Abstract

Fundo

Recentemente, tem havido um interesse renovado na ligação entre o colesterol e câncer de próstata. Foi anteriormente relatado que

in vitro

, células de cancro da próstata não têm regulação mediada por realimentação de esterol do factor de transcrição importante na homeostase do colesterol, a ligação elemento regulador de esterol-proteína 2 (SREBP-2). Isto poderia explicar o acúmulo de colesterol observada em cancros da próstata clínicos. Consequentemente, regulação por feedback perturbado ao aumento dos níveis de esteróis tornou-se um conceito difundido no contexto do câncer de próstata. Aqui, buscamos explorar esta em maior profundidade.

Metodologia /Principais Achados

Depois de alterar o status de colesterol celular em LNCaP e as células PC-3 de cancro da próstata, examinamos processamento de SREBP-2, efeitos a jusante sobre a actividade do promotor e a expressão de genes alvo SREBP-2, e actividade funcional (absorção de lipoproteínas de baixa densidade, a síntese de colesterol). Ao fazê-lo, observamos que células LNCaP e PC-3 foram sensíveis ao aumento dos níveis de esteróis. Em contraste, a redução dos níveis de colesterol por meio do tratamento com estatina gerada uma resposta maior em células LNCaP de células PC-3. Este destaque uma diferença importante entre essas linhagens de células: basal de atividade SREBP-2 pareceu ser maior em células PC-3, reduzir a sensibilidade à diminuição dos níveis de colesterol

Conclusão /Significado

Assim,. células de câncer de próstata são sensíveis à alteração dos níveis de esteróis

in vitro

, mas a extensão deste regulamento difere entre linhagens de células de câncer de próstata. Estes resultados lançam uma nova luz sobre a regulação do metabolismo do colesterol em duas linhagens de células de câncer de próstata comumente usados, e enfatizar a importância de estabelecer ou não homeostase do colesterol é perturbado no cancro da próstata

in vivo

.

Citation: Krycer JR, Kristiana I, Brown AJ (2009) homeostase do colesterol em duas linhas de células cancerosas humanas da próstata comumente usados, LNCaP e PC-3. PLoS ONE 4 (12): e8496. doi: 10.1371 /journal.pone.0008496

editor: Immo A. Hansen, New Mexico State University, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Outubro, 2009; Aceito: 03 de dezembro de 2009; Publicado: 30 Dezembro 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Krycer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa de AJB é apoiado por uma bolsa da Fundação Câncer de próstata da Austrália (Pr36, https://www.prostate.org.au). JRK é o beneficiário da bolsa Petre Foundation (https://www.petrefoundation.org.au). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O estudo da homeostase do colesterol em um câncer de próstata definição (PCA) começou em 1942, quando Swyer publicada

in situ resultados

de níveis elevados de colesterol em hiperplasia prostática benigna em comparação com o tecido normal [1] . Mais recentemente, tem havido um interesse renovado nas ligações entre o colesterol e PCA [2] – [4]. Por exemplo, foi proposto que a compreensão em profundidade da regulação do colesterol na progressão APC, pode levar ao desenvolvimento de metas de novas drogas [5]. Em consonância com isso, vários estudos epidemiológicos têm relatado uma associação entre o uso de estatinas (medicamentos para baixar o colesterol) e redução do risco de CaP avançado (revisto em [2] – [4]).

O colesterol tem um influência importante sobre a integridade da membrana, a sinalização, e metabolismo, e, assim, existe uma necessidade de regular os níveis no interior da célula [2]. Um dos principais mecanismos homeostático ocorre ao nível da transcrição, através do factor de transcrição mestre: esterol-regulação elemento de ligação de proteína 2 (SREBP-2). A regulação deste fator de transcrição foi revista por Brown e Goldstein [6]. Resumidamente, SREBP-2 é sintetizada como um precursor, ligado ao retículo endoplasmático (ER). Quando os níveis de colesterol são baixos, SREBP-2 é transportada do RE para o aparelho de Golgi, onde é processada para libertar o domínio N-terminal. Esta forma madura de SREBP-2 migra para o núcleo, onde regula positivamente genes cholesterogenic, tais como aquelas que codificam o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) e coenzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-A redutase (HMGCR). Isto promove a absorção e síntese de colesterol até que os níveis de colesterol são suficientes, após o que SREBP-2 é retida no ER, impedindo a sua activação e, assim, regular negativamente a expressão do gene alvo. Este mecanismo de feedback dependente de esteróis também regula os SREBP-1a /c isoformas. Em geral, SREBP-1c regula positivamente, preferencialmente, os genes relacionados gordos de ácido, SREBP-2 alvos genes relacionados com o colesterol, e de SREBP-1a pode activar tanto [7], [8].

Tem sido sugerido que que esta regulação por feedback de SREBP-2 é desprovido de CaP, através da observação de que o tratamento com esteróis reduzida expressão do gene SREBP 2-alvo, bem como a lipoproteína de absorção de baixa densidade (LDL), nas células normais, mas não em PC-3 e células DU145 CaP

in vitro

[9]. Perturbações no gabarito mediada por esteróis explicaria o acúmulo de colesterol em ACP espécimes [10], [11], e tornou-se um conceito amplamente aceito no ambiente PCA (revisto em [3], [4]). Esta desregulação implica que as células APC, e talvez as células cancerosas em geral (por exemplo, [9], [12] – [15]), são um caso especial em que eles não estão em conformidade com o paradigma atualmente realizada da homeostase do colesterol celular [16]. Uma acumulação de colesterol dentro da célula se, por exemplo, endurecer a membrana mitocondrial, reduzindo a fosforilação oxidativa – este promove a glicólise, mesmo na presença de oxigénio (o efeito Warburg [17]), um fenótipo metabólica vulgarmente observada em células cancerosas e de grande interesse na investigação sobre o cancro [18].

O objetivo da nossa investigação foi explorar regulação do colesterol em maior profundidade em duas linhagens de células comumente usados ​​APC, PC-3 e LNCaP, usando uma variedade de condições e abordagens. Buscou-se confirmam os achados de atividade SREBP-2 sendo afetado por esteróis [9], e determinar se esta desregulação afeta a resposta das células APC aos níveis de esteróis reduzidos. A partir de nossos resultados, nós fornecemos uma nova perspectiva sobre a homeostase do colesterol nessas linhagens de células APC, com implicações para ambos os experimentos de laboratório e terapia CaP.

Resultados

regulação mediada por Sterol de SREBP-2 genes-alvo existe em células de câncer de próstata

Para examinar regulação esteróis de SREBP-2, em primeira instância, foi analisada a expressão de mRNA de dois genes-alvo SREBP-2 (

LDLR

,

HMGCR

) mediante manipulação do estado do colesterol das células LNCaP e PC-3. As experiências foram conduzidas em condições de lipoproteínas-deficiente (com soro de vitelo fetal a lipoproteína de deficiente [FCLPDS]) para potenciar os efeitos do tratamento de células com 25-hidroxicolesterol (25-HC), um derivado de colesterol oxigenado (oxisterol), e LDL. LDL proporciona colesterol através da LDLR, apresentando uma alternativa fisiológica para aumentar os níveis intracelulares de esterol.

Se a regulação de SREBP-2 está presente, a adição de esteróis, quer através de um tratamento de 25-HC ou LDL, reduziria SREBP- 2 de processamento e de SREBP-2 de expressão do gene alvo. Por outro lado, a compactina estatina (também conhecido como mevastatina) inibe HMGCR, que catalisa um passo limitante da velocidade na síntese do colesterol, e, portanto, deve aumentar a actividade de SREBP-2. Os não-cancerosas linhagens de células, as células da próstata epiteliais (Prec) e fibroblastos (FB), serviu como controle, demonstrando ambas as formas de regulação por feedback (Fig. 1A). regulação mediada por esterol similar foi também observado nas linhas celulares de CaP (Fig. 1a), contrários aos achados anteriores [9].

As células foram tratadas com a compactina estatina (PCN, 5 uM), 25 oxisterol HC (1 ug /ml), ou LDL (50 ug /ml) durante 24 h. RNA celular foi colhido e a expressão do mRNA do

LDLR

e

HMGCR genes

foi analisada por qRT-PCR. Os níveis de ARNm foram feitas em relação ao estado do veículo tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são a média + SEM, a partir de 3 experiências em separado para cada linha celular. Cada experiência foi realizada com poços em triplicado por condição. (A) Os dados apresentados separadamente para cada linha celular. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, de duas amostras

t

-test contra o estado do veículo. (B) Os dados de (A) foi sobreposto para cada gene, representados como a média ± SEM para cada ponto de dados. As linhas celulares de CaP são representados por linhas a cheio, enquanto que os não-PCA linhagens de células são representadas por linhas tracejadas.

Em células PC-3, aumentando estado esterol celular com 25-HC ou LDL reduziu significativamente a expressão do gene lipogénica, em comparação com a condição do veículo (fig. 1A). A similaridade entre as células tratadas com veículo e compactina-PC-3 é improvável devido à resistência a compactina, uma vez que descobrimos que a compactina inibe a síntese do colesterol em células PC-3 por marcação metabólica (dados não mostrados). Em contraste, compactina aumentou significativamente a expressão do gene em células lipogénica LNCaP e células LNCaP tratadas com esterol teve padrões de expressão semelhantes para as células tratadas com veículo (Fig. 1a). Sobrepondo os dados de expressão de ARNm relativos de cada linha de células (Fig. 1B) mostrou que as células de CaP (linhas a cheio) teve uma resposta reduzida a compactina em comparação com células PrEC, e foram menos afectadas por LDL de ambas as linhas celulares não-PCA . No entanto, estas linhas de células de PCA foi sensível tanto a mudanças no estado de colesterol.

regulação mediada por esterol é específico para SREBP-2

Dado que a expressão dos dois genes de SREBP-2-alvo (

LDLR

,

HMGCR

) responderam de forma semelhante à mudança de status de colesterol (Fig. 1), buscou evidência mais direta que esse efeito foi mediado pelo factor de SREBP-2 transcrição.

Desde maduros SREBP-2 liga-se ao elemento de esterol-regulação (SRE) dentro da região do promotor de um gene alvo, desenvolvemos um ensaio de luciferase específicas do SRE, utilizando o plasmídeo LDLP-588luc [19], que codifica a luciferase de pirilampo sob o transcricional regulação do LDLR

promotor. Utilizando mutagénese dirigida ao local, é interrompido o SRE dentro da região do promotor para gerar um plasmídeo de controlo negativo, LDLP-mutSRE. Verificou-se que o promotor de tipo selvagem (LDLP-588luc) exibiram as mudanças previstas na actividade da luciferase (aumentando com o tratamento compactina, diminui com o tratamento de LDL 25-HC ou), enquanto que o promotor mutante (LDLP-mutSRE) produziu alterações insignificantes (Fig . S1). A actividade do promotor de luciferase mutante foi subtraída a do promotor de tipo selvagem para cada condição de tratamento para se obter a actividade específica do SRE. Este ensaio revelou que a luciferase regulação por feedback ocorreu em células de CaP em resposta a níveis de colesterol alterados (FIG. 2A).

(A) células foram transfectadas tal como descrito em Materiais e Métodos. O tratamento incluiu a compactina estatina (PCN, 5 uM), 25-oxisterol HC (1 ug /ml), ou LDL (50 ug /ml) durante 24 h. actividade de luciferase específicas do SRE foi determinada como descrito em Materiais e Métodos, e normalizada para o estado do veículo. Os valores do tipo selvagem e do promotor mutante são mostrados na Fig. S1. Os dados são a média + SEM, a partir de 3 experiências em separado para cada linha celular. Cada experiência foi realizada com poços em triplicado por condição. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, de duas amostras

t

-test contra o estado do veículo. (B) Os dados de (A) foi sobreposto, representados como a média ± SEM para cada ponto de dados. As linhas celulares de CaP são representados por linhas a cheio, enquanto que os não-PCA linhagens de células são representadas por linhas tracejadas. (C) As células foram tratadas com PCN (5 mM) ou HC-25 (1 ng /ml) durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a SDS-PAGE e Western colocados a hibridar com o anticorpo de IgG anti-1C6-SREBP-2. O produto de clivagem do terminal C de SREBP-2, SREBP-2 (C), está marcada com uma seta – assume-se que a banda a seguir é uma banda não específica. Sondagem de α-tubulina serviu como um controlo de carga interno. O blot mostrado é representativa de pelo menos 2 experiências separadas para cada linha celular.

Em células LNCaP, a actividade específica do SRE (Fig. 2A) apareceu mais sensível do que a expressão do gene alvo SREBP-2 ( a Fig. 1) para o tratamento de esterol. Consequentemente, sobrepondo os dados para cada linha celular (Fig. 2B) revelou que cada linha celular foi afectada de forma semelhante por tratamento de esterol. Em contraste, o tratamento compactina novamente demonstrado que PC-3 e as células LNCaP diferem na medida das suas respostas homeostáticos: a actividade específica do SRE foi grandemente aumentada em células LNCaP em comparação com os não-PCA linhagens de células (linhas a tracejado), em contraste com As células PC-3 (Fig. 2B). Interessantemente, em células PrEC, a resposta a compactina (Fig. 2A) foi reduzido em comparação com o SREBP-2 de expressão do gene alvo (Fig. 1A). Isto sugere que outros factores de transcrio pode alterar o efeito de SREBP-2 sobre a expressão do gene alvo, o que justifica a utilização do ensaio de luciferase específicas do SRE.

No entanto, a isoforma de SREBP-1-A também se liga ao mesmo como SREs SREBP-2 com forte afinidade [7], potencialmente confundir estes resultados. Assim, testou-se se este efeito era por Western blotting-2-SREBP específica. Uma vez que o anticorpo IgG anti-1C6-SREBP-2 liga-se ao terminal C [20], que detecta o produto de clivagem do terminal C, que dá uma indicação de processamento de SREBP-2. Por exemplo, esteróis iria favorecer a manutenção das SREBP-2 precursor no ER [21], reduzindo SREBP-2 clivada. Verificou-se que 25-HC reduzida SREBP-2 de clivagem em todas as três linhas de células de próstata, enquanto compactina aumento SREBP-2 em células de clivagem PrEC e LNCaP, mas não em células PC-3 (Fig. 2C). Assim, o grau de processamento de SREBP-2 correlacionada com a regulação da actividade do promotor (Fig. 2A, B) e SREBP-2 de expressão do gene alvo (Fig. 1) observou nestas linhas celulares APC. No geral, esses dados mostra que as células PC-3 e LNCaP são ambos sensíveis aos esteróis, mas diferem em suas respostas a compactina tratamento.

Mudanças na atividade SREBP-2 traduzir para o nível funcional em células CaP

para ver se a regulação da transcrição exerce efeitos homeostáticos sobre o metabolismo do colesterol em células APC, foram examinados os efeitos de alteração de estado de esterol na actividade LDLR e síntese do colesterol.

A actividade de LDLR foi determinada utilizando um ensaio de captação de LDL . A seguir à incubação com DII-LDL (LDL marcadas com o corante fluorescente Dil), a fluorescência subsequente das células fornecida uma indicação da absorção de LDL. Desde LDL é internalizado a 37 ° C, mas não a 4 ° C [22], cada experiência foi realizada duas vezes em simultâneo, com um conjunto de células incubadas com DII-LDL a 37 ° C e o outro a 4 ° C – a diferença de fluorescência entre os dois conjuntos fornecida uma medida de internalizado DII-LDL. Isto também controlado por uma ligação não específica de DII-LDL. Este ensaio revelou que, em relação ao estado do veículo, 25-HC causou uma diminuição significativa na internalização DII-LDL em todas as-tipos de células (Fig. 3a). Em contraste, o aumento da actividade do LDLR compactina em células LNCaP única, não tendo qualquer efeito significativo nas células PrEC e causando uma diminuição (embora não significativa,

P

= 0,08) em células PC-3 (Fig. 3A).

as células foram tratadas com a compactina estatina (PCN, 5 ^ M) ou a oxisterol 25-HC (1 ug /ml) durante 24 h em meio C. Prepararam-se células (a), tratadas, e ensaiadas para DII internalização -ldl como descrito em Materiais e Métodos. A quantidade de DII-LDL internalizado fornece uma indicação da actividade do LDLR. Os dados são apresentados como média + SEM, a partir de pelo menos 3 experiências em separado para cada linha celular. Cada experiência foi realizada com poços em triplicado por condição. (B) Depois do tratamento, as células foram lavadas com PBS e radiomarcados com [1-

14C] -acético durante 2 h. A marcação radioactiva foi realizada na presença de tratamento, com a excepção de o tratamento PCN (caso em que o PCN estava ausente). As células foram então colhidas e os extractos lipídicos foram submetidos a cromatografia em camada fina e imagiologia com fósforo como descrito em Materiais e Métodos. Os phosphorimages apresentados são representativos de pelo menos 3 experiências em separado para cada linha celular. A densitometria foi executada e os dados apresentados como a média + D.P. para cada linha celular. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01, de duas amostras

t

-test contra o estado do veículo

para determinar a síntese de colesterol, as células foram marcadas radioactivamente após o tratamento. O tratamento de 25-HC foi mantida durante a marcação radioactiva, enquanto que o tratamento de compactina foi removido – desde compactina iria reduzir a síntese de colesterol, que em vez tentaram simular o ‘efeito de ressalto estatina’ [23]. Este fenómeno é uma resposta homeostática para compactina: normalmente, compactina aumenta SREBP-2 de processamento (Fig. 2B), hiperregular a expressão de enzimas de síntese de colesterol. Por conseguinte, quando compactina é removido, devido aos elevados níveis de enzimas presentes, haverá um grande fluxo através da via. Este ironicamente provoca um aumento agudo nos níveis de colesterol. Isto pode ser observado na PrEC e células LNCaP (Fig. 3B). No entanto, pré-tratamento de compactina surpreendentemente reduzida síntese do colesterol durante a radiomarcação, em células PC-3 (Fig. 3B). Apesar disso, 25-HC aboliu a síntese de colesterol em todas as três linhas celulares (Fig. 3B).

Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a regulação tanto a entrada de colesterol (LDL via) e síntese são sensíveis aos níveis de esterol em células APC.

basal atividade SREBP-2 é maior em células PC-3 do que em células LNCaP

Enquanto o PC-3 e linhagens de células LNCaP são esteróis-responsivo, SREBP-2 actividade em células PC-3 revelou-se menos sensível a níveis reduzidos de colesterol (compactina tratamento, as Figs. 1, 2). Estas experiências foram conduzidas em condições de lipoproteínas-deficiente (meio C), ao passo que um aumento de duas vezes na actividade específica do SRE foi observado com o tratamento de compactina (em relação ao tratamento com veículo) sob condições cheio de soro (Fig. 4). Isto sugere que, em células PC-3, o efeito de compactina é mascarado por ‘saturação’ de processamento de SREBP-2 em meios de lipoproteínas-deficiente, de modo que ainda mais privação de colesterol por meio do tratamento compactina teria pouco efeito. Isto implica ainda que as células PC-3 não são insensíveis a compactina

per se

, mas requerem menos privação de esterol para maximizar SREBP-2 actividade em comparação com outras linhas celulares, incluindo as células LNCaP.

células PC-3 foram transfectadas tal como descrito em Materiais e Métodos. O tratamento incluiu a compactina estatina (PCN, 5 mM) ou HC-oxisterol 25 (1 ug /ml) durante 24 h, em qualquer cheio de soro (meio A) ou soro deficiente em lipoproteína (Meio C). actividade de luciferase específicas do SRE foi determinada como descrito em Materiais e Métodos, e normalizada para o estado do veículo. Os dados são a média + DP, representativa de 2 experiências separadas. Cada experimento foi realizado com poços em triplicado por condição.

Esta diferença importante entre LNCaP e PC-3 células foi mais explorada. Como um estudo de caso, o regulamento de base e atividade da LDLR foram consideradas em condições de lipoproteínas com deficiência, a partir de experiências descritas nas figuras 1-3. Em primeiro lugar, os dados de expressão de mRNA foi considerado: o Sc

valores de t para um limiar de 10

-1.5 unidades de fluorescência normalizados foram comparados entre as células LNCaP PC-3 e. Os C

valores de t para o gene housekeeping, deaminase porfobilinogênio (

PBGD

), foram semelhantes entre os dois linhas de células (

p

≈0.73), justificando esta comparação. O valor médio

LDLR

Sc

t foi ~ 2 unidades inferiores em células PC-3, indicando a 4 vezes maior basal

LDLR

expressão de mRNA de células LNCaP (Fig. 5A) . Subsequentemente, a actividade basal LDLR também foi significativamente mais elevada em células PC-3 (Fig. 5B).

Os dados foram reunidos a partir de experiências em que as células LNCaP e PC-3 receberam tratamento com veículo em Meio C por 24 h. (A) Para cada experiência qRT-PCR, o Sc

valores de t (para limiar = 10

-1.5 unidades de fluorescência normalizados) para o

gene LDLR

, em relação ao

PBGD

gene housekeeping, foram considerados. A expressão é representado como uma mudança de dobragem (em relação a células PC-3), em que um aumento de uma unidade na ôc

t resulta em uma diminuição de duas vezes na expressão de ARNm. Os dados são apresentados como média + SEM, a partir de, pelo menos, 4 experiências separadas para cada linha celular. (B) A absorção de LDL bruto, medida como fluorescência normalizados pelo teor de proteína no ensaio de captação de LDL, foi em média entre experiências e feita em relação às células PC-3. Os dados são apresentados como média + SEM, a partir de pelo menos 3 experiências em separado para cada linha celular. (C) Para cada ensaio de luciferase específicas do SRE, o pirilampo /

Renilla luciferase

rácios gerados a partir do plasmídeo LDLP-mutSRE foram normalizados ao do plasmídeo LDLP-588luc. Dados apresentados como média + SEM, a partir de, pelo menos, 5 experiências separadas para cada linha celular. Cada experimento em (A) – (C) foi realizada em triplicado em poços por condição. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, de duas amostras

t

-test contra células PC-3. (D) Um modelo que descreve as diferenças na homeostase do colesterol entre as células LNCaP PC-3 e. O nível limiar de colesterol celular, à qual a actividade de SREBP-2 torna-se dramaticamente reduzida, pode ser mais elevada em células PC-3. Isto reduziria o efeito das estatinas, em relação ao estado basal.

Juntamente com a fig. 2C, isto implica que a actividade basal SREBP-2 é mais elevada em células PC-3. No entanto, outros factores de transcrição também podem contribuir para a expressão de genes de SREBP-2-alvo. Assim, as experiências anteriores de luciferase específicos do SRE foram re-analisados. Para a condição do veículo, a actividade da luciferase em relação gerada pela LDLP-mutSRE (SRE mutado em

LDLR

promotor) foi considerado como uma proporção do que de LDLP-588luc (do tipo selvagem

LDLR

promotor) . A actividade da luciferase mutSRE-FLUC foi assumida como representando actividade não SRE desde compactina e 25-HC tratamento tinha pouco efeito sobre a actividade LDLP-mutSRE em todas as linhas celulares (Fig. S1). A proporção mutSRE-FLUC /LDLR-FLUC foi maior em células PC-3 do que as células LNCaP (Fig. 5C), indicando que outros factores de transcrição podem também contribuir para as diferenças de

LDLR

expressão de ARNm observada entre estes cell- linhas (Fig. 5A). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a atividade basal jusante do SREBP-2 é regulada em células PC-3, resultando em uma resposta máxima em condições basais.

Discussão

Nesta investigação, procuramos para obter insights sobre homeostase do colesterol celular na definição CaP. Um feedback em resposta aberrante de esteróis parece ser um fenômeno comum em células cancerosas [9], [12] – [15] e explicaria o acúmulo de colesterol em CaP clínica [10], [11]. Nossos resultados sugerem que o processamento regulada por esteróis de SREBP-2 existe em células PCA (Fig. 2C). Por conseguinte, a regulação de esterol realimentação teve efeitos a jusante do SRE (Fig. 2B), sobre a expressão de genes alvo SREBP-2 (Fig. 1B), e no nível funcional (Fig. 3). Consideramos também a resposta destas células a níveis de esteróis reduzidos, encontrando que as células PC-3 e LNCaP diferiam em seus graus de regulação (Fig. 5).

Nas células PC-3, esteróis causou uma diminuição significativa na actividade SREBP-2, em conflito com os achados anteriores [9]. Além das considerações metodológicas, como quantitativa contra métodos semi-quantitativos de determinação mRNA, outros fatores podem explicar a discrepância com as suas conclusões. Por exemplo, demonstrou-se que células de adenocarcinoma do cólon não foram afectadas pela esteróis em altas densidades, mas demonstrou regulação feedback quando plaqueadas a densidades mais baixas [14]. Células a densidades mais baixas estão em crescimento exponencial, com maiores taxas de absorção de colesterol e síntese encontrados tanto em células cancerosas e normais [14], [24]. Isso poderia permitir a reconciliação dos resultados aqui com os do estudo anterior [9], particularmente desde que seus experimentos foram realizados para uma maior duração (30 e 45 h, contra 24 h aqui). Nós plaqueadas células PC-3 de baixa densidade, para evitar overconfluence às 48 h, e encontrou sensibilidade à esteróis até 48 h (Fig. S2).

De modo semelhante, os esteróis foram encontrados para reduzir a actividade de SREBP-2 em células LNCaP (Fig. 2). Aqui, houve uma ligeira diminuição na SREBP-2 expressão do gene alvo (Fig. 1), enquanto que a absorção de colesterol e síntese foi abolida (Fig. 3). Isto é suportado por uma descoberta anterior de que os esteróis regulada negativamente a expressão da HMG-CoA sintase, um outro alvo SREBP-2, em células LNCaP [25]. Assim, as células CaP são realmente sensíveis ao aumento dos níveis de esteróis. Isto não nega a idéia de esteróis-feedback interrompido em células APC, mas levanta mais questões: fazer linhas de células de laboratório CaP acumular colesterol, como é visto em CaP clínica [10], [11]? Será que as células CaP ser menos sensíveis a esteróis em um

in vivo

contexto, como em xenoenxertos? Claramente, esta merece uma investigação mais aprofundada.

Também examinamos a situação inversa, reduzindo os níveis de colesterol utilizando a compactina estatina. De modo semelhante às células PrEC, este aumento da actividade SREBP-2 (Fig. 2), reforçado SREBP-2 de expressão do gene alvo (Fig. 1), e induziu um efeito estatina-ricochete na síntese do colesterol (Fig. 3B) em células LNCaP. Curiosamente, compactina não afectou a actividade de LDLR em células PrEC (Fig. 3A), enquanto que foi proposto que as estatinas reduzem os níveis de colesterol no sangue por aumento da expressão do LDLR (aqui visto na Fig. 1A) e, assim, a absorção de LDL [26]. Esta aparente paradoxo pode ser explicado desde PCSK9 (pró-proteína subtilisina convertase /Kexin tipo 9), um outro alvo SREBP-2, foi encontrado para promover a degradação do LDLR, limitar a eficácia das estatinas [27], [28]. células LNCaP parecem ignorar esse mecanismo regulador (Fig. 3A), demonstrando o aumento da atividade LDLR após tratamento compactina. Em geral, isto mostra que as células LNCaP responder aos níveis baixos de esterol.

Em contraste, compactina não causar um aumento significativo na expressão do gene alvo SREBP-2 (Fig. 1) em células PC-3, em relação ao condição do veículo. Compactina foi confirmada para inibir a síntese de colesterol por marcação metabólica. Assim, a falta de efeito compactina é provavelmente devido à próxima do máximo de SREBP-2 de processamento de incubação nos meios de lipoproteína-deficiente (Fig. 4). Apoiando isto, os níveis basais de SREBP-2 transformadas parecem ser mais elevada em células PC-3 (Fig. 2C), e expressão do LDLR actividade basal e foram maiores em PC-3 do que as células LNCaP (Fig. 5A, B). Assim, as células PC-3 requerem menos privação de esterol de modo a invocar uma resposta máxima a partir da via de SREBP-2. Além disso, o tratamento de compactina tenderam a reduzir a actividade de LDLR (Fig. 3A) e a síntese de colesterol pré-tratamento reduzido (Fig. 3B), por razões que são ainda pouco claro.

Portanto, as células PC-3 e LNCaP variam na sua colesterol homeostase. Radhakrishnan

et al.

[29] propor um “controle de mudar-like ‘da atividade SREBP-2, em que uma queda acentuada no processamento de SREBP-2 ocorre quando os níveis de colesterol intracelular (ER) atingir um limite preciso. Propomos que esta ‘calibre regulador “é mais elevada em células PC-3 (Fig. 4D), correspondendo a 1) células PC-3 que têm maior SREBP-2 do que as células LNCaP, 2) estatinas parecendo ter pouco efeito basal em PC- 3 células (em relação à condição basal), e 3) esteróis redução da atividade SREBP-2 em ambas as linhas celulares APC.

Esta diferença na regulação do colesterol podem ser atribuídas a outras diferenças fenotípicas entre estas linhas celulares, tais como a capacidade de resposta de androgénio. células LNCaP de androgênio-sensíveis [30], enquanto que as células PC-3 são relativamente independentes de androgénio-[31]. Os androgénios têm sido mostrados para regular a expressão SCAP, aumentando subsequentemente SREBP-2 activação [32]. Desde a falta de regulação por feedback foi previamente observado nas linhas celulares de CaP andrógeno-independente (PC-3, DU145) [9], tem-se argumentado que interrompeu o feedback dos esteróis pode estar associada com a privação de andrógeno, porque SREBP-2 foi regulada em xenoenxertos de LNCaP

in vivo

sobre a castração de acolhimento [33]. No entanto, isso não pode ser conciliada com os nossos resultados, pois células PC-3 foram encontrados para ser sensível ao esteróis aqui. No entanto, um fator envolvido na andrógeno-independência pode favorecer células PC-3, potencialmente elevando base atividade SREBP-2. Alternativamente, outros factores de transcrição podem contribuir para a expressão do gene alvo SREBP-2 (Fig. 5C), tais como oncostatina M ligação ao PAI (independente do elemento de resposta do esterol) dentro do

LDLR

promotor [34], aumentando metabolismo do colesterol basal em células PC-3. Investigações adicionais são necessárias para delinear os mecanismos precisos pelos quais homeostase do colesterol difere nestas linhas celulares PCA – à luz disto, um estudo recente relatou diferenças no perfil transcricional entre LNCaP e as células PC-3 [35], embora não diretamente relacionados com a homeostase do colesterol.

Consequentemente, nossos resultados suportam a afirmação de que estas duas linhas celulares não podem ser tratados exemplos como sinônimo de linhas celulares PCA para

in vitro

estudos [35], [ ,,,0],36]. No entanto, é difícil relacionar estes resultados a um ambiente clínico, porque, com o melhor de nosso conhecimento, nenhum estudo examinou a regulação mediada por esteróis de SREBP-2 e metabolismo do colesterol em células isoladas de amostras de próstata. Além disso, tem havido relatos contraditórios sobre o perfil de expressão de CaP em um contexto relacionado com o esterol. Por exemplo, em estudos recentes examinar o perfil mudando com progressão para a metastática, estado refractário a hormonas: Alguns estudos encontraram um aumento na expressão de SREBP-2 [37] e esterol biossintética [38] genes, enquanto que outro encontrada uma diminuição [ ,,,0],39]. Tais conflitos podem resultar de diferenças em populações de pacientes, preparações de amostra, ou plataformas de microarray (revisto em [40]).

No entanto, tem-se argumentado que as células LNCaP são mais característicos do CaP clínica do que as células PC-3 [41], [42]. Assim, as descobertas aqui podem ter ramificações clínicos: em particular, as células LNCaP têm maior actividade LDLR em resposta a compactina tratamento. Isto sugere que o tratamento com um fármaco redutor de colesterol (tais como uma estatina) pode induzir captação de LDL especificamente em células APC. Isto implica que a administração concomitante de tais agentes quimioterapêuticos específicos do tumor, incorporada LDL ou outras vesículas LDLR de ligação a [43], [44], pode proporcionar uma opção de tratamento potencial de CaP.

Materiais e Métodos

Materiais

células PrEC humanos não-cancerosas foram obtidos a partir de Lonza (Mt Waverley, Vic, AU), de prepúcio humano células FB foram um presente do Dr. Ingrid Gelissen (Universidade de New South Wales, AU)