinoma ductal pancreático, e pode vir a ser um novo fator prognóstico e alvo terapêutico para o tratamento do câncer de pâncreas

Citation:. Deng J, Ele M, Chen L, Chen C, Zheng J, Cai Z (2013), a perda de miR-26a-Mediated pós-transcricional regulamento da ciclina E2 no cancro do pâncreas de Proliferação celular e diminuição da sobrevida do paciente. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10.1371 /journal.pone.0076450

editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de novembro de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Projecto No. 81.172.077) e Xangai rede biobanco do fundo de tecido tumoral humano comum (Projeto No. 12DZ2295102). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas, particularmente do pâncreas duto adenocarcinoma (PDAC), é a quarta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Com um tempo de sobrevivência médio de menos de 6 meses e uma taxa de sobrevivência média de 5 anos de menos do que 5%, a taxa de mortalidade-incidência de pacientes com cancro do pâncreas é cerca de 99%, com muito mau prognóstico [1], [2] . Portanto, os mecanismos moleculares envolvidos no processo de transformação maligna do tumor, incluindo o papel de microRNAs (miARNs), deve ser entendido para o diagnóstico e gestão melhorada do cancro pancreático [3], [4].

miARNs são naturalmente ocorrendo, pequenas, ARN de cadeia simples não codificadoras que medeiam a expressão de genes aos níveis pós-transcrição e da tradução em plantas e animais [5], [6]. Estas moléculas desempenham papéis críticos em cancros humanos tais como o cancro pancreático [7], [8], bem como no comportamento do cancro, incluindo a sua proliferação, invasão, migração, apoptose, e resistência aos medicamentos. A rede funcional de miRNA de câncer está relacionado com vários aspectos da patogênese do tumor [9]. Esta rede pode ser utilizada para avaliar o diagnóstico e prognóstico de cancro, bem como para avaliar as possíveis opções terapêuticas.

miR-26a é um supressor tumoral provado que é significativamente regulada negativamente em carcinoma hepatocelular (HCC) [10]. A redução dos níveis de miR-26a têm sido associados com mau prognóstico; estes níveis são preditivos da resposta terapêutica de doentes com HCC ao interferão-α. Além disso, a sobre-expressão de miR-26a tem sido correlacionada com a regressão do tumor significativa, indicando que o miR-26a reintrodução em pacientes com cancro pode ser uma estratégia eficaz [11]. O nosso estudo anterior demonstrou que a sobre-expressão de miR-26a específico do tumor, accionado por um duplo promotor hAFP-terc, diminuiu a viabilidade de células tumorais no carcinoma hepatocelular através da regulação da expressão do receptor de estrogénio (ER) -α, receptor de progesterona (PR) , p53, ciclina D2, E2 e [12]. No entanto, a relação precisa entre miR-26a e câncer pancreático permanece desconhecida.

No presente estudo, foram examinados os níveis de expressão de miR-26a em tecidos PDAC humanos. Nós determinamos o significado clínico da regulação negativa miR-26a e seus papéis no crescimento celular e distribuição do ciclo celular. Além disso, foi utilizado um modelo murino para investigar o papel potencial de miR-26a na tumorigênese de pâncreas. Nossos resultados fornecem informações básicas para entender melhor a patogênese do câncer de pâncreas e as suas possíveis estratégias terapêuticas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado de acordo com o diretrizes de Helsínquia para os estudos sujeitos humanos e foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da segunda Universidade médica Militar, Shanghai, China. consentimento informado assinado foi obtido de todos os participantes do estudo para a recolha e análise de amostras. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Segunda Universidade Médica Militar.

Pacientes e Amostras de Tecido

Os dados sobre pacientes com PDAC foram recuperados ao longo de 3 anos período (Janeiro de 2008 a Dezembro de 2010), do Departamento de arquivos de Patologia do Hospital Changhai, segunda Universidade médica Militar, em Xangai, China e Shanghai Biobank Rede do tecido de tumor humano comum. Todos os pacientes foram tratados com a cirurgia, e no total, 106 pares de amostras a partir de e os seus PDACs ABPT foram incluídos. Além disso, um adicional de 15 pares de PDAC e suas amostras ABPT foram recolhidos a partir de doentes durante ressecções cirúrgicas e armazenado em azoto líquido. As características do paciente, quadro clínico, estadiamento, exames laboratoriais, tratamento, resposta objetiva, de sobrevivência, e outras informações relevantes foram obtidas a partir do sistema de informação hospitalar. Os pacientes foram avaliados através de métodos convencionais, incluindo sua história, exame físico e exames bioquímicos-hematológicas. O sistema de estadiamento TNM foi utilizado para determinar o estado da doença do paciente.

Análise morfológica e Construção da

Tissue Microarray

Todas as amostras foram obtidas por cirurgia, fixados em formalina e embebidos em parafina. Secções de espessura de 4 mm foram corados com hematoxilina e eosina antes de ser avaliado por três patologistas para as características morfológicas do câncer de pâncreas, de acordo com a classificação da Organização Mundial da Saúde do sistema digestivo [13]. Tissue microarrays (TMAs) foram construídos como descrito previamente [14]; cada microarray continha dois painéis de 106 PDACs e sua ABPT que foram dispostos em núcleos mm de diâmetro 2.0.

transcrição reversa reação e quantitativa PCR em Tempo Real (qRT-PCR)

No total , foram utilizados 15 pares de PDACs congelados e os seus espécimes ABPT (macro-dissecados) por qRT-PCR de acordo com o protocolo da Invitrogen. U6 foi utilizado como o controle endógeno para normalizar a quantidade de ARN total em cada amostra. qRT-PCR foi realizado em triplicado, com controlo sem modelo. A expressão relativa foi calculada com base no método Ct comparativa (2

-ΔΔ

Ct

) [12]. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1

ácido nucleico miRCURY LNA Detecção de microRNA

in situ

hibridação e Análise de Sobrevivência

Locked (LNA) -.

In situ

hibridação (ISH) foi realizada em PDAC TMA com o respectivo miRCURY LNA ™ sondas contra tem-miR-26a ou tem-miR-21 (como o controle positivo) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Estas sondas foram usadas de acordo com o protocolo do fabricante, como previamente descrito [15]. detecção colorimétrica foi realizado por incubação das amostras durante 30 minutos utilizando uma solução de substrato-cromogénio, com 0,04% de DAB (DAKO, Dinamarca) e 0,05% H

2O

2. As secções foram contrastadas com hematoxilina antes do exame usando um microscópio de luz (Leica, Alemanha) [16].

Os resultados LNA-ISH foram semiquantitativa avaliada. Com base na intensidade da hibridização, as amostras foram pontuadas como “0” para negativo; “1” para fracamente positivo; “2” para moderadamente positiva; e “3” para fortemente positivo. A percentagem de células epiteliais positivas foi marcado como “0” para ≤10%; “1” para 11% -25%; “2” para 25% -50%; e “3” para ≥50%. As pontuações de intensidade e percentuais foram somados para obter a pontuação ISH final, que foi classificado como “negativo” ( 3) ou (≥ 3) [17]

Os resultados “positivos” LNA-ISH para. miR-26a ou miR-21 e os dados de tratamento clínico de 106 pacientes foram analisados. A resposta ao tratamento com quimioterapia e radioterapia, incluindo manifestações clínicas do paciente, a tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (MRI) resultados e níveis de CA19-9, foram avaliados objetivamente. Assim, todos os pacientes incluídos no estudo foram avaliados quanto à sua resposta ao tratamento, o qual foi classificado como “resposta completa”, “resposta parcial”, “doença estável”, “doença progressiva”, “morte precoce da doença ou toxicidade”, e assim por diante.

ciclina D2, ciclina E2, e PCNA em Immunochemistry cancro do pâncreas Os tecidos

As secções foram pré-tratadas a 65 ° C durante 2 h, seguido por desparafinização graduada. A recuperação de antígenos foi realizada antes da incubação com os anticorpos primários de ciclina D2 (1:300 diluição; Millipore), ciclina E2 (1:300 diluição; Millipore), e o antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) (1:300 diluição; Dako) , durante a noite a 4 ° C, com IgG normal, como um controlo negativo. Em seguida, as lâminas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário conjugado com HRP (Dako); 1:100. a actividade da HRP foi detectada utilizando um sistema de substrato DAB +-cromogénio líquido (DAKO). Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina e fotografada. Os resultados imuno-histoquímica foram avaliados através de um método semi-quantitativo, com as pontuações finais com base na intensidade e porcentagem de células epiteliais positivas determinadas pela sua imunoquímica; essas pontuações foram classificados como “negativo” ( 3) ou “positivo” (≥3) [17]. Os níveis de PCNA foram pontuados de acordo com a percentagem de células epiteliais positivas como “0” para ≤5%; “1” para 5% -25%; “2” para 25% -50%; “3” para ≥50%. As amostras foram classificados em grupos com um “baixo índice proliferativo” ( 2) ou “elevado índice proliferativo” (≥2) [13], [17]. A imunofenotipagem foram analisados ​​detalhadamente com os dados de acompanhamento.

Cultura de Células

As linhas celulares PDAC Capan-2, SW-1990, e Panc-1, para o bem (grau 1) , moderadamente (Grau 2), e mal (Grau 3) cancro do pâncreas diferenciadas, respectivamente, foram obtidas a partir do centro para chinês Type Culture Collection (Wuhan, China). As células foram cultivadas em meio essencial mínimo de Dulbecco (suplementado com soro de bovino fetal a 10%) e mantidos numa co 5%

2 atmosfera a 37 ° C em uma incubadora.

Plasmídeos e transfecção de células

As linhas celulares PDAC Capan-2, SW-1990, e Panc-1 foram semeadas a 3 x 10

5 células por poço em placas de 12 poços, e foram transfectadas, com imita o miR-26a, inibidores, ou ciclina E2 siRNA (Dharmacon) a uma concentração final de 100 nm, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante.

miR-26a superexpressão vector p-hTERT-miR-26a (pTM) e o seu vector de controlo p-hTERT (pT) foram construídos como descrito previamente [12]. Para gerar linhas celulares estáveis, 4 × 10

5 células em cada poço de uma placa de 6 poços foram transfectadas com 2 ug de plasmídeos (PTM ou PT) usando Lipofectamine 2000, de acordo com as instruções do fabricante. As culturas positivas foram seleccionadas com 800? g /ml de G418 durante 2 semanas.

Análise Western Blot

As células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, lisadas, e suspendeu-se num tampão de lise (Promega). O extracto de proteína total resultante foi separado por 12% de gel SDS-PAGE. A imunotransferência foi realizada em membranas de fluoreto de polivinilideno. Os anticorpos primários e secundários utilizados foram um anticorpo de coelho anti-humano e uma IgG anti-coelho de cabra, respectivamente (Sigma). A imunodetecção foi realizada utilizando um substrato quimioluminescente baseada-HRP [18]. Tabela S2 lista os anticorpos utilizados neste estudo.

proliferação celular e ciclo celular Ensaios

O potencial proliferativo das células foi analisado de acordo com o protocolo do celular Counting Kit-8 (CCK-8 ) ensaio (Dojindo, Japão). As células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes com PBS, recolhidas por centrifugação, fixadas em etanol frio a 70%, incubadas com iodeto de propidio, e analisados ​​por células activadas por fluorescência (Miltenyi, Alemanha).

Em vivo

Tumorigênese Ensaio

células SW-1990 de PDAC moderadamente diferenciado foram estavelmente transfectadas com pTM (p-hTERT-miR-26a) ou pT (vector de controlo). As células transfectadas foram colhidas, suspensas em 200 ul de PBS (1 × 10

7 células), e foram injectados por via subcutânea no macho de 4 semanas de idade, ratinhos BALB /c nu (

N

= 8). Para evitar as diferenças entre ratinhos individuais preexistentes, ambas as linhas de células estáveis ​​(PTM ou Pt) foram individualmente injectados nos flancos opostos do mesmo rato; As células transfectadas com pTM foram injectados no flanco esquerdo, ao passo que os controlos (transfectadas com o vector pT) foram injectadas no flanco direito. Os ratinhos foram mantidos num ambiente específico isento de patógeno durante 5 semanas e então sacrificados. O volume do tumor

V

foi calculada utilizando o seu comprimento

L

e largura

W

, de acordo com a equação

V

= 0,4

LW

2. Os tumores de xenoenxerto de ratinho foram fixas em formalina e embebidas em parafina para a análise imunoquímica de ciclina D2, E2, e PCNA.

Análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão ( SD). As associações de expressão de miR-26a com as características patológicas clínicas foram analisadas utilizando os testes qui-quadrado ou Mann-Whitney. A curva de sobrevida foi construído utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Os grupos foram comparados usando um Student

t

-teste. análise de correlação foi realizada utilizando análise de correlação de Pearson. Todos os valores de probabilidade foram analisados ​​usando um teste bilateral e considerado significativo quando

P Art 0,05. As análises foram realizadas usando SPSS (versão 17.0) (SPSS Inc., Chicago, EUA).

Resultados

regulação negativa do miR-26a no cancro do pâncreas tecidos é associada à sobrevida

as características clínico-patológicos de 106 casos de PDAC são apresentados na Tabela 1. a maioria destes pacientes estavam em estágio II (70,8%), indicando que os resultados são importantes para os pacientes que ainda estão cirurgicamente ressecável com a melhor oportunidade para uma sobrevida de 5 anos. qRT-PCR A análise demonstrou que a expressão de miR-26a foi significativamente menor em tecidos PDAC do que em tecidos normais (

n =

15,

P

0,05; Fig. 1A), o qual foi adicionalmente confirmado pela análise LNA-ISH de 106 casos de PDAC. LNA-ISH mostrou que o miR-26a estava presente no citoplasma das células epiteliais do ducto pancreático (Figs. 1C e 1D). De acordo com a intensidade e percentuais pontuação dos critérios de pontuação ISH [17], 44 dos 106 (41,5%) tecidos de câncer de pâncreas e 84 dos 106 (79%) dos tecidos normais adjacentes (ISH ≥3;

P

0,001) foram positivos para o miR-26a. expressão de miR-21 como controlo positivo foi analisada nos mesmos pacientes. miR-21 foi positiva em 99 dos 106 (93,4%) tecidos PDAC e em 25 dos 106 (23,6%) dos tecidos normais adjacentes, com base nos critérios de pontuação ISH (figuras 1E e 1F;. ISH ≥3;

P

0,01). A relação de características clínicas com expressão de miR-26a em tecidos PDAC, tal como determinado por LNA-ISH, é apresentada na Tabela 2.

(A) Nível de expressão médio de miR-26a em espécimes humanos PDAC (

n

= 15) e normais tecidos pancreáticos (

n

= 15). miARN abundância foi avaliada por qRT-PCR e normalizadas para ARN U6. Os valores são apresentados como a média ± S.D. (B) A sobrevida global após ressecção de câncer de pâncreas com o miR-26a-negativo contra grupos de miR-26a-positivos. O grupo de miR-26a negativo apresentaram sobrevida significativamente menor do que o grupo-miR-26a positivo (

P

= 0,029). (C, D)

In situ

hibridação de miR-26a em lesões pancreáticas.

In situ

hibridação mostrou muito menor expressão de miR-26a em tecidos PDAC (C) do que em ABPT (D). A inserção mostra o controlo negativo (sonda sequência mexidos). coloração citoplásmica nas células epiteliais do dueto está em contraste com a coloração negativa com a sonda mexidos. (E, F)

In situ

hibridação para miR-21 (controlo positivo) em lesões pancreáticas.

In situ

hibridação mostrou muito mais forte expressão de miR-21 em tecidos PDAC (E) do que no ABPT (F). A inserção mostra o controlo negativo (sonda sequência mexidos). coloração citoplasmática em células tumorais está em contraste com a coloração negativa da sonda mexidos. ampliação original, 100 ×.

Os dados de acompanhamento obtidos de 73 dos 106 pacientes demonstraram que um total de 18 pacientes foram tratados com quimioterapia adjuvante de gemcitabina e oxaliplatina, enquanto os restantes 55 doentes que não foram tratados com quimioterapia ou radioterapia. Entre os 73 pacientes que receberam follow-up, 68 morreram, com 16 pacientes submetidos a quimioterapia e 52 sem terapia adicional. No entanto, 5 dos 73 pacientes de acompanhamento sobreviveu. A sobrevida global medida era específica ao câncer; o tempo médio de sobrevivência foi de 8,7 meses no grupo de miR-26a negativo ( 3;

n

= 43) e 12 meses no grupo de miR-26a positivo (≥3;

n

= 30). As taxas de sobrevivência 1- e 3-ano eram de 39,5% e 0%, respectivamente, no grupo de miR-26a negativo, mas eram de 50% e 6,3%, respectivamente, no grupo de miR-26a positivo. A análise de sobrevida global revelou que o grupo de miR-26a negativo apresentaram sobrevida significativamente menor do que o grupo positivo (

P

= 0,029, Fig. 1B). A quimioterapia adjuvante não foi associado com a sobrevida dos pacientes com PDAC (

P =

0,417). A associação entre a expressão de miR-26a e outros parâmetros (tais como idade, sexo, localização massa tumoral, tamanho do tumor, a diferenciação das células tumorais, invasão neural, número de linfonodos, metástases à distância) não foram estatisticamente significativas (Tabela 2). A análise de sobrevida multivariada (modelo de regressão Cox) de fatores prognósticos clínicos convencionais e miR-26a afirmou que miR-26a é um fator independente de prognóstico no câncer de pâncreas (

P =

0,001; 95% CI, 0,185-0,650; tabela 3).

ciclina D2, ciclina E2, e PCNA Imunoquímica no cancro do pâncreas tecidos e sua associação com a sobrevivência

as amostras de tecido imunocoradas revelou que tanto as células tumorais e epitelial duto as células dos tecidos pancreáticos benignas adjacentes não expressam ciclina D2 (fig. 2A e 2D). No entanto, a ciclina E2 apresentado forte coloração positiva nas células tumorais (90/106) e células epiteliais do ducto de os tecidos pancreáticos benignas adjacentes (76/106;

P

= 0,024;. Figuras 2B e 2E). Não houve diferença significativa na sobrevida global entre os 73 pacientes de acompanhamento que foram positivos (

n =

61) ou negativo (

n =

12) para ciclina E2 (

P

= 0,676; A Fig. 2G). Os resultados apresentaram coloração positiva para a PCNA células tumorais (93/106) e para as células epiteliais do ducto de os tecidos pancreáticos benignas adjacentes (68/106;

P

0,01). A forte coloração positiva de PCNA em tecidos PDAC indicou uma actividade proliferativa de células mais elevada no cancro pancreático (Fig. 2C e 2F), em comparação com a coloração negativa em tecidos normais adjacentes. A análise de sobrevida global revelou que os casos com um índice de PCNA alta proliferativa (

n

= 51) em tecidos PDAC tiveram sobrevivência significativamente menor do que os casos com um índice proliferativo baixo PCNA (

n

= 22;

P

= 0,007, Fig 2H).. Os pacientes com um índice proliferativo alta PCNA também eram ciclina E2 positivo.

Os tecidos tumorais PDAC (PDAC) foram negativas para ciclina D2 (A) e fortemente positivos para ciclina E2 (B), com um índice proliferativo alta PCNA (C). Os tecidos pancreáticos benignas adjacentes (ABPT) foram negativos para ciclina D2 foi (D), e positivo para E2 de ciclina, tal como observado nas células epiteliais do dueto de ABPT (E). PCNA foi muito baixo em tecidos normais do pâncreas (F). As inserções de A, B, e C mostram os controlos negativos. A inserção em D indica que a ciclina D2 é um controlo positivo de adenocarcinoma de pulmão. ampliação original, de 200 ×. A sobrevida global após a ressecção de câncer de pâncreas com o cyclinE2 positivo contra grupos cyclinE2-negativos não foi significativa (

P

= 0,676) (G), enquanto que a sobrevida global após a ressecção de câncer de pâncreas com o alto índice proliferativo PCNA contra PCNA grupos de baixo índice de proliferação tiveram uma sobrevida significativamente menor (

P

= 0,007) (H).

a análise de correlação tanto para miR-26a e expressão E2 ciclina (coeficiente de Pearson,

R

2

= 0,004) e para miR-26a e expressão PCNA (

R

2

= 0,024), mostrou uma relação significativa. Os gráficos de dispersão da análise de correlação são apresentados na Figura S1.

miR-26a superexpressão inibiu o crescimento de células do cancro do pâncreas pela regulação negativa do ciclina E2 e EZH2 Expressão

Para explorar o efeito da miR-26a sobre o crescimento de células de cancro pancreático, as linhas de células com diferentes graus PDAC Capan-2, SW-1990, e Panc-1 foram transientemente transfectadas com um mímico de miR-26a ou inibidor. A análise de qRT-PCR mostrou que a transcrição de miR-26a no grupo imitador foi significativamente aumentada (4,44 vezes em Capan-2, 3,45-vezes em SW-1990, e 3,59 vezes em Panc-1), enquanto que a transcrição de miR-26a no grupo inibidor foi diminuiu significativamente (0,35 vezes em Capan-2, 0,43-vezes em SW-1990, e 0,44 vezes em Panc-1), em comparação com as linhas celulares de controlo (

P

0,05;. as fig. 3A-3C)

a análise de qRT-PCR demonstrou a transcrição de miR-26a em imita, inibidor, e os grupos de controlo (a, B, C), e o expressão de ciclina em E2 E2 ciclina siRNA, ARNsi de controlo, e os grupos de controlo (D, e, F). A proliferação de linhas de células transfectadas de forma transiente com PDAC imita o miR-26a, inibidor miR26a ou ciclina E2 siARN foi analisada pelo ensaio de proliferação de CCK-8 (G, H, I). A regulação da ciclina E2 ou EZH2 expressão de miR-26a foi analisada por Western blot (J, K, G), e análise Western blot confirmou também a eficiência esperada de ciclina E2 siARN em três linhas de células PDAC (m, n, o) .

Para explorar o efeito da ciclina E2 no crescimento das células do cancro do pâncreas, ciclina E2 siARN foi transfectada em cada uma das três linhas de células PDAC, e o knockdown foi confirmada por análise de qRT-PCR, que mostrou que a expressão de ciclina E2 no grupo transfectadas com siARN foi significativamente diminuída em comparação com as células de controlo (0,201 vezes na Capan-2, 0.274 vezes em SW-1990, e 0,327 vezes em Panc-1) (Figs. 3D -3F).

Para determinar o papel de miR-26a no crescimento de células do cancro do pâncreas, o ensaio de proliferação de CCK-8 foi realizado em Capan-2, SW-1990, e as células Panc-1 que foram transfectadas transitoriamente com um mímico miR-26a ou inibidor. Os resultados mostraram que o miR-26a-imita inibiu o crescimento de células tumorais, ao passo que o inibidor miR26a-promovido o crescimento de células tumorais. Além disso, a ciclina siARN E2 teve um papel semelhante ao da miR-26a-mímico na inibição da proliferação de células de tumor (Fig. 3G-3I).

miR-26a foi relatado para mediar directamente a ciclina E2 e ciclina funções D2 em HCC [12] e do cancro da mama [19]. A expressão da proteína Polycomb EZH2 foi aumentada em PDAC, o que, por conseguinte, aumento da proliferação celular e quimiorresistência [20]. No entanto, nossos estudos mostraram que a ciclina D2 coloração era quase negativa em tecidos de cancro do pâncreas. Assim, a relação entre o miR-26a e ciclina E2 ou EZH2 foram analisados ​​utilizando Western blots. Os resultados revelaram que os níveis de E2 e ciclina EZH2 foram ambos diminuiu nas células transfectadas-mímica miR-26a, mas estavam aumentados nas células transfectadas com inibidores de miR-26a (Figs. 3 J-3L), em comparação com as células de controlo. A análise Western blot confirmou a eficiência esperada de ciclina E2 ARNsi nas três linhas celulares PDAC (Figs. 3M-3O).

Subsequentemente, analisou-se a distribuição do ciclo celular da Capan-2, SW-1990, e células Panc-1 que foram transfectadas com imita o miR-26a ou o inibidor de miR-26a, assim como os controlos. As células transfectadas com o imitador de miR-26a acumulado no L

1 fase, enquanto que a população fase S diminuiu. No entanto, um resultado contrário foi observado em células transfectadas com o inibidor de miR-26a (Fig. 4). Estes resultados sugerem que a inibição de proliferação de miR-26a foi parcialmente devido a uma L

prisão 1-fase das três linhas de células do cancro do pâncreas.

As células foram transfectadas quer com imita o miR-26a ou inibidores. Os controlos foram deixados sem tratamento. D, H, e L indicam a distribuição do ciclo celular estatística para Capan-2, SW-1990 e Panc-1, respectivamente.

A expressão ectópica de miR-26a inibiu o crescimento do cancro do pâncreas em ratos Nude

o

in vivo

ensaio tumorigênese revelou que o crescimento do tumor foi significativamente mais lento em ratinhos nus inoculados com as células SW-1990 pTM-transfectadas, em comparação com camundongos nus inoculados com a SW pT-transf -1990 células (Fig. 5A). Este resultado foi confirmado pelas medições do volume do tumor com 5 semanas (Fig. 5B). O nível E2 ciclina foi muito menor em tecidos tumorais que superexpressam miR-26a ea expressão PCNA seguiu um padrão semelhante. Ciclina D2 não foi detectado nos tumores (Fig 5C-5H.)

camundongos nus (A) foram inoculados subcutaneamente com células SW-1990 transfectadas com pTM (PTM: plasmídeo hTERT-miR-26a). Ou pT ( pT: plasmídeo controle de hTERT), em seus flancos. A imagem é representativo dos tumores formados em 8 murganhos. curvas (B) crescimento dos volumes tumorais. O gráfico é representativo do crescimento do tumor, 5 semanas após a inoculação. O volume do tumor foi calculada e todos os dados são apresentados como a média ± S.D. (

n

= 8). (C-H) A expressão de ciclina D2, ciclina E2, e PCNA foi medida por imuno-histoquímica em tecidos de murganhos inoculados com células transfectadas pTM- SW-1990 ou as células de controlo. A figura inserções em C, E, e G indicam um campo de controlo negativo. Células de cor marrom indicam coloração positiva. ampliação original, de 200 ×.

Discussão

A sequência madura de miR-26a é observada em 3

p

23, que é uma região cromossômica frágil associado com vários cancros humanos [21] – [23]. Aproximadamente metade de todos os miARNs humanos estão localizados em regiões genómicas associadas a cancro; Assim, eles podem funcionar como supressores de tumores oncogénicos ou miARNs, dependendo dos seus objectivos [3] – [5]. Assim, o miR-26a pode funcionar como um oncogene em gliomas, mas serve como um supressor tumoral no cancro do fígado [12], [23] – [26]. No entanto, até à data, há relatos limitados sobre o papel ea tumorigênese de miR-26a em câncer pancreático.

No presente estudo, verificou-se que a expressão de miR-26a foi significativamente regulada negativamente em tecidos PDAC comparação com que de ABPT. Para explorar melhor os mecanismos moleculares da promoção do crescimento de células por regulação negativa miR-26a no tecido do cancro do pâncreas, analisou-se o papel de sobre-expressão de miR-26a ou downexpression na proliferação de células do cancro do pâncreas, do ciclo celular, e o crescimento tumoral ,. Os nossos dados demonstraram que o nível de miR-26a expressão influencia a proliferação das três linhas de células de diferentes PDAC-grades. níveis de miR-26a foram associados com G

1 prisão em células de câncer de pâncreas. Além disso, o miR-26a sobreexpressão em células SW-1990 suprimida tumorigénese pancreático em ratinhos nus, o que sugeriu que as funções de miR-26a como um supressor de tumores neste tipo de cancro.

ciclina D2 e ​​E2 ciclina são reguladores essenciais da transição de fase L

1-a-S durante o ciclo celular. Estes ciclinas são de particular interesse em câncer de pâncreas. Kota [11] e Zhou [27] relataram que o miR-26a directamente regula positivamente a expressão de ciclina D2 e ​​E2 ARNm da ciclina em HCC. Assim, ambos os genes são possíveis alvos de miR-26a em câncer pancreático. Por outro lado, os níveis foram aumentados em EZH2 PDAC para promover a proliferação celular e quimiorresistência [20]. Portanto, verificou-se se miR-26a poderia regular o ciclo celular do cancro do pâncreas através de seus genes-alvo, ciclina D2 e ​​ciclina E2. A ciclina D2 não foi detectado em células tumorais e células epiteliais do ducto de ABPT, enquanto que a ciclina E2 foi positivamente correlacionada com a expressão de miR-26a no cancro pancreático. Ciclina E2 diminuiu com a regulação positiva miR-26a em Capan-2, SW-1990 e células Panc-1. Os efeitos observados sobre a proliferação celular e E2 ciclina expressão foram consistentes com os observados para EZH2 em células PDAC. Estes dados sugerem que o miR-26a regulação negativa levou à sobre-regulação da ciclina E2 e EZH2, mas não da ciclina D2, em tecidos PDAC. Assim, o miR-26a subregulado contribuiu para a proliferação e sobrevivência celular pobres de câncer pancreático. Estes resultados são consistentes com estudos sobre outros tumores, tais como carcinoma hepatocelular, cancro da mama, o NPC, e linfomas [12], [27] – [30]. A expressão alterada de miARNs específicos em tumores está supostamente associada com a metástase do câncer e prognóstico pobre [29] – [32]. Heinzelmann et al., [33] detectada uma assinatura miARN que distingue entre metastáticos e carcinomas de células renais claras não-metastáticos. Um grupo de 12 miARNs, incluindo a família let-7, miR-30c, e miR-26a, foram encontradas para diminuir em tumores metastáticos primários altamente agressivos.