Abstract

Fundo

O câncer de próstata é a segunda principal causa de morte por câncer entre os homens. múltiplas evidências sugere que uma população de tumor de iniciação, ou células-tronco cancerosas (CSCs) é responsável pelo desenvolvimento do câncer e resistência aos medicamentos excepcionais, o que representa um alvo terapêutico muito importante. O presente estudo avaliou alterações CSC específicos induzida pela nova geração taxóide SBT-1214 e um romance curcuminoid de ligação de zinco polyenolic, CMC2.24, em CSCs próstata.

principais conclusões

O CD133

alta /CD44

alta fenótipo foi isolado a partir de células ppt2 derivado do paciente espontaneamente imortalizadas e células PC3MM2 altamente metastáticas. tratamento semanal dos ratinhos NOD /SCID que possuem tumores e PPT2–induzidas PC3MM3 com o TRE-1214 levou à supressão dramática do crescimento do tumor. Quatro dos seis ppt2 e 3 de 6 tumores PC3MM2 tenham revelado a ausência de células viáveis ​​em tumores residuais.

Em

vitro

, SBT-1214 (100 nM-1? M; durante 72 horas) morte celular induzida por cerca de 60% em CD133

alta /CD44

+ /células de alta cultivadas em colagénio I em meio para mastócitos (em contraste, nas mesmas doses de paclitaxel aumentou a proliferação dessas células). Os efeitos citotóxicos foram aumentados quando SBT-1214 foi combinado com o CMC2.24. Um ensaio de PCR array específico de células-tronco revelou que esta combinação de fármacos mediado inibição maciça de vários genes relacionados com células-tronco constitutivamente-regulada, incluindo os factores-chave pluripotência transcrição. É importante ressaltar que esta combinação de drogas induzida expressão de p21 e p53, que estavam ausentes em CD133

CD44

células de alta /alta. As células viáveis ​​que sobreviveram este regime de tratamento já não eram capazes de induzir esferóides secundárias, exibiram alterações morfológicas significativas e morreu em 2-5 dias.

Conclusões

Nós relatamos aqui que só o SBT-1214 , ou em combinação com CMC2.24, possui actividade significativa contra próstata CD133

alta /CD44

+ /células de alta de iniciação do tumor. Esta combinação de drogas inibe eficientemente a expressão da maioria dos genes relacionados com células estaminais e factores de transcrição pluripotência. Além disso, ela induz uma expressão anteriormente ausente de p21 e p53 ( “gene wake-up”), o que pode potencialmente reverter a resistência aos medicamentos, aumentando a sensibilidade às drogas anti-câncer

Citation:. Botchkina GI, Zuniga ES , Rowehl RH, Parque R, Bhalla R, Bialkowska AB, et al. (2013) cancro da próstata Stem Eficácia Targeted-celular de uma Nova Geração de taxóide, SBT-1214 e Novel curcuminoide, CMC2.24 Polyenolic Zinc-Binding. PLoS ONE 8 (9): e69884. doi: 10.1371 /journal.pone.0069884

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 13 de junho de 2013; Publicação: 24 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zuniga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 CA150085, NYSTAR concessão 1.072.170 e, em parte, pelo Instituto de química Biologia Drug Discovery (ICB DD); Stony Brook University Cancer Center, NY; ChemMaster International, NY e SBU VP de Investigação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O papel da ChemMaster International, Inc., como o inventor do CMC2.24 foi sintetizar e fornecer, em espécie, o material para o estudo atual. Esta empresa é uma entidade semi-acadêmica (Presidente, Francis Johnson, PhD, é professor do Departamento de Química e do Departamento de Ciências Farmacêuticas na SBU) que se especializa em sínteses de várias etapas para grupos académicos e industriais. Esta empresa não forneceu qualquer apoio referentes ao emprego, consultoria, patentes ou produtos em desenvolvimento ou aos comercializados. Os autores confirmam que o fornecimento de pesquisa atual com CMC2.24 não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os autores não têm quaisquer potenciais interesses financeiros ou não financeiros, profissionais ou pessoais concorrentes.

Introdução

O câncer de próstata (RPC) é a segunda principal causa de morte por câncer entre os homens no Oeste sociedade [1]. É inicialmente sensíveis a terapia de privação de androgénio, mas mais do que 70% dos pacientes terão de enfrentar recorrência pós-tratamento e de transição da doença para um estado incurável [2]. Para os pacientes diagnosticados com pRc independente de androgénios, estabilizadores de microtúbulos, tais como o paclitaxel (Taxol); Ptx é uma estratégia de tratamento de primeira linha, que é inicialmente eficaz. No entanto, abordagens para o tratamento resistente à quimioterapia RPC não existem actualmente [3]. Depois da descoberta inicial de cancro de células estaminais, CCC [4], tornou-se cada vez mais evidente que os tumores são organizados de forma hierárquica, que contém uma população relativamente menor (mas variável) de células de iniciação do tumor e uma maioria heterogénea de células tumorais a granel em diferentes fases de maturação. Em apoio da noção de CSC de carcinogénese, um estudo recente demonstrou que a expressão de vários marcadores vulgarmente utilizados CSC, isto é, CD44, CD166 e de ALDH-1, bem como a proporção das células que expressam estes marcadores, aumenta com o envelhecimento [5] . É um fenômeno estabeleceu que o envelhecimento se correlaciona com um aumento acentuado na incidência de próstata e muitos outros tipos de câncer [1]. conhecimento acumulado indica claramente que CSCs são responsáveis ​​pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência a modalidades de tratamento padrão. Assim, tem sido demonstrado para muitos tipos de cancro que as células tumorigénicas que expressam marcadores comuns CSC, nomeadamente CD133 e CD44, são excepcionalmente resistentes a drogas anti-cancro convencionais (tais como 5-FU, oxaliplatina, irinotecano, docetaxel e outros). Além disso, o número de tais células podem ser propagadas significativamente após a terapia [6-13], que normalmente se manifesta como doença mais resistente a drogas e recorrente mais agressivo e metastático. Portanto, é concebível que os CSCs representam o alvo mais crucial no desenvolvimento de uma nova geração de fármacos anti-cancro.

avaliação pré-clínica dos agentes anti-cancro é tradicionalmente candidatos com base na utilização de culturas de monocamada do total, as células cancerosas não selecionados. No entanto, este modelo in vitro ignora células iniciadoras de tumores raros ainda funcionalmente significativos, altamente resistentes aos medicamentos, e, assim, tem baixa relevância para a complexidade e fisiopatologia da

In vivo

tecidos tumorais. Além disso, foi recentemente demonstrado que as linhas celulares de cancro estabelecidas mais vulgarmente utilizados têm nenhuma correlação com amostras clínicas originais, as quais podem levar a A desvalorização crítica de eficácia de drogas [14]. Isso pode explicar em parte a alta taxa de atrito de agentes anti-câncer candidatos. Assim, apenas 5% de agentes que possuem actividade anti-cancro em desenvolvimento pré-clínico são licenciados [15]. Portanto, a identificação e caracterização de CSCs derivado do paciente, o desenvolvimento de melhor

In vivo

e

in vitro

modelos pré-clínicos e análises CSC-alvo das alterações induzidas pela droga representam passos críticos na avaliação de drogas anti-câncer inovadoras. No entanto, é notoriamente difícil de estabelecer linhas de células primárias de carcinomas da próstata, e este campo continua a ser um dos temas mais controversos na investigação sobre o cancro [16]. Em primeiro lugar, PRC é uma doença maligna com um elevado grau de heterogeneidade celular e molecular, por conseguinte, existem dificuldades objectivas para o isolamento de populações de células puras a partir de tecidos da próstata. No nível molecular, não existem actualmente marcadores definitivos para provar a natureza maligna ou não maligna das células da próstata, e para distinguir entre as células-tronco normais e cancerosas. A evidência crescente sugere também que os CSCs pode representar uma subpopulação heterogénea das células de iniciação do tumor [17-23]. No entanto, uma combinação de vários marcadores de superfície celular para a célula inicial seguido por triagem funcional completa caracterização dos fenótipos celulares isoladas podem levar à identificação dos mais funcionalmente significativa (isto é, e metástase tumor-iniciadora, ou o mais resistente a drogas) célula populações.

Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que um taxóide de nova geração, SBT-1214, induz a supressão eficaz a longo prazo de xenoenxertos do tumor do cólon [24] e de forma dramática, regula negativamente a expressão de múltiplos haste genes relevantes de células-[25]. Procura de agentes de segurança que pode, potencialmente, diminuir a toxicidade sistémica e melhorar ainda mais as atividades CSC-alvo do SBT-1214, que foram motivados por inúmeras características anti-câncer da curcumina fitoquímico natural (diferuloylmethane). Num grande número de estudos, a curcumina foi reportado para amplificar os efeitos citotóxicos induzidos por diversos fármacos quimioterapêuticos e, mais importante, a capacidade de inibir a clonogénico e induzir efeitos pró-apoptóticos em células resistentes a drogas expressam marcadores de células estaminais [26]. Em particular, a curcumina diminui significativamente o potencial proliferativo e aumenta a apoptose de linhas celulares de cancro da próstata, tanto andrógeno-dependente e independente de androgénios [27,28]. No entanto, a curcumina tem baixa bioatividade e biodisponibilidade, o que estimulou-nos a desenvolver cerca de 30 análogos estruturais da curcumina (agentes de ligação Zink polyenolic; PEZBINs), incluindo o composto chumbo atual, CMC2.24, que tem maior bioatividade, melhor solubilidade e nenhuma evidência de toxicidade, mesmo em doses elevadas [29]. O objetivo deste estudo foi testar a eficácia do SBT-1214 como um agente único, e sua combinação com este romance curcuminoide contra células iniciadoras de tumores da próstata primários e metastáticos.

Resultados

estabelecimento e caracterização da linha de células de câncer de próstata primário espontaneamente imortalizada, ppt2

as células dissociadas de biópsias por agulha de 22 carcinomas da próstata ressecados de vários graus histológicos foram testados para clonogênica e tumorigénico potencial

in vivo

e

in vitro

como descrito na secção de Métodos. Vinte amostras continha uma subpopulação das células rápidos-aderente (FA) para o colagénio do tipo I, que inicialmente proliferaram em meio para mastócitos isento de soro. Quatorze dos 22 espécimes induzida flutuante agregados multicelulares, e apenas três espécimes foram capazes de induzir densa 3D esferóides característica da CSCs. No entanto, a maioria das células primárias perderam as suas capacidades clonogénicas e formando-esfera depois de várias passagens, o que está de acordo com observações de que numerosas células de cancro da próstata primário têm um tempo de vida finito (5-6 passagens) [16]. Em contraste, as células tumorais isolados do paciente com estágio pT2c PnX pMX RPC foram espontaneamente imortalizada e continuou a longo prazo

in vitro

e

in vivo

crescimento (28 passagens, atualmente). Com rodadas de série de transplantes e passaging num meio de células-tronco, três populações diferentes de células tornou-se evidente: a maior população de células alongadas, inúmeros holoclones redondos contendo células pequenas e grandes células raras, multinucleadas (que muitas vezes observamos em vários estabelecida e de próstata primário e linhas de células de cancro do cólon). A subclonagem destes pequenos de células contendo-holoclones levaram ao enriquecimento dramático de células que expressam níveis elevados de CD133, CD44, CD44v6, EpCAM, CD49f e CD166 (Figura 1A). Esta linha de células (chamado ppt2) foi serialmente propagada como xenoenxertos NOD /SCID tumorais, flutuando esferóides 3D e tipo I culturas de colágeno-aderente. De acordo com o relatório ATCC (ID número 002872), as células ppt2 são células humanas únicas com páreo para qualquer perfil no banco de dados ATCC STR, o que significa que eles não estão contaminados com quaisquer linhas celulares estabelecidas conhecidos. Embora fenótipo das culturas CSC-enriquecido é dinâmico devido à natureza dual das CSCs (ou seja, a capacidade de se auto-renovar e gerar progenitores comprometidos), as células ppt2 reter fenótipos relativamente estáveis, mesmo até 8 semanas após a última MACS- CD133

+ separação de células e cultura em superfícies revestidas com colagénio de tipo I em meio de crescimento da célula estaminal mesenquimal sem soro, MSCGM (Lonza; Tabela 1; Figura 1). Assim, praticamente toda a população de células ppt2 era indiferenciada (apenas 3-5% expresso marcador de células diferenciadas, pan-queratina), positivos para EpCAM, CD49f, isoforma padrão da CD44 (98-99%; clone MEM-85; Invitrogen), e até 72% isoforma expressa variante, o CD44v6 (clone 2F10; R D). Após ° 27 passagens, cerca de 90% das células ppt2 ainda expressam níveis moderados a elevados de CD133 e possuem grande capacidade de formação de esfera na cultura 3D contendo 1: 4 Tipo de colágeno I /Stemline pluripotentes Meio de Cultura (SPCM; Sigma-Aldrich ). Doze dezasseis por cento das células eram ppt2 positivo para o receptor de androgénio (AR

+), e 8-10% eram positivas para o CXCR4 (Figura 1A). Em contraste com o tecido do tumor original, purificada CD133

+ células não expressam PSA, que apareceram novamente nas NOD /SCID tumores ratos após o transplante do CD133

+ células (Figura 1B). A grande maioria do CD133

+ ppt2 células expressavam níveis elevados citoplasmáticos de vimentina e nestina, característica de neural e células estaminais embrionárias. A expressão destes dois marcadores foi mais elevada em células gigantes multinucleadas (PTM; Figura 1C). Ambas as fracções nucleares e citoplasmáticos das células ppt2 expressa c-myc, ao passo que outros marcadores de pluripotência (Oct-4 e Sox-2) foram detectados apenas na fracção nuclear (Figura 1D). Importante, as células ppt2 foram negativas para proteínas pró-apoptóticas supressores /tumor, p53 e p21, e extremamente resistentes a drogas anti-cancro padrão. Ao tempo presente, após cerca de 2,5 ano de manutenção, a grande maioria das células ppt2 permanece em um estado imaturo, continua a expressar elevadas proporções e níveis elevados de marcadores stemness e pluripotência comumente utilizados mencionados acima e retém muito elevado de iniciação do tumor, clonogénico e esfera de formação de capacidades durante transplantes de série dos números de células relativamente baixos. Todos os itens acima motivou nossa equipe para testar as duas drogas proprietárias, SBT-1214 e CMC2.24 contra esta altamente resistente à droga, CSC-enriquecido próstata principal linha de células de câncer e para comparação, contra estabeleceu um derivado altamente metastático do PC-3 linha de células, as células PC3MM2, que foram caracterizados em nosso estudo anterior [30].

(a) analisa Representante FACS da expressão diferente marcadores da superfície celular em células ppt2 indiferenciados cultivadas durante 4 semanas em colágeno tipo I em MSGB médio. Cada quadrado a tracejado representa a população de células que expressam elevados níveis moderados /de um determinado marcador conjugado com diferentes etiquetas fluorescentes. Nota a retenção a longo prazo do CD133-APC, padrão (CD44-PE) e variante (CD44v6-FITC) e CD44-APC CD49f. Em contraste, apenas pequenas fracções das células ppt2 expressa um marcador de células basais, o p63, um marcador de células diferenciadas, Pan-queratina, CK18, AR e CXCR4. (B) A análise imunohistoquímica mostra que, em contraste com o tecido do tumor parental, purificadas CD133

+ ppt2 células não expressam PSA

em

vitro

; No entanto, NOD-SCID induzida ppt2 /xenoenxertos tumorais são fracamente PSA-positivo. (C) Análise imunocitoquímica revela expressão de vimentina uniforme e nestina, especialmente com níveis elevados destes marcadores de células estaminais neurais em grandes EMNs. (D) Análise de mancha de Western mostra a expressão dos marcadores de pluripotência em fracções nucleares e citoplasmáticos da CD133

+ ppt2 células. Ambas as fracções nucleares e citoplasmáticos expressa c-Myc e foram negativos para p53 e p21; apenas a fracção nuclear expressa Oct-4 e Sox-2.

células ppt2 ** células PC3MM2

***

marcador

Origem e Expr. nível

% das células

Expr. nível

% das células

CD133Miltenyi Bio +++ 75 ± 15 ++ /+++ 3 ± 1CD44Invitrogen MEM-85 +++ 99,5 ± 0,5 ++ /+++ 7,5 ± 2.5CD44v6R . D Clone 2F10 +++ 56 ± 16CD49fBioLegends +++ 99,5 ± 0,5 +++ 94 ± 2CD166BD Biosci. +++ 99,3 ± 0,5 ++ /+++ 86 ± 8EpCAMMiltenyi Bio. +++ 98 ± 0,5 ++ /+++ 83 ± 5Pan-KeratCell Signal. ++ 4 ± 1CK5Santa Cruz + 7 ± 1 + 3 ± 1CK18Santa Cruz + 5,5 ± 2,5 + 3,5 ± 0.5CK5 /CK18Santa Cruz + 4,5 ± 0,5 + 2,5 ± 0.5p63Santa Cruz + 5 ± 2,5 + 7 ± 1ARSanta Cruz + 14 ± 2 ++ /+++ 5 ± 2CXCR4R . D ++ 10,5 ± 1 +++ 12 ± 2Table 1. profiling fenotípica das células ppt2 e PC3MM2 com a análise FACS *

* percentual médio em particular de células que expressam marcadores de superfície celular foi calculada com base na três análises FACS independente. ** células ppt2 (não triados antes da análise, mas estabelecidos por repetidas anteriores MACS-CD133

+ separação de células) foram cultivadas em pratos de tipo I revestidas com colagénio em meio MSCB para 2, 4 e 8 semanas. *** células Unsorted PC3MM2 foram cultivados em tipo I pratos revestidos com colagénio em meio MSCB por 1-2 semanas. + ++ e +++ representa baixa, moderada e alta expressão. CSV Baixar CSV

efeitos citotóxicos do SBT-1214 contra células cancerosas da próstata CSC-enriquecido

in vitro

O tratamento com SBT-1214 e, para comparação, com o agente de microtúbulos comumente usado estabilização paclitaxel (Ptx; Taxol) aumentou as proporções de células com expressão máxima de CD133 num modo dependente da concentração (a partir de 10 nM a 10 uM; durante 24 horas) em ambas as linhas celulares ppt2 e PC3MM2 (FACS representativo é mostrado na Figura 2A, B) . Estes dados sugerem que as duas drogas células com baixa expressão CD133 preferencialmente afetados, e inicialmente não afetou ou mesmo estimular a proliferação das CD133

células de alta. No entanto, um tratamento mais prolongado (durante 48-72 horas) revelou uma diferença profunda entre os efeitos citotóxicos da TRE-1214 e Ptx: enquanto as células tratadas com Ptx retido viabilidade e o número de células viáveis ​​foi ainda aumentada, até 60% do SBT-1214-tratada CD133

+ células foram mortas com as mesmas concentrações do fármaco (os dados do ensaio de MTT são mostrados na Figura 2C, D; Figura 3A). Surpreendentemente, as concentrações mais baixas de SBT-1214 (100 nM-1 uM) induziu maior citotoxicidade em células ppt2 em comparação com a concentração do fármaco 10 uM. O paclitaxel a 10 uM foi citotóxico e morte celular induzida por cerca de 40% (Figura 2C, D). Neste ponto de tempo, um aumento da proporção de muito grandes MNCs (frequentemente ≥200 uM) foi óbvio em ambas as células e ppt2 PC3MM2 (Figura 3A, B). Para testar se o tratamento com SBT-1214 afecta o potencial clonogénico do CD133

+ células, ppt2 e PC3MM2 esferóides flutuantes foram tratadas com 1 uM do fármaco para 24 horas a fim de induzir alterações, mas evitar a morte celular profunda. Verificou-se que em contraste com controlar esferóides não tratadas, células TRE-1214 tratados perderam a capacidade de induzir tanto esferóides secundárias 3D (Figura 3C) ou colónias de colagénio aderente (não representada). Ambos os ppt2 e PC3MM2 células-tratamento sobreviventes exercida morte celular profunda em 2-5 dias após o tratamento com SBT-1214 (Figura 3D).

análise FACS representativos mostra um aumento dependente da dose nas proporções de CD133

alta ppt2 (A) e PC3MM2 (B) células 24 horas após o tratamento com SBT-1214 e Ptx. de tratamento mais longo (de 72 horas) com SBT-1214 (10 nM-10 uM) induziu-se a morte celular de 65% em células ppt2 (c) e até 60% em células PC3MM2 (D; A linha inferior). Em contraste, o tratamento com as mesmas doses de Ptx não suprimem a proliferação das células cancerosas da próstata tumorigénicas (C, D, linha superior). As células foram incubadas com as concentrações de droga indicadas, e os dados foram obtidos com o ensaio MMT padrão com base em três experiências independentes com quatro repetições em cada grupo de tratamento. Os valores são as médias ± DP.

(A, B) microfotografias de contraste de fase mostram que um único tratamento com 1 uM SBT-1214 durante 48 horas a morte induzida das células ppt2 PC3MM2 e com o enriquecimento do grandes células multinucleadas (setas). (C) a perda pós-tratamento da capacidade de formação de esfera de células sobreviventes em comparação com as não tratadas. Os valores são as médias ± DP baseados em 3 repetições independentes. (D) a morte profunda de células ppt2 e PC3MM2 tratados durante os próximos vários dias em cultura.

In vivo

eficácia do SBT-1214 contra xenoenxertos de tumor da próstata induzida por CD133

+ populações de células

Após o transplante do CD133

+ ppt2 e PC3MM2 células, os ratinhos NOD /SCID foram divididos aleatoriamente em 3 grupos para cada tipo de célula: uma como controlo não tratado (n = 4), um segundo grupo de tratamento SBT-1214 com 40, 40, 40 mg /regime kg por semana (n = 4), e um terceiro grupo de tratamento com 40, 20, 20, 20 mg /kg regime semanal (n = 6). O tratamento foi iniciado 2-3 semanas após o transplante das células tumorais, quando xenoenxertos do tumor atingiu 100 mm

3; o desenvolvimento do tumor foi monitorizado semanalmente. Embora todos os quatro tumores tratados com 40, 40, 40 mg /kg, tinham regime semanal drasticamente reduzido por o terceiro tratamento, todos os ratinhos que expressa sinais comuns de toxicidade sistémica e foram sacrificados (dados não são apresentados). O tratamento com 40, 20, 20, 20 mg /kg regime semanal mais significativa induzida a regressão do tumor (Figura 4A-D), com uma toxicidade sistémica muito menor. Uma semana após o último tratamento, todos os tumores residuais foram recolhidos e analisados ​​histopatologicamente e para

ex vivo

capacidade clonogénico. tumores de controlo não tratados foram removidos ao atingir ~ 2 cm no maior diâmetro, em conformidade com os requerimentos do IRB.

NOD /SCID foram ectopicamente implantados com 3.000 de CD133

células + ppt2 e PC3MM2 nos flancos. Três semanas após a injecção, os ratinhos foram tratados com i.v. semanalmente injecções de SBT-1214 (X4: 40, 20, 20, 20 mg /kg). Esta modalidade de tratamento induziu uma redução dramática no tamanho do tumor na maioria dos PPT2- e tumores induzidos PC3MM2 (A-D). casos representativos são apresentados em B e D. Os valores são as médias ± DP;

P

≤0.0009 para tumores induzidos ppt2 (SBT-tratados versus controlos não tratados; n = 6), e

P

≤0.0018 para tumores induzidos PC3MM2 (n = 6). A análise histopatológica dos tumores residuais mostraram a presença de células viáveis ​​e acumulação de grandes células multinucleadas em 2 de 6 ppt2 tumores e 3 de 6 PC3MM2 tumores (representante H E de coloração de tecidos tumorais ppt2-tratados SBT-1214 não tratado e é mostrado em E, F).

Ex

vivo

morte das células tratados com o fármaco em cultura (G). Controle de células tumorais não tratadas mantidas profundas capacidades clonog�icas e formando-esfera durante passagens em série (H).

A análise histopatológica.

A hematoxilina e eosina secções de tecido manchadas do paciente- não tratada controle derivada CD133

+ induzida por células NOD /SCID xenotransplantes tumorais ratos mostraram células epiteliais altamente atípicos que formam ninhos e estruturas glandulares-like, de acordo com adenocarcinoma pouco diferenciado (Figura 4E). Numerosas figuras de mitose atípica e necrose central eram geralmente presentes. Os dois maiores tumores residuais tratadas SBT-1214-induzidos ppt2 também foram diagnóstico de adenocarcinoma pouco diferenciado, mas possuía um maior grau de atipia nuclear, e apenas poucas figuras de mitose. Além disso, o tumor tratado com SB-1214 mostrou Hialinização focal, mas sem evidência de necrose. tumores residuais menores (n = 4) mostraram um maior nível de hialinização e uma falta de células viáveis.

alterações pós-tratamento em capacidades clonog�icas e formando-esfera.

suspensões de células totais do controlo e tumores residuais tratadas SBT-1214 foram cultivadas em pratos de tipo I revestidas com colagénio e placas ULA para testar a presença de CSCs e a sua capacidade para induzir esferóides secundários ou colónias de células aderentes. Quatro dos seis ppt2-induzida e três dos seis induzida por PC3MM2 SBT-1214 tumores residuais tratadas foram composto por tan ou escuras massas vermelhas que não revelem a presença de células viáveis, e não produziram qualquer colônias aderentes ou flutuantes em cultura. Dois dos tumores residuais tratadas post-induzidas ppt2 e três dos tumores induzidos por PC3MM2 continham células em proliferação lentamente viáveis. Os dois ppt2 tumores residuais também mostraram grupos de gigantes multinucleadas células-tratamento sobreviventes (setas na Figura 4F), similares aos comumente observada após o tratamento das populações CSC-enriquecido com agentes quimioterápicos

in vitro

(Figura 3B) . No entanto, estas células não induziu quaisquer esferóides compactos em condições de cultura de células não-aderentes, produzindo apenas agregados multicelulares soltas, que sofreram morte celular profunda em vários dias de

ex vivo

cultura (Figura 4G). Em contraste, dissociado células de xenoenxertos de tumores não tratados foram passados ​​em série

in vivo

e

in vitro

(Figura 4H mostra tipo I holoclone colágeno-aderente e esferóides flutuantes induzidos durante passagens em série do ppt2 não tratada ratos células tumorais de xenotransplante).

Combinação de SBT-1214 com CMC2.24 aumenta sua citotóxica CSC-alvo e haste atividades de modulação de células

Para estudar as interações potenciais entre SBT-1214 e Ptx com um romance curcuminóides sintético, CMC2.24, a eficácia de várias concentrações de fármaco e a sua combinação com CMC2.24 foi avaliada nas fracções de iniciação do tumor de linhas de células e ppt2 PC3MM2. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT e análise de FACS. Verificou-se que o CMC2.24 (bem como a curcumina, não mostrado), muitas vezes exercido efeitos bifásicos sobre próstata CD133

+ células. Assim, o tratamento com concentrações baixas de CMC (até 10 uM) durante 72 h estimulou a proliferação de células, enquanto que doses mais elevadas (10-40μM) foram cada vez mais citotóxico (Figura 5A, B). A análise FACS revelou que, em contraste com o SBT-1214 e Ptx, CMC2.24 não induziu um aumento nos índices de células com expressão máxima de CD133 (Figura 5C; preto área pontilhada), mas levou a uma mudança significativa da totalidade da célula população para a diferenciação (C; área com um asterisco vermelho) e algum aumento em células com expressão mais alta do pan-queratina (C; vermelho área pontilhada). Estes dados indicam que a baixas concentrações de CMC2.24 aumentar a proliferação das células progenitoras não estaminais em vez de CCC. Importante, a combinação de 30 uM CMC2.24 (que não é mesmo doses muito mais altas tóxicos [29]) com baixas concentrações de SBT-1214 ou Ptx (10 nM-1? M) exercido mais profunda morte do CD133

+ que células cada composto como agente único (Figura 5D, E). Após a acumulação de pós-tratamento temporário das grandes células multinucleadas, eles perderam a capacidade de induzir flutuante esferóides 3D e sofreu morte celular profunda semelhante às células tratadas com SBT-1214 apresentada na Figura 3.

(A, B ) O CMC2.24 como um agente único induziu efeitos bifásicos sobre a proliferação de células de cancro da próstata: concentrações mais baixas de promoveu a proliferação, enquanto que os maiores foram citotóxicas. (C) Em contraste com o SBT-1214, o tratamento com CMC2.24 não induziram um aumento na proporção de CD133

+ (células áreas pontilhadas pretas), mas de forma semelhante a SBT-1214, o aumento da expressão do marcador de diferenciação pan -keratin (áreas pontilhadas vermelho) e mudou toda a população de células para a diferenciação (áreas com asteriscos). Uma combinação dos dois agentes de morte celular induzida por mais significativa das células PC3MM2 (E) CD133

+ ppt2 (D) e em comparação com cada composto como um único agente. Os dados foram obtidos com o ensaio padrão de MMT (A, B, D, E). Os valores são os meios ± SD dos três experimentos independentes com 4 repetições para cada concentração da droga.

alterações induzidas pelo SBT-1214 no perfil de expressão de genes relacionados com a stemness

Em nossa estudos anteriores, utilizando todo o genoma e específico da via expressão do gene de perfis, verificou-se que as populações de células tumorigénicas isolados a partir das linhas de células da próstata e cancro do cólon estabelecidas expressaram níveis regulados positivamente dos genes anti-apoptóticos, transportadores ABC e a maioria da haste relacionadas com genes de células [25,30,31]. Nosso estudo proteômica realizado em colaboração com a Harvard Proteomics Resource na CSC-enriquecido contra células PC3MM2 diferenciadas reveladas 198 proteínas diferencialmente expressos de 600 queridos analisados ​​(dados não publicados). Entre eles estavam muitas proteínas envolvidas na função de células-tronco, motilidade celular, invasão, metástase e mau prognóstico, incluindo vimentina, nestin, S100, proteínas de choque térmico HS90A e HS90B, moesin, galectina e muitos outros. Para determinar possíveis alterações induzidas pela droga na expressão gênica stemness, analisamos CD133

+ ppt2 células antes e após o tratamento com o /CMC 2,24 combinação SBT-1214. Utilizando ensaio de PCR array (PAHS 501; SA

Biociências

) com critérios de filtragem de uma mudança 1.5- ou greater- vezes na expressão, descobrimos que cerca de 50% dos fatores de transcrição relacionados com células-tronco 84 analisadas ( TFS) foram upregulated em CD133

+ contra células RPC diferenciados (Figura 6A). Entre eles estavam CDX2, Dlx2, DNMT3B, EGR, FOXP3, Gli2, família HOX TFs, IRX4, junho, KLF2, NFATc1, NR2F2, PCNA, PITX3, POU4F1, SIX2, SOX2, SOX9, TERT, WT1 e outros. Um único tratamento com SB-1214 (1 uM) e CMC2.24 (10 uM) durante 24 horas induzida significativa a sub-regulação destes genes sobre-expressos (Figura 6B). A análise por Western blot demonstrou que SBT-1214 e CMC2.24 como agentes únicos induzida moderada diminuição da regulação da proteína c-Myc e Sox2 em extractos nucleares de tanto CD133

+ e células ppt2 a granel, enquanto que a administração de combinações de medicamentos levou a praticamente completa inibição da sua expressão (Figura 6C). Importante, frações nucleares de ambos CD133

+ e as células ppt2 granel não expressaram os dois supressores tumorais /reguladores de apoptose, p53 e p21 (Figura 7A), que parcialmente pode explicar a sua extrema resistência a drogas anti-câncer. Ambos SBT-1214 e CMC2.24, e de expressão, especialmente sua combinação induzida de p21 e p53. Tal “gene wake-up” induzida pelo pré-tratamento com a combinação de drogas (SB-1214; 1