Abstract
Em células tumorais, a desregulamentação oncogênico gradual de cascatas de sinalização induz alterações da morfologia celular e promove a aquisição de características malignas . Aqui, identificamos um conjunto de 21 genes, incluindo
FGF9
, como determinantes da morfologia das células do tumor por uma tela fenotípica interferência de RNA em células cancerígenas do cólon SW480. Usando um painel de pequenos inibidores moleculares, que posteriormente estabeleceu efeitos fenotípicos, cascatas de sinalização a jusante, e associados assinaturas dos sinais de receptores FGF de expressão gênica. Verificou-se que a inibição de sinais de FGF induz adesão celular epitelial e perda de motilidade em células cancerígenas do cólon. Estes efeitos são mediados através das cascatas de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e Rho GTPase. De acordo com estes resultados, a inibição da MEK1 /2 ou JNK cascatas, mas não do eixo de sinalização PI3K-AKT também induziu morfologia das células epiteliais. Finalmente, encontramos que a expressão de
FGF9
era forte em um subgrupo de cancros do cólon avançado e superexpressão negativamente correlacionada com a sobrevida dos pacientes. Nossa funcional e expressão análises sugerem que o FGF sinais de receptores pode contribuir para a progressão do cancro do cólon
Citation:. Leushacke M, Spörle R, Bernemann C, Brouwer-Lehmitz A, Fritzmann J, Theis M, et al. (2011) Um RNA Interferência fenotípica tela identifica uma função para sinais FGF em Colon Cancer progressão. PLoS ONE 6 (8): e23381. doi: 10.1371 /journal.pone.0023381
editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |
Recebido: 25 de fevereiro de 2011; Aceito: 15 de julho de 2011; Publicação: 11 de agosto de 2011
Direitos de autor: © 2011 Leushacke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Peças de o trabalho foi financiado pelo Bundesministerium für Bildung alemã und Forschung (conceder NGFN2 01GR0405 a BGH, e concede PKT-01GS08111-5 e PKM-01GS08105-8 a BGH e MM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
etapas tardias de progressão tumoral pode resultar em. disseminação metastática de células tumorais, que perderam as características epiteliais e capacidades adquiridas migratórias e invasivos. Morfologicamente, este interruptor fenotípica assemelha-se a conversão de células epiteliais estacionários nas células mesenquimais migratórias durante o desenvolvimento embrionário, e, portanto, todos estes processos são frequentemente denominado epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) [1], [2], [3], [4], [5]. As principais etapas da EMT e de desenvolvimento associados a tumores são a perda de adesão celular à base de E-caderina (por silenciamento epigenético ou repressão da transcrição da
CDH1
, que codifica para a E-caderina), reorganização do citoesqueleto levando a célula alterada morfologia, e indução da expressão do gene específico do mesenquimais, tais como ativação de
FN1
e
VIM
[6], [7], [8], [9], [10], [11]. No embrião, EMT ocorre de uma maneira ordenada e altamente reprodutível. Em células tumorais, no entanto, fenómenos EMT-like pode ser temporária, caótica e incompleta.
No embrião, EMT é induzida por activação coordenada de vias de sinalização, enquanto que em células de tumor EMT completa ou parcial pode ser provocada pela as actividades combinadas de mutações oncogénicas e sinais recebidos do factor de crescimento a partir de dentro do microambiente de células tumorais. Ainda, os papéis dos principais vias de sinalização e as moléculas parecem ser conservados. Por exemplo, β-catenina é necessário para o primeiro EMT embrionário, conduzindo à formação da linha primitiva e mesoderme [12], enquanto que no carcinoma do cólon e outros tumores β-catenina transduz sinais chave na frente invasiva, levando à perda de células de tumor a adesão, a indução da motilidade celular e metástase [13], [14], [15]. Várias tirosina-quinases receptoras (RTK) foram implicados em ambos, EMT desenvolvimento e associado a um tumor. No desenvolvimento embrionário, a /hepatócito receptor do factor de crescimento factor de dispersão MET é essencial para a migração de células progenitoras de músculo, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF) é necessária para a morfogénese epitelial [16], [17], [18], e o fibroblasto factor de crescimento (FGF) do receptor FGFR1 e o seu ligando Fgf8 são essenciais para a migração de células através da primitiva raia e mesoderme formação [19], [20]. Em tumores, não fisiológicas de sinalização através de RTKs, tais como MET, o receptor de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e o EGF e receptores de FGF pode ser associada com a progressão e metástase [21], [22]. Importante, a EGF e receptores de VEGF são alvos para a terapia racional de cancro do cólon avançado [23].
(MAPK) vias de proteína-quinase
Mitogen-activado, tal como a jun-N-terminal-quinase (JNK) e os ativada por mitógeno proteína quinase quinase /quinase extracelular regulada (MEK /ERK) vias, integrar sinais de múltiplas RTKs para controlar a proliferação celular, motilidade celular e outras características celulares [24]. mutações oncogênicas em genes que codificam para transdutores de sinais que transmitem os sinais de RTKs a MAPK vias, tais como
KRAS ou
BRAF
pode sensibilizar sinalização através da via MEK /ERK em tumores, e tais mutações invalidar terapêutica estratégias de intervenção nos receptores RTK a montante [25]. Ambos, durante o desenvolvimento e em tumores, os sinais de EMT são frequentemente integrada por repressores de transcrição de
CDH1
, como Caracol, Snail2, torção e outros, que desempenham, assim, um papel importante no controle da morfologia celular e tumor progressão [ ,,,0],9], [10], [26].
Aqui, nós tiramos proveito da semelhança molecular entre EMT e de desenvolvimento associados a tumores para identificar novos genes candidatos envolvidos na progressão do cancro do cólon. Em uma tela de interferência de RNA foram identificados vários genes cuja inactivação promoveu um fenótipo epitelial e adesão celular E-caderina-mediada em células cancerígenas do cólon SW480. Muitos dos genes código identificados para componentes de vias de sinalização chave, tais como as vias de Wnt, Hedgehog e RTK, por exemplo
FGF9
,
PTCH1
,
Gli2
,
Gli3
e
TCF7L1
. Usando a identificação de
FGF9
como uma vantagem, verificou-se que os sinais de FGFR desempenham um papel na perda da adesão celular do cancro do cólon e a indução da motilidade celular. Para mediar estes efeitos, os sinais de FGFR modular a /cascata ERK MEK e GTPases Rho. Os nossos resultados identificam, assim, sinais de FGFR como principais determinantes da actividade cascata MEK /ERK em células cancerígenas do cólon SW480, mesmo na presença de uma mutação oncogénica KRAS. Descobrimos que
FGF9
foi expresso em níveis de câncer de cólon e de expressão correlacionam com a sobrevivência do paciente, sugerindo um papel funcional no cancro.
Resultados
Uma tela de interferência fenotípica RNAi para genes que regulam a progressão do tumor de cólon
crescimento invasivo e metástases de tumores envolve a perda de adesão celular epitelial e do ganho de motilidade celular. Nós fundamentado que os genes cujos produtos desempenham um papel na progressão tumoral pode ser enriquecido entre aqueles expressos na extremidade caudal do embrião de rato com metade da gestação, um lugar onde as células epiteliais sofrer EMT de desenvolvimento, isto é, um interruptor fenotípica para um estado mesenquimais de baixa adesão celular e motilidade celular elevada. Nós, portanto, utilizado o banco de dados MAMEP (https://mamep.molgen.mpg.de) e pesquisas bibliográficas para compilar uma lista de genes expressos preferencialmente na extremidade caudal do embrião meados de gestação (E9.5), e identificou sua humana homólogos. Em seguida, nós alvo destes genes utilizando esiRNAs [27] em células cancerígenas do cólon humano SW480, que exibem um mesenquimais ( “spindle-forma”) morfologia, são móveis e têm pouca adesão celular. Foram triados para genes cuja inactivação promovido epitelial ( “Cobblestone”) a morfologia celular e a localização da molécula de adesão de células epiteliais de E-caderina para contactos célula-célula (Fig. 1a). Fora dos 364 genes selecionados, silenciamento de 18 candidatos morfologia epitelial induzida comparável à interferência com a referência
BCL9L
, que é um co-activador transcricional de β-catenina [28]. Também encontramos três genes cuja inactivação promoveu uma morfologia celular mais em forma de fuso. Em contraste, as células transfectadas de controle não mostrou alterações morfológicas consistentes (Fig 1B;. Para a eficácia interferência, ver Fig S1;. Para obter uma lista completa de genes e positivos alvo, consulte a Tabela S1 e Tabela 1, respectivamente)
.
Um esquema do ecrã: genes foram selecionados por triagem no banco de dados MAMEP (https://mamep.molgen.mpg.de) para genes que exibem caudal restritas expressão no embrião do rato e literatura pesquisas. imagens exemplo de padrões de expressão destes genes são exibidas na parte superior do fluxograma. homólogos humanos foram inactivados por interferência de RNA em células SW480. genes positivos foram identificados pela sua capacidade para promover a morfologia das células epiteliais. distribuição B E-caderina e morfologia das células SW480 transfectadas com esiRNA contra a luciferase de pirilampo (
Fluc
, controle negativo),
BCL9L
(controle positivo) e vários genes positivos. Genes marcados com (*) induziu uma morfologia mais em forma de fuso. As barras de escala representam 50 mm. Para uma lista completa de genes alvo na tela, consulte a Tabela S1. Para uma lista completa dos genes que uma reacção positiva, ver Tabela 1.
Muitos dos genes identificados desempenham papéis conhecidos no controlo de vias de sinalização que regulam o desenvolvimento embrionário, a homeostase de órgãos, e de tumores progressão. Encontrámos
TCF7L1
, componentes que codifica para um factor de transcrição a jusante da via Wnt /β-catenina em cascata [29] de sinalização, bem como a via Wnt /β-catenina sinalização
SFRP1
e
CSNK2A1
. Nós também isolado
PTCH1
,
Gli2
, e
Gli3
, que codificam para os componentes da via de sinalização Hedgehog [30]. Encontramos
FGF9
e
EPHA4
, de codificação para um ligando RTK e RTK da adesão celular ephrin da subfamília regulação e do citoesqueleto via MAPK e Rho [31], [32]. O gene candidato
TAX1BP3
também podem ter papéis na regulação dos sinais de Rho [33]. Entre vários genes implicados na regulação da transcrição, achamos
SIX1
, que codifica para um factor de transcrição homeobox implicados na diferenciação celular e na progressão tumoral [34], [35] (Fig. 2).
símbolos gene positivos são dadas em letras pretas, componentes da via-chave associadas são dadas em letras cinzentas, exibido em círculos coloridos e ordenados por compartimento celular. Azul: via Wnt, Verde: Hedgehog percurso, Ciano: caminhos RTK. Genes foram designados para caminhos que usam a literatura, a ontologia Gene e outras pesquisas de banco de dados. referências chave são dadas no texto principal.
sinais FGF regular a adesão e motilidade das células cancerígenas do cólon
Uma vez que nós identificamos
FGF9
em nossa tela de celular e encontrada expressão de FGF9 em malignidades intestinais de mouse e seres humanos (veja abaixo), que incidiu sobre os papéis dos sinais FGF em células de carcinoma de cólon. Primeiro, confirmou o resultado de triagem usando um independente
FGF9
preparação siRNA, que também induziu um fenótipo epitelial em SW480, i. e. conduziu a uma perda de células de formato de fuso e a um aumento na membraneous E-caderina coloração (Fig. S2). Em outra linha de células de cancro do cólon, HCT116, silenciamento de
FGF9
não teve efeito aparente. No entanto, quando alvejado
FGFR3, que codifica para um receptor de alta afinidade da FGF9 e outros FGFs, descobrimos que promoveu a morfologia das células epiteliais em HCT116 (Fig. S2). Estas descobertas indicam que os sinais do receptor de FGF podem geralmente têm um papel no controlo da morfologia das células do cancro do cólon, e que os componentes da via diferentes podem ser limitativo nas várias linhas celulares.
Em seguida, os receptores de FGF-alvo usando o pequeno SU5402 inibidor da molécula [36], e as alterações estimadas no fenótipo celular. De acordo com nossos dados de interferência RNA, a inibição dos receptores FGF promovido morfologia epitelial de células SW480 e ordenou E-caderina e β-catenina aos contatos célula-célula, indicando
montagem
de-novo de junções aderentes epiteliais (Fig . 3A). Efeitos semelhantes foram observados sobre a morfologia de células SW620, que são derivados a partir do mesmo paciente, e em células HT29 e HCT116, que são derivados de outros pacientes (Fig. S3).
Um comutador fenotípica de células SW480 após inibição do receptor de FGF por SU5402. De cima para baixo: morfologia celular em campo claro, imunocoramento E-caderina e β-catenina. Fotos foram tiradas 72 horas após o início do tratamento SU5402. Abaixo: SW480 células recebem sinais de FGF, que podem ser bloqueados por SU5402. B arranhões ferida ensaio de motilidade após a inibição do receptor FGF. células SW480 foram cultivadas até à confluência, e arranhões foram induzidos 24 horas após o início do tratamento. imagens de campo claro da borda zero foram tiradas 24, 48 e 72 horas depois de coçar. As barras de escala em A e B representam 50 um. C, D A imunocoloração da borda zero. C coloração do citoesqueleto de actina e a microtúbulos no controlo e as células tratadas com SU5402. Verde: actina (faloidina); amarelo: tubulina; azul: núcleos (DAPI); setas: áreas de adesão focal densa nas células de controle motilidade; setas: coloração melhorada actina cortical em células tratadas com SU5402. D redistribuição de RhoA em células migratórias, a qual é reduzida nas células tratadas com inibidores. Verde: actina; vermelho: RhoA; azul: núcleos. setas cinzentas marcar RhoA nuclear. A linha a tracejado marca borda zero. Barras de escala em C e D representam 25 um. E A quantificação da proliferação em controlo e as células tratadas com SU5402. Por tempo de curso da proliferação, as células foram plaqueadas em replicados, e as amostras em duplicado foram contadas bi-diária em uma hematocytometer Neubauer.
A adesão celular e a motilidade celular são frequentemente inversamente correlacionada em células tumorais. Estamos, portanto, também avaliou a motilidade celular. As células de controlo SW480 migraram rapidamente, enquanto SU5402 tratados com células não podia mais fechar uma ferida zero (Fig. 3B). células inibidas-receptor de FGF na borda zero mostraram aumento da coloração de actina cortical e a redução do número de contactos de adesão focal, indicando dinâmica alteradas do citoesqueleto (Fig. 3C). Além disso, as GTPases Rho, que são efectores principais do equilíbrio entre a adesão celular e motilidade [37], apareceu localizada a salpicos nucleares em células SW480 que invadem o zero, e foram reduzidos em SW480 células tratadas com inibidor (Fig. 3D). A proliferação celular foi apenas ligeiramente afectada por inibição do receptor de FGF (Fig. 3E). Vimos efeitos semelhantes sobre a morfologia celular e a motilidade utilizando um inibidor de molécula pequena não relacionados estruturalmente dos receptores de FGF, PD173074 (dados não mostrados). Estes resultados indicam que os sinais do receptor de FGF podem desempenhar papéis essenciais na passagem de um fixo para um fenótipo migratório, que é uma característica dos passos tardios da progressão do tumor intestinal, resultando na metástase.
sinais de FGF em células cancerígenas do cólon são transmitidos através da via de MAPK e Rho
os sinais do receptor de FGF são conhecidos para serem transmitidos através de cascatas de MAPK e através do phosphoinositid-3-quinase (PI3K) /AKT cascata [38] sinalização. Por isso, analisaram a actividade de transdutores chave de sinal celular após a inibição de receptores de FGF ou chave de transdutores de sinal a jusante, ou seja, U0126, inibindo as MEK1 /2 quinases da clássica cascata MEK /ERK MAPK, SP600125, um inibidor da cascata de JNK alternativa e LY294002 , um inibidor da transdução de sinal de PI3K. Como esperado, a inibição de MEK1 /2 aboliu a fosforilação de ERK1 /2, e a inibição da PI3K aboliu fosforilação de AKT. Após a inibição do receptor FGF, encontramos uma redução limitada, mas reprodutível de ERK1 2 fosforilação /(de cerca de 30%). Em contraste, a actividade de p85-PI3K não foi afectada. Alterações na fosforilação de AKT indicaram que as redes de transdução de sinal adicionais são modulados, directa ou indirectamente, quando inibir os receptores de FGF ou de JNK (Fig. 4A, B).
Uma análise de fosfo-ERK1 /2, fosfo-P85PI3K e a fosfo-AKT em células SW480 após o tratamento com DMSO (controlo de solvente), SU5402 (inibindo FGFR), U0126 (inibição de MEK1 /2 dependente de ERK1 /2 fosforilação), SP600125 (inibição de JNK), e LY294002 (inibição da fosforilação de AKT mediada por PI3K) são mostrados. Histona H3 é mostrado como controlo de carga. estado de fosforilação foi avaliado 40 minutos após o tratamento inibidor. B Quantificação de ERK1 fosforilação 2 /, média de três experiências. Morfologia C, imunofluorescência E-caderina e a motilidade celular de células SW480 após 72 h de tratamento com inibidor. A inibição da MAPK clássica ou cascatas alternativas MAPK /JNK induzida um fenótipo semelhante à inibição FGFR em células SW480, wheras inibição da PI3K ou AKT não teve tal efeito. Descobrimos que a inibio de PI3K, mas não a inibição de AKT, inibe a motilidade celular. Desacoplamento de sinais de PI3K e AKT foi observada antes nos tumores [56]. ensaio zero foi feito, como na Fig. 3B. As barras de escala representam 50 mm. D inibição dos receptores FGF ou MEK1 /2 leva a atividade Rho reduzida. Os ensaios de carga de Rho GTPase foram realizados em células SW480 5 min após a estimulação com soro na presença ou ausência de SU5402 ou UO126. N.D. .: não determinado.
Estamos próximos testaram os efeitos fenotípicos de inibição das cascatas a jusante. O tratamento de células SW480 com U0126 (inibição de MEK1 /2) ou com SP600125 (inibição de JNK) confirmou a formação de complexos de adesão de células epiteliais, e bloqueou a motilidade celular, semelhante aos efeitos observados após uma inibição de sinais de receptor de FGF (Fig. 4C, a FIG. S4). Em contraste, fenótipos observados após o tratamento com LY294002 (PI3K inibindo) ou a Calbiochem-AKT Inibidor não eram comparáveis com os efeitos observados após a inibição do receptor de FGF (Fig. 4C). Foi observada uma correlação similar de fenótipos celulares mediante a inibição de centros de sinalização em células HCT116, que no entanto não mostrar modulação da localização E-caderina sob quaisquer condições (Fig. S5, ver também Fig. S2). Em resumo, estes resultados indicam que os sinais de FGFR modular a actividade da MEK /ERK cascata em células SW480 de sinalização, e que a actividade de FGFR, MEK1 /2 e JNK são necessários para a manutenção de um fenótipo que favorece a motilidade celular sobre a adesão celular.
Uma vez que observamos re-localização de Rho em células SW480 motilidade (ver acima, Fig. 3D), determinou-se o impacto do FGFR ou MEK1 /2 sinais sobre a atividade de Rho, usando ensaios de carga Rho. Para isso, foram privadas de soro SW480 células durante 24 h, e avaliou a ativação Rho após re-estimulação com soro. A adição de soro levou a indução rápida de Rho-GTP activo em células de controlo, enquanto que a activação de Rho foi comprometida na presença do receptor de FGF ou MEK1 /2 (inibidores da Fig. 4D). Este resultado sugere que, em SW480 receptores de células FGF e MEK1 /2 papéis desempenhar na regulação de GTPases Rho, que são centrais na modulação do citoesqueleto.
sinais FGFR e MAPK estão associados com assinaturas de expressão de genes específicos
para isolar assinaturas de expressão de genes relacionados com sinais de FGFR e motilidade celular em células cancerígenas do cólon, foram comparados os perfis de expressão gênica de controlo do solvente e inibidor tratados SW480 células. Nós usado pela primeira vez agrupamento funcional de genes desregulados entre o controle (tratados com DMSO) e células tratadas com SU5402 usando análise Ingenuity via (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Entre as redes de sinalização mais fortemente afetados, identificamos um conjunto de genes desregulados relacionadas com a motilidade celular que gira em torno da via MAPK ERK1 /2-dependente, corroborando os nossos resultados anteriores (Fig. S6). A rede inferida contém transdutores de sinais centrais de sinais de motilidade, tais como
ERK1
/2 e
pTK2
(quinase de adesão focal), e converge sobre os fatores de transcrição
junho
/
JUNB
e
FOSL1
. Importante ainda,
FOSL1
foi previamente identificado como um factor de transcrição chave no controlo da motilidade de células tumorais [39].
Em seguida, compararam-tratados por PI3K inibidor tratadas com DMSO e células SW480 (exibindo mesenquimais morfologia “em forma de fuso” e adesão celular fraca) com células tratadas FGFR-inhibitor-, MEK1 /2-inibidor e JNK-inibidor (exibindo epitelial morfologia “calçada” e adesão celular forte, ver também Fig. 4C). Nós usamos mapas de auto-organização para identificar grupos de genes cuja expressão está associada a estas morfologias distintas, e identificaram 29 genes que foram associados com a adesão celular forte e 23 genes associados com a adesão celular fraco. genes assinatura de células SW480 que têm forte adesão celular foram
RAP1GAP
, que está envolvida na montagem de junções aderentes e
CLDN1
, um componente de junções aderentes, fornecendo evidências de que a adesão de células epiteliais é regulada, pelo menos em parte, no nível transcripcional. Encontramos também uma maior expressão da transcrição de genes do fator
ELF3
e
HMGCS2
, que desempenham papéis funcionais na diferenciação epitelial [40], [41], os supressores de tumor
SYK
e
TFAP2C
eo regulador Rho
ARHGEF37
. genes assinatura de células SW480 que têm fraca morfologia adesão celular e mesenquimais foram enriquecidas para genes que foram atribuídos actividade oncogénica, ou seja,
EDN1
,
IGFBP7
,
MCM5
,
MFI2
e
TNFAIP8
. Finalmente, também encontramos
TAX1BP3
, que acima isolado em nossa tela fenotípica esiRNA, sugerindo um papel funcional para este gene na regulação da adesão e motilidade (Fig. 5A) [33]. Observamos um padrão similar de regulação gênica em cima inibição do receptor FGF em células de cancro do cólon HCT116 (que exibiu perda de forma do eixo sobre
FGFR3
RNA de interferência ou inibição do receptor FGF, ver Fig. S2, S3), implicando uma conservada papel deste grupo de genes de jusante dos receptores de FGF (Fig. S7).
a-B análise Microarray de SW480 após a inibição molecular pequeno de FGFR, MEK1 /2, JNK ou PI3K. expressão média de experiências em triplicado é exibida. Vermelho: alta expressão; Azul: baixa expressão Branco: Expressão Median em todos os perfis de Grey: Genes sem ou expressão marginal A Clusters de genes cuja atividade se correlaciona com epiteliais e mesenquimais fenótipos. O procedimento seguinte foi utilizado para identificar esses genes: Em primeiro lugar, os genes desregulada mais de 1.3fold (p 0,01) depois do tratamento SU5402 comparação com o controlo (DMSO) foram isoladas. Em segundo lugar, esses genes foram agrupados em mapas de auto-organização, e três grupos que se correlacionaram com o fenótipo foram selecionados. Genes foram encomendados pela expressão fold-change após a inibição FGFR. Avaliação B dos principais genes implicados na EMT ou stemness. análise de PCR de C quantitativa em tempo real
SNAI2
e
CDH1
após o tratamento SU5402 (FGFR Inhibitor). Expressão foi normalizado ao solvente amostras de controlo.
Quando avaliamos a expressão de moduladores chave da EMT, vimos um pequeno, embora não significativa, a variação na expressão de
CDH1
, indicando que as mudanças mais drásticas que vemos em E-caderina localização (Fig. 1B, 3A) ocorrem predominantemente através da regulação pós-transcricional. Expressão de
VIM
e
TWIST
foram apenas fracamente afetada, enquanto outros marcadores EMT foram encontrados para ser não-expresso. Estes dados sugerem que as células SW480 não sofrem uma transição completa mesenquimais-a-epitelial após o receptor de FGF ou inibição MAPK. Nós também não ver regulação dos marcadores de células tronco intestinais, que foram recentemente ligados a EMT em tumores (Fig. 5B) [42], [43], [44]. Regulamento do repressor da transcrição
SNAI2
e seu gene alvo
CDH1
via 2 sinais /ERK1 foi demonstrado antes em células SW480 [45]. Por isso, avaliamos a expressão de
SNAI2
e
CDH1
por qRT-PCR, que pode ser mais sensível do que a análise de matriz. Pudemos confirmar a ativação leve de
CDH1
após o tratamento SU5402, enquanto
SNAI2
manteve-se inalterada (Fig. 5C).
expressão FGF9 está correlacionada com a sobrevivência do paciente no cólon humano cancer
Para avaliar a
in-vivo
significado das nossas análises, determinou-se a expressão de
FGF9
no espécime de mouse e tumores intestinais humanas. No rato adenoma intestinal, encontramos a expressão aumentada de
FGF9
em um padrão similar ao gene alvo Wnt
Axin2
. Quando determinada expressão de
FGF9
no câncer de cólon humano, nós igualmente encontrou expressão generalizada no epitélio do tumor em tumores primários e metástases pulmonares (Fig. 6). Desde a nossa tela, em conjunto com a nossa análise funcional subsequente de sinais gerais FGF, indicou um possível papel para sinais FGF9 em carcinoma intestinal, foram examinados os níveis de
expressão relativa FGF9
em um conjunto de 95 perfis de expressão humana cancro do cólon, compreendendo cólon normal (4 perfis), carcinoma do cólon avançado (encenado T3 /4 por () critérios UICC União Internacional Contra o câncer; 41 perfis), e metástases para linfonodos, fígado e pulmão (50 perfis) [46]. Encontrámos níveis de expressão basal
FGF9
nos perfis de tecido de cólon normais e na maioria dos perfis de tumor, mas a expressão elevada de
FGF9
num subgrupo de tumores do cólon e 7 5 metástases (Fig . 7A; cut-off 2 vezes em comparação com o tecido normal). De notar, também encontramos a expressão aumentada de
FGFR3
, que codifica para um receptor FGF9 de alta afinidade, em 3 perfis de tumores primários e várias metástases (Fig. 7A). A elevada expressão de
FGF9
foi mantida entre pares de tumores primários e metástases derivadas de três pacientes, indicando que
FGF9
activação no tumor pode persistir durante longos períodos de tempo.
a expressão do gene alvo Wnt
Axin2 /AXIN2
(à esquerda) e
FGF9
/
FGF9
(à direita) em ratos e humanos malignidades intestinais foi determinada pelo RNA
in-situ
hibridização. painéis superiores: adenoma do cólon de um APC
min mouse. painéis Média: carcinoma do cólon humano primário. painel inferior: metástases pulmonares de carcinoma do cólon humano. hibridização de controlo negativo (usando uma sonda não relacionada asRNA de tamanho semelhante e teor de GC, não mostrado) não produzir um sinal. barras de escala representam 500 mm.
A expressão de
FGF9
ou
FGFR3
no carcinoma do cólon invasivo e metastático, como avaliado por análise de microarray (n = 95) . Expressão em cada amostra é indicada pelo círculo, expressão mediano de cada grupo é dada pela barra vermelha. Os números em
FGF9
gráfico indicam pares de tumor /metástase primários derivados de um mesmo paciente. B Kaplan-Meier análise de sobrevivência de pacientes examinados num (tumores primários com apenas dados de acompanhamento, n = 39). Os pacientes foram agrupados de acordo com elevada ( 2 vezes da média, indicado pelo círculo verde na figura 7A.) E baixa
FGF9
e
FGFR3
expressão
Nós finalmente correlacionada a expressão de
FGF9
em tumores primários (n = 39) com a sobrevida do paciente, usando análise de Kaplan-Meier. O subgrupo de 7 pacientes com alta expressão de
FGF9
tiveram sobrevivência significativamente menor em comparação com pacientes com baixa
FGF9
expressão (Fig. 7B,
p
= 0,008). Vimos um resultado semelhante, quando foram incluídos os pacientes com alta expressão de
FGFR3
no grupo (Fig. 7B,
p
= 0,006). A correlação observada entre alta expressão de
FGF9 Comprar e sobrevida do paciente curto pode indicar papéis funcionais de FGF9 na progressão tumoral.
Discussão
Aqui, realizamos uma tela focado para identificar genes cuja expressão é necessária para manter uma mesenquimal, potencialmente fenótipo metastático em células de cancro do cólon SW480 e isolados múltiplos candidatos. Muitos destes genes podem ser ligadas a grandes vias de sinalização ou têm sido implicados na progressão do tumor EMT e antes. Nós encontramos o gene fator de transcrição HMG-box
TCF7L1
(também conhecido como
TCF3
), que podem transmitir sinais de Wnt /β-catenina [29]. Curiosamente, o factor de transcrição TCF7L2 relacionada (também conhecida como TCF4) é necessária para transmitir o sinal de Wnt /β-catenina e para manter o compartimento de células estaminais no intestino [47], [48]. O membro da família
TCF7L1
é, no entanto, também expressa na cripta cólon e no cancro do cólon (Fig. S8). Nossos resultados, portanto, indicam que
TCF7L1
pode ter um papel ainda não identificado na transmissão de sinais de β-catenina relacionados ao tumor.
Também identificamos
PTCH
,
Gli2
e
Gli3
, que codificam para os componentes da via de sinalização Hedgehog. Possíveis papéis de sinais Hedgehog na progressão do cancro do cólon e metástase são controversos [49], [50]. Os resultados de nosso apoio tela de um papel de sinais Hedgehog na modulação da adesão celular em células de câncer de cólon.
Inesperadamente, a tela produziu também três genes cuja inactivação promovido uma forma-spindle fenótipo mais. Dois destes,
BICC1
e
complexos de adesão celular MAGI1
foram mostrados antes de ser necessário para a montagem de E-caderina mediadas [51], [52]. A descoberta de papéis funcionais destes genes na manutenção de contactos célula-célula em células tumorais residuais pode indicar um papel mais universal para estes genes na regulação da adesão de células do que o previsto antes.
sinais FGF foram implicadas no controlo da motilidade intestinal e a progressão de células do cancro do cólon antes. Por exemplo, FGF1 e FGF2 foram mostrados para promover a migração de células epiteliais intestinais [53], e as isoformas específicas de FGFR3 pode mediar o crescimento e migração de células de cancro do cólon [54]. Em nossa tela, identificamos
FGF9
como um gene implicado na regulação da adesão celular do cancro do cólon. Usando pequenos inibidores moleculares e ensaios de transdutores de sinal principais de actividade, verificou-se que a cascata de MAPK e GTPases Rho são críticos na transmissão de sinais de FGF que controlam a adesão celular e a motilidade em células cancerígenas do cólon, ao passo que a cascata de PI3K não é. SW480 células cancerígenas do cólon conter um conjunto bem caracterizada de mutações, incluindo uma
KRAS
(G12V) mutação [55] activação. Nossos dados, portanto, implica que as mutações oncogênicas em KRAS fazer actividade MAPK não totalmente desacoplar a partir de estímulos a montante, mas em vez disso pode potenciar a transdução de sinal RTK. No paciente, a terapia de sucesso usando inibidores do receptor de VEGF e EGF depende fundamentalmente da ausência de KRAS jusante ou mutações BRAF [25].
Os modelos recentes de progressão do tumor implica uma ativação descontrolada de vias de sinalização de desenvolvimento e expressão do gene embrionário programas, resultando numa perda de adesão celular coordenado, o ganho da motilidade celular e a aquisição de características de células estaminais em células tumorais metastáticas [42], [43], [44]. Nossa tela identifica vários genes candidatos que podem desempenhar papéis nestes processos.