Abstract

maligno da pleura Efusões (MPE) pode ser útil como um modelo para estudar a progressão hierárquica de câncer e /ou heterogeneidade intratumoral . Para reforçar a base racional para desenvolver o modelo MPE para esses fins, partimos para encontrar evidência para a presença de células-tronco cancerosas (CSC) no MPE e demonstrar a capacidade de sustentar a heterogeneidade intratumoral em culturas MPE-primários. Nossos estudos mostram que

candidato

pulmonares CSC-expressão assinaturas (PTEN, Oct4, hTERT, Bmi1, EZH2 e SUZ12) são evidentes em pellets de células isoladas de MPE e MPE-citopatologia também rótulos

candidato

-CSC (CD44, cMET, MDR-1, ALDH) subpopulações. Além disso, em culturas primárias que usam EMA como a fonte de ambas as células de tumor e o microambiente tumoral (TME),

candidato

CSC são mantidas ao longo do tempo. Isto permite-nos viver-sort

candidato

CSC-frações do mix MPE-tumor com base em marcadores de superfície (CD44, c-MET, uPAR, MDR-1) ou diferenças no metabolismo de xenobióticos (ALDH) . Assim, culturas MPE-primárias fornecer uma avenida para extrair

candidato

populações CSC de indivíduo (isogênico) MPE-tumores. Isto irá permitir-nos testar se essas células podem ser discriminados em bioensaios funcionais. heterogeneidade do tumor em culturas de MPE-primárias é evidenciado por imunomarcação variável, diferenças na morfologia de colónias, e as diferenças em taxas de proliferação de subpopulações de células. Colectivamente, estes dados justificam o desenvolvimento contínuo do MPE-modelo para a investigação de heterogeneidade intratumoral, interações tumor-TME, e validação fenotípica de

candidato

pulmão CSC, além de fornecer orientação para o desenvolvimento pré-clínico de terapias racionais

Citation:. Basak SK, Veena MS, Oh S, Huang G, Srivatsan E, Huang M, et al. (2009) O maligno Derrame pleural como um modelo para investigação intratumoral Heterogeneidade no câncer pulmonar. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10.1371 /journal.pone.0005884

editor: Mauricio Rojas, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de dezembro de 2008; Aceite: 28 de abril de 2009; Publicação: 12 de junho de 2009

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Financiamento para o estudo fornecido pelos fundos de pesquisa Veterans Affairs Biomédicas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de câncer e mortalidade no mundo. A terapia atual é relativamente ineficaz, ea taxa de sobrevivência em 5 anos é de aproximadamente 15%. heterogeneidade intratumoral, possivelmente, está subjacente a resistência dos cancros do pulmão às terapias atuais; Assim, respondendo por heterogeneidade intratumoral pode ser uma chave importante para o desenvolvimento de estratégias de tratamento bem sucedidos para câncer de pulmão. Infelizmente, os modelos atuais de câncer de pulmão são limitadas no seu alcance para estudar a heterogeneidade do tumor. derrames pleurais malignos (MPE) oferecem uma oportunidade única para a cultura de uma ampla variedade de células cancerosas de um único indivíduo, a fim de delimitar e caracterizar a gama de heterogeneidade intratumoral encontrado em câncer de pulmão avançado.

A justificativa para a escolha o MPE, um estágio regionalmente avançado de câncer de pulmão que prenuncia um mau prognóstico, como um modelo para investigar a heterogeneidade intratumoral é duplo. Em primeiro lugar, um modelo de carcinogénese evolutiva prevê que estados de doença avançada têm maior probabilidade de descrever heterogeneidade [1]. Em segundo lugar, com base em observações pessoais feitas ao longo de vários anos de estudo MPE [2], [3], [4], [5], sabíamos que culturas primárias derivadas de MPE inicialmente exibido heterogeneidade cultura marcada em seu caminho para o estabelecimento de câncer morfologicamente homogêneo linhas de celular. No entanto, não tinha investigado anteriormente a base biológica ou temporal destas observações de forma prospectiva.

Não há formas estabelecidas para a cultura MPE com o objetivo de manter a heterogeneidade intratumoral. Assim, nos propusemos a desenvolver um modelo de cultura primária

de novo

. Este modelo incorpora o componente MPE-fluidos e células estromais extraídos em um microambiente do tumor (TME), que de perto simula o

in situ

meio. Os nossos dados indicam que a inclusão destes elementos parece preservar a heterogeneidade do tumor. Desde a heterogeneidade do tumor pode surgir devido a uma progressão hierárquica do epitélio transformado [6], [7], a hipótese de que incluído na mistura de células tumorais em MPE são células que podem funcionar como células-tronco cancerosas ou progenitoras. Este manuscrito fornece prova de conceito que

candidato

CSC pode ser fracionado a partir de MPE culturas primárias. Esta evidência justifica a continuação do desenvolvimento do modelo MPE para o exame de heterogeneidade intratumoral eo estudo da

candidato

CSC-fenótipos.

Materiais e Métodos

MPE isolamento, processamento e cultura

Todos os indivíduos foram submetidos a consentimento informado por escrito por um processo aprovado pelo conselho de revisão institucional na Assuntos-Greater Los Angeles Healthcare System veteranos (VAGLAHS). Todos os indivíduos eram veteranos e fumantes ativos ou antigos, e MPE-espécimes foram adquiridos por grandes toracocenteses volume. As amostras foram processadas tal como descrito na Figura 1. Resumidamente, após a centrifugação (200 x g, 20 minutos, temperatura ambiente), os sedimentos celulares foram ressuspensos num gradiente de densidade de Ficoll. O MPE-sobrenadante foi estéril filtrada e utilizada para a formulação do

p

rimary

c ultura

m

edium [PCM; DMEM-H (Hyclone, UT) + 30% v /v esterilizada por filtração componente MPE-fluido + penicilina-G /estreptomicina 1000 U /ml de anfotericina B e 0,25 ug /ml (Omega Scientific, CA)]. A selecção dos 30% v /v fracção do componente MPE-fluida foi derivada empiricamente. Como os componentes solúveis e /ou celulares principais que contribuem para a manutenção da heterogeneidade do tumor em culturas de MPE-primárias é (são) não é conhecido, e uma vez que existe variabilidade derrame-a-derrame nas concentrações de factores solúveis, a selecção de 30 % v /v de componente MPE-fluido foi baseada na observação de culturas primárias por microscopia de luz. Resumidamente, foi monitorada três diferentes EMA em culturas primárias contendo ou 100%, 70%, 50%, 30% e o componente fluido de MPE-10%. Nós avaliamos a integridade da cultura e da variabilidade por microscopia, e mediu as frações de células mortas flutuantes (por coloração com azul de tripano) em cada estado durante vários dias. Não houve diferenças aparentes qualitativas na integridade de cultura ou variabilidade, e não há diferenças quantitativas de flutuação células mortas entre os 70%, 50% e 30% v /v condições MPE-fluidos. Os 100% e 10% v /v MPE-condições tiveram um aumento na morte celular em dois de três efusões. Esta observação, combinada com a consideração prática esse componente MPE-fluido era

o

fator limitante para a duração da experimentação de culturas primárias, levou-nos a usar a 30% v /v MPE nos restantes casos.

MPE foi extraído a partir da cavidade pleural de doentes com cancro de pulmão. O MPE recolhido era

sedimentadas (200 × g) Comprar e

pellet celular

foi separada do fluido de MPE. O sedimento celular foi ressuspenso em meio essencial mínimo contendo MPE-fluido e mergulhado em uma

Ficoll gradiente

. A fração de células nucleadas, que foi em grande parte desprovida de eritrócitos na maioria dos casos, foi colhido da interpõem de gradiente de Ficoll e meio de suspensão, e processados ​​para coloração (

H E, IHC

),

análises moleculares Comprar e

principal cultura

. As culturas primárias são mantidos em pcm, e são ainda analisados ​​para

macia agar a formação de colónias

,

FACS análise

e

in vivo tumorigênese

.

para estabelecer culturas primárias, o sedimento de células nucleadas foi extraída a partir do gradiente de Ficoll, lavadas com DMEM-H, e depois aliquotas foram separados para armazenamento, análises moleculares iniciais e citopatologia, várias culturas primárias foram semeadas. Estes foram observados diretamente em uma base diária, e

pcm

foi substituído a cada 5-7 dias. análises de crescimento de culturas primárias cinéticos foram realizados em três amostras distintas de EMA. Para estas determinações, as culturas primárias foram semeadas em paralelo em placas de 48 poços (Corning Incorporated, NY), a uma densidade de 2 × 10

4 células /poço em 500 ul de meio de cultura. Para contar as células flutuantes em suspensão foram colhidas em primeiro lugar, após o que as populações aderentes foram suavemente lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e separado (tripsina-EDTA, Sigma MO). As células separadas foram então adicionados à suspensão de células inicial, e células totais vivas (exclusão de corante azul de tripano) foram contadas manualmente por hematocytometer em pontos de tempo designados. Tais estudos fundamentam os resultados relatados que as culturas MPE-primária cresceu a taxas de crescimento altamente variáveis ​​e lentas.

Os anticorpos

Os anticorpos seguintes foram utilizados para imuno-histoquímica (IHQ) e /ou citometria de fluxo (FACS ): anti-CD 44 (monoclonal de ratinho, Abcam # 16728 para IHC; ratinho anti-IgG2b de Humano CD44-FITC, BD Biosciences # 555478 ou PE-CD44 marcado de ratinho anti-humano, BD Pharmingen # 555479 para FACS), anti-uPAR (monoclonal de ratinho, Santa Cruz Biotechnology # SC-13522), anti-ALDH1A1 (coelho monoclonal, Abcam # 52492), anti-CD166 -FITC (monoclonal de ratinho; Abcam # 33403); primária não marcado anti-cMET (IgG2a de ratinho, Abcam # 49210), não marcado anti-MDR-1 (monoclonal de rato, Chemicon # Mab4338) primário, e anti-uPAR (Santa Cruz Biotech # 13522). Os anticorpos secundários utilizados para o estudo: cabra F (ab ‘) 2 anti-IgG de ratinho (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratórios # M35018) e de cabra anti-rato F (ab’) 2 de IgM (Jackson ImmunoResearch )

Citopatologia e imunomarcação

aglomerados celulares foram examinadas por microscopia de contraste de fase (Leica -. Leitz DMRBE) em lâminas de vidro cobertas, ou por microscopia de luz seguinte fixação e coloração. Para as últimas, células fixadas em etanol (Fischer Scientific, PA) ou Z-fix (Anatech, MI) foram sedimentadas para gerar um botão de células, que foi embebidas em parafina. Para IHC, secções (5 uM) foram desparafinizadas e reidratadas em xileno e etanol. recuperação de antígeno [ácido cítrico 10 mM (pH 6), 70 ° C, 30 minutos, duas vezes com água de lavagem intervindo) foi levada a cabo, após o que as lâminas foram arrefecidos até à temperatura ambiente e sequencialmente lavada com água desionizada e PBS. A actividade da peroxidase endógena foi extinta (PBS + 2% peróxido de hidrogénio), e os espécimes foram sequencialmente bloqueadas [1% de albumina de soro bovino /PBS, temperatura ambiente, 1 h, seguido de soro de murganho (Santa Cruz Biotechnology), durante 30 min, temperatura ambiente] . As secções de tecido foram então lavadas duas vezes com PBS, incubadas com o anticorpo secundário (conjugado com HRP de cabra anti-rato, de Santa Cruz Biotechnology, 30 min, temperatura ambiente), lavadas com PBS e expostas ao kit de substrato DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Os controlos negativos tipicamente utilizado o anticorpo secundário sozinho na ausência de marcação com o primário. As secções coradas foram observadas ao microscópio (Leica – Leitz DMRBE ou Olympus IX71) e as imagens captadas foram analisados ​​utilizando o software Openlab. As áreas de células coradas positivamente foram estimadas usando software Image Pro Plus. grupos de células foram definidos manualmente usando imagens de fase e a ferramenta AOI irregular e os grupos resultantes foram segmentados com base em um limiar de coloração positiva determinada empiricamente. Por cento das células marcadas positivamente foi estimado com base na área fracional de coloração dentro da área total cluster.

transcriptase reversa-PCR (RT-PCR)

RNA foi extraído do MPE primário e cultura isola utilizando o reagente Trizol e fast Track 2.0 kit de isolamento de mRNA (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). 500 ng do ARNm foi transcrito de forma reversa utilizando o estojo de RT (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) seguindo as recomendações do fabricante. Dois ul aliquota do ADNc sintetizado foi usado para PCR para a amplificação de genes PTEN, Oct4, Bmi1, hTERT, e SUZ12 EZH2. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:

PTEN

Adiante – 5 ‘GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3’, Reverse-5 ‘TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3’,

Oct4

Encaminhar 5’CAACTCCGATGGGGC CCT 3 ‘, reverso e -5 ‘CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3’

Bmi1

Atacante – 5 ‘AATCTAAGGAGGAGGTGA 3’, Reverse 5 ‘CAAACAAGAAGAGGTGGA 3’,

hTERT

Atacante -5 ‘GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3’, Reverse 5 ‘CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3’,

SUZ12

Atacante – 5 ‘GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3’, e Reverse 5 ‘- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA – 3’,

EZH2

Atacante 5 ‘TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3’, Reverse 5 ‘TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3’. Para

PTEN

amplificação, as condições foram as seguintes: desnaturação inicial a 94 ° C durante 4 minutos, seguido por 32 ciclos a 94 ° C minuto for1, 57,5 ​​° C durante 1 minuto, e 72 ° C durante três min. Uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, foi utilizado. As condições de amplificação para

Oct4

eram uma desnaturação inicial de 5 min a 95 ° C, seguido de 32 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 30 segundos com uma última extensão a 72 ° C durante 5 min. As condições de amplificação para

Bmi1

: desnaturação inicial a 94 ° C durante 4 minutos seguido de 32 ciclos a 94 ° C durante 1 min, 53 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, e uma extensão final durante 7 minutos a 72 ° C. Para

hTERT

as condições de amplificação foram os seguintes: uma desnaturação inicial a 94 ° C durante 4 min, seguido por 32 ciclos a 94 ° C durante 50 segundos, 52 ° C durante 50 segundos, 72 ° C durante 1 min, e uma extensão final a 72 ° C durante 7 min. Para SUZ12 EZH2 e amplificação: desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C para 30 segundo; 55 ° C durante 30 segundos; 72 ° C durante 30 s, e uma extensão final de 7 minutos a 72 ° C. Os produtos de PCR foram separados em 8% de TBE (Tris 50 mM de borato, pH 8,0, EDTA 1 mM) seguido géis por coloração com brometo de etídio. Os géis foram analisados ​​utilizando o software Kodak 1D.

citometria de fluxo e Aldefluor ensaio

FACS análise de células primárias cultivadas MPE foi realizada por meio de análise mutichannel padrão FACS utilizando um FACSCalibur citômetro (Becton Dickinson, San Jose , CA) e software de análise de FCS Express (De Novo software, Ontário, Canadá). Tanto as células não aderentes e aderentes foram recolhidas e reunidas. As células em cultura primária foram destacadas usando um tratamento com tripsina /versine, lavada com PBS contendo 2% de BSA, e marcada directamente com anticorpos primários marcado com fluorocromo, ou anticorpo primário não marcado com anticorpos secundários marcados com fluorocromo (como indicado abaixo). Ambas as concentrações de anticorpos primários e secundários foram consistentemente mantido a 1 mg /1 × 10

6 células; As células foram marcadas durante 45 minutos à temperatura ambiente e sequencialmente lavada três vezes em PBS contendo 2% de FBS, ressuspensas em PBS e mantidas em gelo antes da análise de FACS. O Aldefluor (Stemcell Technologies, Durham, NC, EUA), ensaio, que mede a atividade aldeído desidrogenase (ALDH), foi realizada de acordo com as orientações do fabricante. MPE-células de cultura primária foram suspensas em tampão de ensaio contendo Aldefluor a ALDH-substrato, Bodipy-aminoacetaldeído (BAAA; 1,5 mM) e incubou-se durante 50 min à temperatura ambiente. Para verificar a especificidade, uma amostra paralela foi incubada sob condições idênticas, mas na presença de um excesso molar de 10 vezes de inibidor da ALDH-, dietilaminobenzaldeído (DEAB). Esta diminuição resultante na intensidade de fluorescência de células ALDH-positivos foi usada para compensar o citômetro de fluxo análises.

Resultados

MPE-características, processamento e cultura primária

Para desenvolver um modelo para estudar endofenótipos de câncer de pulmão em cultura primária, nós fracionado da célula e compartimentos fluidos do MPE (Figura 1). As características clínicas dos derrames que foram utilizados para gerar este conjunto de dados eram típicas de MPE (Tabelas 1 e 2, ver abaixo). Sete de nove efusões malignas foram com base no diagnóstico citopatológico (Tabela 1). Em dois MPE, a interpretação final citopatologia a partir de 100 ml de amostra amostra era “altamente suspeito, mas inconclusiva”; Nestes casos, foram incluídas porque o crescimento de tumor foi evidente nas culturas primárias (incluindo

In vivo

em um caso, os dados não mostrados). Estudos anteriores tinham muito indicou que o plaqueamento eficiências e derivação de culturas primárias de espécimes clínicos de câncer de pulmão é pobre e depende tanto das condições de cultura e fatores relacionados ao hospedeiro [8], [9], [10], [11]. No entanto, esses estudos não completar as culturas de tumor primário com componentes do

in situ

microambiente do tumor (TME), possivelmente porque o objetivo principal ou única era estabelecer linhas de células tumorais imortais. Na verdade, a fim de obter linhas de células tumorais “pura” em condições definidas, todas as abordagens anteriores tomou medidas para minimizar a “contaminação” das culturas com TME-elementos. Consequentemente, se as subpopulações de células tumorais distintos existia em tumores individuais que dependiam de elementos TME para a sobrevivência, em seguida, usando qualquer TME artificial pode ter conferido uma vantagem de crescimento a subconjuntos específicos de células de tumor em um sistema de cultura contínuo. Assim, é possível que os modelos de células de câncer foram “selecionado para” pela TME cultura que foi usado para derivar as linhas de células tumorais.

Nós fundamentado que o conjunto completo de endofenótipos de células tumorais seria melhor estudados em culturas primárias que incorporaram TME autólogo. Assim, na tentativa de manter a heterogeneidade intratumoral

ex vivo

, tanto a população de células nucleadas que acompanham o tumor e o componente de fluido de EMA foram usadas para enriquecer a cultura primária-TME. Para superar a ineficiência anteriormente reconhecido para o estabelecimento de culturas primárias do tumor, e com base em observações empíricas descrito nos métodos, que seleccionado a condição “óptima” como sendo 30% de MPE-fluido componente misturados v /v em meio de base contendo antibióticos (meio de cultura Primária , ou PCM). Em

PCM

, cultura primária de passagens em série e foram mantidos com uma maior diversidade na morfologia, e culturas parecia ser mais robusta (em comparação com o crescimento paralelo de soro fetal bovino, dados não mostrados). Além disso, a utilização de um 30% v /v de MPE-fracção de líquido permitiu-nos a conservar este reagente limitante para durações mais longas de experimentação de culturas primárias. Utilizando esta metodologia, foi estabelecido culturas primárias de MPE-tumores de todos os sete tentativas.

Análises

preliminares indicaram que o sobrenadante foi altamente enriquecido com citocinas inflamatórias, com as concentrações de interleucina (IL) 1, IL 6, quimioquina CXC ligando 10 (IP10), ligando de quimiocina CC 2 (MCP1), e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) que foram estimados como sendo 10 ng /ml. Estes e outros factores, que provavelmente originados a partir do tumor, estromais e /ou células circulantes em MPE (Tabela 2), contribuíram para uma mistura complexa de citocinas, quimiocinas e factores de crescimento no componente MPE-fluido. No que diz respeito aos componentes celulares MPE-, as contagens de células nucleadas variaram de 1,3 x 10

8 a 2,5 x 10

9 células por litro de derrame. O circulando tipo de célula predominante no TME eram linfócitos (média ± desvio-padrão: 60 ± 26% de um total de 681 ± 560 WBC /ul), com significativa ( 1%) frações de PMN, macrófagos, monócitos e células mesoteliais (Tabela 2) em quase todos os derrames. Assim, em termos da sua composição celular de circulação e bioquímica (eram todos exsudato) [12], as efusões que estudamos eram típicos da MPE.

A evidência de heterogeneidade intratumoral em amostras MPE-tumorais extraídas

Figura 2a exibe representante H e citopatologia manchado após a gradação de densidade Ficoll. Como mostrado, o tumor foi MPE variavelmente contidos agrupamentos indistintas de células de diferentes composições, ou esferóides bem organizados. Um exame mais detalhado sugeriu que esses dois conglomerados de células tumorais foram organizaram-se em microdomínios distintas. Baseamos esta suspeita na observação de que quando nós rotulados espécimes para

candidato

CSC-marcadores, que frequentemente se coloração dentro de focos discretos nos agregados (Figura 2B). Por exemplo, espécimes de patologia MPE coradas para a expressão de CD44 fraccionada. CD44, o receptor de superfície celular para o hialuronato de [13], foram utilizados como um marcador de superfície para seleccionar CSC. CD44 foi anteriormente utilizado sozinho [14] e em conjunto com outros marcadores de superfície celular para classificar CSC a partir de várias malignidades epiteliais, em ambos os sistemas de modelos humanos e de murino [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21]. Todos os espécimes MPE exibido um CD44 + fração, que variou de um valor estimado de 8% a 47% de células nucleadas por imuno-histoquímica (IHQ) (Figura 2B, as Figuras S1a e s1c). Para além de CD44, fracções de células, também apresentado outro candidato

CSC-marcadores, cMET [22], [23] e MDR-1 [24], [25] (Figura 2B). diferenças anteriormente, outros pesquisadores também exploradas no metabolismo xenobiótico de células para segregar CSC a partir da mistura de tumor. Uma tal técnica utilizada no ensaio Aldefluor ™ (StemCell Technologies), que segregado

candidato

CSC com base na actividade ALDH1A1 [26], [27], [28]. Tal como CD44, verificou-se que as células que foram rotulados para ALDH1 visto nos bolsos agregados dentro do EMA-tumores (Figura 2B, Figura S1b). acentuada variabilidade de coloração foi evidente até mesmo dentro de um espécime individual. Assim, pode-se encontrar bolsas discretas de fraco, médio e forte coloração ALDH1 (Figura 2B). Acima de tudo, estes dados indicam que individuais MPE espécimes teve diversos fenótipos imunológicos e metabólicos. Além disso, se o

candidato

CD44 e ALDH rótulos eram marcadores substitutos válidos para CSC, então CSC parecia residir em microdomínios protegidas discretos (nichos) nos clusters MPE-tumorais. Finalmente, embora a expressão temporal e correlação funcional desses CSC-rótulos tem ainda a ser determinado, os dados sugerem que as células expressando

candidato

marcadores CSC poderia ser potencialmente separada da mistura MPE-tumor.

clusters (a) Pessoa celulares e esferóides em MPE-citopatologia. Representante de H E de amostras tumorais derivadas de MPE mostrando clusters e esferóides organizados da morfologia, variando, e composições do estroma células /(20 × ou 100 ×). (B) IHC para o candidato CSC marcador de expressão. espécimes tumorais derivadas de MPE foram imunomarcadas para

candidato

marcadores CSC, incluindo CD44 (40 × e 400 ×), cMET (100 × e 400 ×), MDR-1 (100 × e 400 ×) e ALDH -1 (40 × e 200 ×).

MPE-tumores expressam CSC-marcadores implicados em programas de expansão de células progenitoras ou pluripotência

em geral, os tumores surgem por causa de uma parada anormal durante tecido-diferenciação [29], [30]. Uma das primeiras manifestações da diferenciação-prisão é que há uma expansão do conjunto de células progenitoras. Assim, assinaturas moleculares de células progenitoras pode servir como

candidato

CSC-biomarcadores. A este respeito, estudos em animais tinham implicado PTEN para a manutenção adequada e diferenciação de células progenitoras da população pulmonar periférica [31]. silenciamento promotor PTEN é evidenciado no cancro do pulmão humano [32], implicando esta via para o seu desenvolvimento e /ou a progressão. Telomerase (hTERT) activação contribui para a patogénese do cancro do pulmão [33], e hTERT é comumente activado em câncer de pulmão. Juntamente com p16 (INK4A), hTERT parece ser necessária para a imortalidade celular que caracteriza a ambas as células estaminais e as células tumorais [34], e a sua expressão pode indicar uma mudança dinâmica na fracção do fenótipo imortalizado [35], [36]. marcadores entre

candidato compartilhados

CSC e as células-tronco também incluem vias que medeiam celular auto-renovação e pluripotência. Oct4 é um marcador de desenvolvimento embrionário, que está associada com pluripotência, e é normalmente utilizado para marcar o CSC-fenótipo [21], [37]. Da mesma forma, a regulação do estado pluripotente é epigenetically controlada por mudanças estruturais na cromatina [38], [39], [40]. controlo transcricional durante o estado pluripotente é aplicada pelo grupo Polycomb (PCG) de proteínas que funcionam para modificar a estrutura da cromatina. SUZ12, EZH2, e Bmi1 são componentes de complexos PCG, e porque a sua expressão em desenvolvimento é característico das células estaminais de tecidos, eles também têm sido utilizados para marcar o candidato

CSC-fenótipo [6], [7] , [41]. Para testar se estes sinais moleculares de

candidato

CSC pode ser detectada em MPE-tumores, o ARN foi extraído a partir das fracções de células nucleadas e RT-PCR para estes marcadores foi realizada. Descobrimos que estes

candidato

CSC-biomarcadores foram expressos em diferentes MPE-tumores (Figura 3). Estes dados sugerem que o pulmão CSC-fenótipo foi mantida no MPE apesar do ambiente inflamatório do MPE-TME, ao contrário de alguns postulados convencionais relativas ao meio ambiente nicho CSC. Talvez, este foi porque o CSC estavam protegidos (como descrito) do TME solúvel nos conglomerados tumorais que são evidenciados nas MPE. Mais importante ainda, esses resultados também definir o cenário para o rastreamento dinamicamente esses sinais moleculares como alterações experimentais para as condições de cultura são introduzidos nos esforços para enriquecer para o CSC-fenótipo.

perfis de expressão de PTEN, Oct4, hTERT, BMI1 , SUZ12, e EZH2 foram estudados por a transcriptase inversa-PCR. RNA extraído a partir do sedimento de células nucleadas de MPE foi transcrito reversamente e o ADNc foi utilizado na amplificação por PCR dos genes respectivos. Os produtos de PCR foram separados em géis de 10% TBE, seguido por coloração com brometo de etídio e analisados ​​utilizando o software Kodak 1D. PTEN, hTERT, SUZ12, EZH2 foram uniformemente expresso em todo o MPE, enquanto BMI1 e expressão Oct4 não foi detectado em amostras individuais. tubulina beta foi usado como um controle de carga.

A evidência de heterogeneidade intratumoral em culturas MPE-primária

culturas MPE-primários foram estabelecidas em pcm. Nestas condições, as culturas primárias apresentada diversas morfologias (Figura 4A), e taxas de crescimento lento variavelmente. As culturas primárias tipicamente tomou várias semanas para “amadurecer” (como definida pelo crescimento no recipiente de cultura que se aproxima de 70-80% de confluência). Durante este intervalo, os aglomerados e estruturas esféricas que foram observados na inicial MPE-citopatologia não foram bem conservado. No entanto, as culturas primárias apresentada uma heterogeneidade fenotipica que não tinham sido examinados anteriormente. Durante sua evolução, culturas primárias foram sempre composta colônias com diferentes morfologias (agregados flutuantes que excluem o azul de tripano, as colónias de células gigantes, fibroblastóide e aglomerados de paralelepípedo), apesar de estar no mesmo frasco com uma TME (Figura 4A), aparentemente idênticos. Estas colônias pareciam se expandir a taxas variáveis, sugerindo que eles tinham índices de proliferação diferentes, apesar de estar em um ambiente de “comum”. Nós argumentou que, se CSC, como as células progenitoras do tecido, teve um volume de negócios reduzido, então as diferenças na proliferação nos permitiria separar frações enriquecidas para CSC. Para testar se uma tal estratégia era viável com MPE- culturas primárias, desenvolvemos uma estratégia de triagem de células vivas que usado éster de succinimidilo carboxyfluoroscein (CFSE) em um sistema de rotulagem de teste para fracionar as células com base em índices de replicação diferentes. CFSE é um reagente permeável de membrana que é clivado por esterases intracelulares para produzir um metabolito reactivo com amina fluorescente que permanece no citoplasma por semana. A cada células de tempo sofrem divisão, a quantidade de CFSE presente em cada célula filha é reduzido pela metade. As células que não estão a replicar manter a etiqueta. Assim,

se

CSC está replicando lentamente,

seguida

a população retenção rótulo deve ser enriquecido para CSC. Embora as linhagens celulares que compõem o rótulo retenção subconjunto precisam ser melhor definidos, esses estudos-piloto, a prova de conceito sugerido que o fraccionamento MPE-tumor com base em diferenças nos índices de proliferação era viável (ver a de retenção de etiqueta célula população-M1 que emerge ao longo do tempo em

pcm;

Figura 4B). Em resumo, as diferenças na morfologia, proliferação, marcador de superfície e propriedades metabólicas possivelmente reflectem endofenótipos discretas de células cancerosas em MPE. Embora os correlatos funcionais associadas a cada um desses recursos ainda têm de continuar a ser exploradas, nossos resultados indicam que, em culturas MPE-primário, a investigação da heterogeneidade intratumoral é viável.

(A) heterogeneidade morfológica em cultura primária. Três MPE diferente (Amostra A, Amostra B e da Amostra C) cultivadas em pcm foram avaliados quanto à morfologia da colônia. Cada coluna (A, B, e C) representa uma amostra distintas. fotomicrografias representativas da colónia heterogeneidade por microscopia de contraste de fase nos dias 3, 15 e 20 de cultura primária (linhas 1, 2 e 3, respectivamente) são apresentados. As fotomicrografias em linhas 1, 2 e 3 estão em ampliações de 40 ×, 100 × e 400 ×, respectivamente. (B) MPE-subpopulações em cultura primária pode ser fraccionada com base em diferenças na proliferação de fluxo: histogramas representativos de Dia 1 versus Dia 9 de uma cultura primária CFSE marcado. Com a expansão, as subpopulações que são proliferativa perder o rótulo CFSE, e aqueles que são quiescentes manter a etiqueta. Neste exemplo,

no dia 1, 96,14%

das contagens se encontram dentro da região fechado por M1; em

dia 9, 8,36%

das contagens se encontram dentro da região fechado por M1.

Racionalmente fraccionar culturas MPE-primárias para classificar a putativa CSC-subpopulação

Com assinaturas moleculares que sugerem que a CSC estão presentes no MPE, o próximo testado se pudéssemos capturar o

candidato

CSC da MPE-tumores. Na maturação, culturas MPE-primários foram classificadas com base no

candidato

CSC-marcadores. Curiosamente, em cada caso até agora testados, a imunofenotipagem de superfície das células em cultura primária indicada geralmente uma aparente de expansão em presença de células CD44 + fracção (Figura 5). Enquanto as células eram quase uniformemente positivo para a expressão de CD44, as fracções foram variavelmente mais positivo para cMET, CD166 [42], e uPAR [43] expressão (Figura 5). Adicionalmente, utilizando um ensaio fluorescente que foi relatado para classificar putativo CSC a partir de cancro do pulmão, cancro da mama, mieloma múltiplo e [26], [27], [28], com base da actividade de ALDH diferencial, uma pequena fracção do EMA-derivado tumores primários exibida a ALDH

oi /CD44

+ fenótipo (Figura 6). Colectivamente, estes dados indicam que

candidato

CSC-frações puderam ser segregadas a partir de culturas primárias de MPE-tumor.