Abstract

O câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais letais com um alto metástase e taxa de recorrência, que é provavelmente devido à existência de células-tronco de câncer de pulmão (CSCs). CSCs em muitos tumores, incluindo cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) foram identificados utilizando CD44 molecular aderência, quer individualmente ou em combinação com outro marcador (s). Os microRNAs (miRNAs) regulam tanto em células normais estaminais e CSCs e desregulação dos miRNAs tem sido implicada na tumorigénese. Recentemente, o miR-34a foi encontrado para ser regulados negativamente em células NSCLC, mas as funções biológicas de miR-34a na regulação do comportamento celular NSCLC não têm sido extensivamente estudados. Aqui, mostramos que a transfecção de sintético miR-34a, mas não no controlo negativo (CN) de miARN oligonucleótidos (oligonucleótidos) em três linhas celulares de NSCLC, ou seja, A549, H460, e H1299, inibiu a formação holoclone, expansão clonogénicas, e regeneração tumoral na Vivo. Além disso, a sobre-expressão mediada por vector lentiviral de miR-34a em CD44 purificado

oi H460 células também desenvolvimento de tumor inibida. Em contraste, a expressão de antagomirs miR-34a (i.e., oligos antimensageiros) no CD44

lo H460 células promoveu o desenvolvimento do tumor. Nosso estudo mostra que o miR-34a é um regulador negativo das propriedades tumorigénicas das células NSCLC e CD44

oi pulmão CSCs, e estabelece uma forte razão para o desenvolvimento de miR-34a como um novo agente terapêutico contra NSCLC.

Citação: Shi Y, Liu C, Liu X, Tang DG, Wang J (2014) o microRNA miR-34a Inibe Non-Small Cell Lung Cancer Crescimento (NSCLC) eo CD44

hi células-tronco-Like NSCLC. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10.1371 /journal.pone.0090022

editor: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de novembro de 2013; Aceito: 24 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81141096 e Grant No. 81.372.512) e do Fundo Projeto chave da Shanghai Science and Technology Association, China (Grant No. 05.119.554) para J. Wang, e NIH (R01- CA155693), Departamento de Defesa (PC120817), CPRIT (RP120380), eo Centro MDACC para o cancro da epigenética e RNA Centro-Laura John Arnold Foundation concede à DG. Espiga. C. Liu foi apoiado, em parte, por uma bolsa de pós-doutoramento DOD (PC121553). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células-tronco cancerosas (CSC), ou seja, as células cancerosas com certas propriedades de células-tronco, têm sido relatados em muitos tumores humanos e são pensados ​​para ser responsável pela iniciação do tumor, resistência à terapia, progressão, a recidiva e metástase [ ,,,0],1] – [3]. MicroRNAs (miARNs), pequenos RNAs não codificantes, regular a cerca de 20% -30% dos genes no genoma humano, e têm sido implicados na regulação da proliferação, diferenciação, migração, e a apoptose através da inibição da tradução da proteína e /ou indução de degradação mensageiro por ligação às sequências complementares da região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) nos seus mRNAs alvo [4], [5]. miARN pode actuar como ambos os oncogenes e os genes supressores de tumor [6], [7], e têm emergido como reguladores importantes de CSCs bem.

O microARN-34a (miR-34a) funciona como um supressor de tumor [ ,,,0],8] e é regulada negativamente em alguns cancros humanos, incluindo o cancro da mama [9], o câncer de próstata [10], osteossarcoma [11], e cancro do pulmão [12], [13]. O cancro do pulmão é o tumor maligno mais letal em todo o mundo. O trabalho nos últimos anos indica que tanto pequenas células (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) conter CSCs [14], [15]. Tal como na maioria dos outros tumores, CSCs pulmonares potenciais foram enriquecidas e purificada utilizando ensaios funcionais [16] – [18], bem como marcadores de superfície celular, tais como CD133, CD34, CD90, CD44 e [3]. CD44 é uma glicoproteína ligada à membrana, que medeia uma complexa variedade de funções. Alguns estudos têm mostrado que o CD44

+ células são enriquecidas para a capacidade de propagação do tumor e que CD44 é um marcador de potencial CSC em NSCLC [19]. Liu

et al

mostraram que miR-34a pode inibir CSCs de próstata e de metástases reprimindo directamente CD44 [20]. Identificação de CD44 como um alvo directo e funcionalmente relevante miR-34a revela uma via de sinalização anteriormente pouco apreciado [20].

Embora não haja evidência de que o miR-34a é reduzido em NSCLC, as funções biológicas da presente miARN no NSCLC permanecem escassamente investigado. Neste estudo, usando uma variedade de ensaios biológicos combinados com extensas experiências de tumor de xenoenxerto, que relatam que o miR-34a regula negativamente as propriedades CSC-associados, bem como a capacidade de iniciação do tumor de três células NSCLC.

Materiais e métodos

Animais e experiências com animais

imuno-deficientes NOD-SCID camundongos (não obesos diabéticos graves combinadas imunes deficientes) foram produzidos principalmente a partir de nossas próprias colônias de reprodução e mantidos em condições normais de acordo com a diretrizes institucionais. Todos os estudos relacionados a animais deste projecto foram aprovadas pelo M.D. Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care e do Comitê Use; ACUF # 08-05-08132). A pesquisa atual não envolve seres humanos (ou seja, indivíduos que vivem ou informações pessoais identificáveis). Todos os outros estudos aqui apresentados foram o investigador-iniciado e não necessitam de aprovação de outros órgãos reguladores.

Células e procedimentos experimentais básicos

As três linhas de células NSCLC humanas (A549, H460 e H1299 ) foram obtidas a partir de ATCC. Todas as células foram mantidas em meio recomendado pela ATCC suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS; Invitrogen-Life Technologies). As células foram incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C, fornecido com 5% de CO

2. As células foram mantidas rotineiramente em 75 cm

2 frascos de cultura de tecidos (Corning Incorporated, EUA) e colhida usando 0,05% de tripsina. A maioria dos procedimentos experimentais básicas foram descritas em nossas publicações anteriores [20], [21].

transfecção transitória com oligonucleotídeos sintéticos (oligos)

Nós transfectadas células a granel ou a CD44 purificada

+ células NSCLC com 33 nM de miR-34a ou não-alvo oligos negativos controle miRNA (miR-NC) (Ambion, Austin, TX) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Alternativamente, nós transfectadas as CD44

purificados – células NSCLC com 33 nM de anti-miR-34a (anti-34a) ou oligos anti-miR-NC (anti-NC) (Ambion). Em geral, as células colhidas para transfectadas in vitro ou in vivo em estudos após cultura durante 48 h.

Lentivirus sobreexpressão mediada de miR-34a

Uma codificação de vector lentiviral pré-miR-34a (lenti -34a) e o vetor de controlo (lenti-CTL) foram obtidos a partir de sistemas Biociências (SBI) [20]. Lentivírus foi produzido em células de empacotamento 293FT e os títulos determinados para GFP utilizando células HT1080. células NSCLC foram infectadas a uma MOI de 25, na presença de 8 ug /mL de polibreno e colhidas 48-72 h após a infecção.

RT-PCR quantitativo

os níveis de miARN maduro e de ARNm de CD44 foram quantificados utilizando [20] MicroRNA TaqMan Ensaios (Applied Biosystems). Resumidamente, o ARN total foi isolado utilizando o kit de isolamento de miARN miRvana PARIS (Ambion). dados de expressão de miRNA quantitativos foram normalizados para miRNAs internos ‘limpeza’, isto é, miR-24 e miR-103. dados de expressão de mRNA quantitativos foram normalizados para ‘limpeza’ interna mRNA, ou seja, GAPDH. As diferenças entre o ou seja, valores DDCT, para cada um dos miARNs ou ARNm foram convertidas a percentagem de expressão utilizando a fórmula 2

-ddCt [20].

ensaios positivos e negativos correspondentes populações, clonal e clonogénico

Para os ensaios de holoclone [22], que plaqueadas células NSCLC, a uma densidade clonal (ou seja, a 50 células /poço) numa placa de 6 poços, contado o número de holoclones vários dias mais tarde, e apresentou a percentagem de células que estabeleceram uma holoclone como a eficiência de clonagem. Para os ensaios clonogénicos [20], em primeiro lugar, misturou-se a metilcelulose (MC) com meio isento de soro suplementado com 5 mg mL-1 de insulina, 20 ng mL-1 e EGF 10 ng mL-1 de bFGF (Sigma). Em seguida, as células plaqueadas geralmente a 1000 células /poço em mistura MC na proporção de 1:10 em 24 poços de ultra-baixo de fixação (ULA) e placas de colónias enumerados 2-3 semanas após o plaqueamento. Para todas as experiências anteriores, que executa um mínimo de poços em triplicado para cada condição e repetiu as experiências, sempre que possível.

A citometria de fluxo e análise de células activadas por fluorescência (FACS)

Expressão de marcadores CSC foi avaliada por citometria de fluxo. As células foram coradas vivo na solução de coloração contendo BSA e FITC-conjugado monoclonal anti-CD44 (clone # G44-26; BD Bioscience) ou PE-conjugado monoclonal anti-CD133 (AC133 clone #; Miltenyi Biotech), na concentração recomendada pela fabricantes. Correspondentes imunoglobulinas de ratinho do mesmo isotipo foram utilizados como controlos negativos (BD Bioscience). Pelo menos 10.000 células foram analisadas. Para separação de células, a rotulagem dos marcadores de superfície celular foi realizada sob condições esterilizadas e as células foram classificadas segundo a BD FACSVantage celular classificador (BD Bioscience). Os 10% mais brilhante com detalhes, e os 10% de células mais fracamente coradas fundo foram selecionados como as populações positivas e negativas, respectivamente. Triagem pureza de mais de 90% foi assegurada para mais in vitro e in vivo. Todos os dados foram analisados ​​pelo software FlowJo (versão 7.6.1).

Aldefluor ensaio

O Kit Aldefluor Assay (Aldagen, Inc. Durham, NC) foi usado para traçar o perfil do aldeído desidrogenase ( ALDH) actividade em células NSCLC [23]. As células foram incubadas em tampão de ensaio contendo o Aldefluor ALDH substrato proteico BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA) durante 40 min a 37 ° C. As células que poderia catalisar BAAA ao seu produto fluorescente BODIPY-aminoacetato (BAA) foram considerados ALDH

+. Triagem FACS para portões foram tiradas em relação à linha de base de fluorescência das células, a qual foi determinada pela adição do inibidor específico dietilaminobenzaldeído ALDH (DEAB) durante a incubação e as amostras tratadas com DEAB serviram como controlos negativos. As células não viáveis ​​foram identificados por iodeto de propídio (PI) a positividade. As células foram classificadas segundo a BD FACSVantage celular classificador.

experimentos transplante do tumor

As células foram injetadas em 60 ul de mistura medium:Matrigel (01:01) por via subcutânea (sc) em NOD /SCID ( 6-8 semanas de idade). Nós transfectadas H460 granel, A549 ou células H1299 com miR-34a ou oligos miR-NC (33 Nm). 48 h mais tarde, três doses diferentes de células a 500.000, 50.000, ou 5.000 foram implantadas. Para células H460, 2 milhões de células de cada adicionais (n = 7) foram implantadas. Além de transfecção de oligo, que também algumas células infectadas com vectores lenti-34a ou lenti-CTL (MOI 25) [20], e, 48 h mais tarde, três doses de células a 500000, 50000, 5000 foram implantados. Finalmente, transfectadas purificadas CD44

lo H460 células com anti-34 ou oligos anti-NC (33 nM) e também infectado purificado CD44

oi H460 células com lenti-34a ou vetores lenti-CTL (MOI 25). 48 h mais tarde, as células foram implantadas em doses diferentes. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e os volumes dos tumores individuais foi medido utilizando um calibrador digital e aproximada de acordo com a fórmula V = 1 /2ab

2 (uma sendo o diâmetro longo e curto b diâmetro do tumor). No final de experimentos, os ratos foram sacrificados e os tumores foram colhidos, medido e fotografado.

A análise estatística

Nós usamos não pareado de

t

-teste de Student bicaudal comparar as diferenças no número de células, eficiência de clonagem, os pesos dos tumores, e outros parâmetros relacionados. Nós utilizado o teste do qui-quadrado para comparar a incidência e latência. Utilizou-se análise de variância (teste F) para comparar as diferenças em vários grupos. Em todas estas análises, a

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados e Discussão

miR-34a inibe NSCLC formação holoclone celular e capacidade clonogênica

.

miR-34a tem sido demonstrado que possuem funções tumor-supressor [8], [20], [21], [24] – [33] e para estar sob-expresso em alguns tumores, bem como determinadas subpopulações tumorigénicas [ ,,,0],10], como CD44

+ CSCs próstata [20]. miR-34a é um alvo p53 directo [32] e seu promotor é silenciado em algumas células cancerosas [30]. Houve alguma evidência experimental de que o miR-34a é regulada negativamente em células NSCLC [12], [13]. Para elucidar o potencial consequência biológica de perda de expressão miR34a em células NSCLC, primeiro transfectadas três células NSCLC, A549 (p53 de tipo selvagem), H460 (a p53 do tipo selvagem) e H1299 (mutante p53), com madura sintética miR- 34a ou oligos miR-NC (33 nM) [20] durante 48 h, e, em seguida, as células plaqueadas em triplicado a uma densidade clonal (ou seja, a 50 células /poço) em placas de 6 poços. Em seguida, avaliou a formação de holoclones, que foram mostrados para abrigar CSCs auto-renovação que podem a longo prazo propagam tumores [22], 12 dias (d) decorridos após o plaqueamento. Como mostrado na Figura 1 (A-C), a sobre-expressão de miR-34a inibiu significativamente o estabelecimento holoclone em todos os três modelos NSCLC. De importância, embora o miR-NC transfectadas células NSCLC formados grande e holoclones embaladas apertadamente, as células transfectadas com NSCLC miR-34a fundada muito menor e /ou ligeiramente comprimido paraclones (ver Figura 1B para exemplos). Posteriormente, foi realizada mais rigorosas,, ensaios clonog�icas independente de ancoragem em metilcelulose (MC), que têm sido amplamente utilizados para medir a atividade das células-autônoma de potenciais CSCs [3]. Tal como em ensaios clonais, miR-34a superexpressão inibiu significativamente a capacidade de formação de esfera de grandes quantidades A549, H460 e H1299 células (Figura 1D-E).

(A-C) ensaios clonais. As células transfectadas com o miR-34a ou oligos miR-NC (33 nM) foram plaqueadas em triplicado a 50 células /poço em placas de 6 poços. O experimento foi encerrado em 12 d e poços foram Giemsa-manchadas (A). Mostrado em B são imagens representativas. Os resultados apresentados em A e B eram representativos de duas experiências independentes. (C) apresentação quantitativa dos resultados em A. As barras representam a média ± S.D. (D-E) ensaios clonogénicos em MC. Um total de 1.000 células por poço foram plaqueadas para ensaio clonogénico. Fotos foram tiradas em d 15 após o plaqueamento e mostrado em D são campos representativos. (E) a apresentação quantitativa de resultados em D. As barras representam a média ± S.D.

Os resultados experimentais anteriores comprovam que a restauração da expressão de miR-34a em células NSCLC inibe ambas as propriedades clonais e clonog�icas. Como as 3 células NSCLC possuir o estado de p53 diferente, os resultados também sugerem que os efeitos inibidores de miR-34a são p53-independente. Como esperado, as células transfectadas com os oligos miR-34a mostrou aumentou dramaticamente os níveis de miR-34a tal como avaliado por análise de qPCR madura miR-34a (Figura 2A). É interessante notar, no entanto, os 3 tipos de células NSCLC exibida uma ampla variação dos níveis aumentados de miR-34a, com as células H1299 de retenção a maior quantidade de exógena de miR-34a 48 h após transfecção (Figura 2A). Como discutido anteriormente, o miR-34a é um alvo directo da transcrição de p53 e as células [32] H1299 têm p53 mutante. Uma possibilidade é que os níveis de ambas p53 e miR-34a em células do cancro do pulmão tem de ser muito bem controlado. Por conseguinte, em A549 e H460 células que têm o tipo selvagem p53, p53, mesmo exogenamente introduzido torna-se degradado rápido enquanto nas células H1299 p53 mutante, os oligos madura miR-34a transfectadas sobreviver muito mais tempo (Figura 2A).

(A) as células NSCLC recém-transfectadas com oligos miR-34a mostrou níveis de miR-34a várias ordens de magnitude maior do que as transfectadas com oligos miR-NC. As células NSCLC indicados foram transfectadas com miR-34a ou miR-NC oligos, e 48 h mais tarde, foram colhidos e utilizados em experiências de tumor (abaixo), enquanto que um pequeno número de células foram retiradas e utilizados na medição de qRT-PCR de miR- níveis de mRNA 34a. São mostrados os valores médios de miR-34a (em escala logarítmica; n = 2) em miR-34a células transfectadas em relação aos das células de miR-NC transfectadas (valores médios reais indicadas nas barras). (B-D) de miR-34a oligo transfecção crescimento do tumor A549 inibida. (Números de tumores desenvolvidos /de injeções;%) indicados são incidência de tumores, o tempo da colheita (incluindo datas de injeção e terminação reais), o peso médio do tumor (em gramas), e

P valores Compra de pesos tumorais. imagens tumorais brutas não são na mesma escala. (E-G) miR-34a oligo transfecção inibiu o crescimento tumoral H460. (H-L) miR-34a oligo transfecção inibiu o crescimento tumoral H1299.

Evidência de que o miR-34a superexpressão também inibe o desenvolvimento do tumor

Em seguida, avaliaram os potenciais efeitos tumorais-inibitório de miR-34a sobre os três tipos de células NSCLC in vivo (Figura 2). Nós transfectadas 33 nM de miR-34a ou oligos miR-NC em células A549, durante 48 horas e, em seguida, implantada 50000 (50 K) células por via subcutânea (s.c.) em NOD-imune deficiente /SCID. Tal como mostrado na Figura 2B-D, 34A-miR células transfectadas desenvolveram tumores que eram apenas cerca de metade dos tamanhos dos tumores de miR-nc e o primeiro também cresceram mais lentamente. Deve notar-se que a diferença de pesos de tumor não foi estatisticamente significativo devido aos tamanhos de amostra relativamente pequenos. Da mesma forma, o miR-34a células que sobre-expressam H460 desenvolvido muito menor e os tumores de crescimento mais lento em comparação com o miR-NC H460 transfectadas células (Figura 2E-G). As células H460 infectadas com um vector lentiviral miR-34a (isto é, lenti-34a) também regenerada tumores menores e um crescimento mais lento do que as células infectadas vector de controlo (Figura S1A-C). É importante ressaltar que o miR-34a superexpressão em células H460 reduziu a incidência do tumor (75% em miR-NC vs. 50% no miR-34a,

P Art 0,01; Figura 2E). Por fim, foi realizado um ensaio de tumor limitando-diluição através da implantação de 5 k, 50 k, ou 500 k de miR-NC ou miR-34a transfectadas H1299 células em camundongos NOD /SCID e em cada dose de células observamos tumores de crescimento menores e mais lentas derivado do miR-34a células que sobre-expressa em comparação com os tumores de miR-NC transfectadas células H1299 (Figura 2H-L). Mais uma vez, o miR-34a superexpressão reduziu a incidência tumoral em duas doses de células implantadas (isto é, 5 K e 500 K,

P

0,01; Figura 2I). Na verdade, miR-34a transfectadas H1299 células exibiram frequência de iniciação tumoral significativamente menor (TIF) do que os controles miR-NC correspondente (

P

= 4.64E-179) como determinado usando a função Limdil do pacote Statmod (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). Os efeitos de inibição de tumor relativamente mais fortes de miR-34a em H1299 células quanto à incidência de tumor são provavelmente relacionado com níveis muito mais elevados de exógena de miR-34a em H1299 células transfectadas (Figura 2A).

Tal como no caso de células A549, as diferenças nos pesos de tumor em miR-34a contra o miR-NC H460 transfectadas e células H1299 não atingiu significância estatística, provavelmente devido aos tamanhos de amostra relativamente pequenos (Figura 2E e 2I, respectivamente), o que é muito comum fenómeno em tais ensaios de xenoenxerto de tumor. Outra explicação plausível é que os oligos transfectadas tornou-se gradualmente degradada in vivo, como temos observado repetidamente em experiências semelhantes tumorais usando miR-34a [20] e deixá-7 [21] oligos. Em apoio, os tumores residuais derivadas a partir de células transfectadas de miR-34a mostrou nenhum aumento na miR-34a (dados não foram apresentados), em contraste com as células transfectadas de fresco (Figura 2A). Uma observação interessante foi que as células H1299-p53 mutante manteve níveis significativamente mais elevados de exógena de miR-34a (Figura 2A), que também parece manifestar os efeitos tumorais inibidora mais forte nesta linha celular (comparar Figura 2I vs. Figura 2B e 2E ).

miR-34a superexpressão inibe CD44

oi H460 regeneração do tumor enquanto anti-34a promove o crescimento do tumor em CD44 purificado

lo H460 células

evidência experimental forte

Houve que miR-34a pode manifestar efeitos tumorais inibidora por segmentação CSCs [10], [20], [21] e culturas de células NSCLC foram mostrados para abrigar as células cancerosas como tronco-[3], [14] – [19]. Portanto, nós queremos saber se os efeitos biológicos de miR-34a nas 3 células NSCLC (Figura 1 e 2) podem estar relacionados à sua acção sobre as células cancerosas tronco-like. Para resolver esta questão, determinou-se primeiro a percentagem de células positivas para Aldefluor, CD44 e CD133, ensaios ou marcadores freqüentemente utilizados para enriquecer CSCs pulmonares. Observamos ~1-2% Aldefluor H460 e H1299 positiva células, que foram em grande parte »extirpadas ‘na presença do inibidor da ALDH DEAB (Figura 3). Por razões desconhecidas, várias experiências repetidas mostraram que 90% de células A549 foram Aldefluor-positivo e esta percentagem não foi afectada pela DEAB (Figura 3). Praticamente 100% de A549, células H460, H1299 e CD44-positivas foram (valores médios sendo 97,2%, 99,3%, e 99,2%, respectivamente; n = 3) (Figura 3). Em contraste, não houve praticamente nenhuma expressão de CD133 nestas três linhas de células NSCLC (Figura 3C). É interessante que estes ensaios pode identificar sobrepostas populações de células-tronco NSCLC-like como ALDH purificado

oi células H1299 apresentaram níveis mais elevados de CD44 mRNA (Figura S1D). Em estudos preliminares, implantado 5 k ou 10 k purificadas células H1299 ALDH

hi eo ALDH correspondente

lo em camundongos NOD /SCID. Em 5 K, a ALDH

hi e ALDH

células Lo desenvolvido 4/5 (1,22 g, 0,32 g, 0,24 g e 0,12 g) e 1/7 tumores (0,99 g), respectivamente. Aos 10 K, a ALDH

hi e ALDH

células Lo desenvolvido 3/8 (0,36 g, 0,2 g, 0,1 g) e 1/8 tumores (0,03 g), respectivamente. Estes resultados preliminares sugerem que os ALDH

hi células H1299 possuem maior capacidade de regeneração do tumor, uma importante característica CSC.

(Top) O ensaio Aldefluor em 3 células NSCLC. DEAB amostras tratadas serviram como controlos negativos. ~1-2% De células H460 e H1299 foram Aldefluor-positiva ao passo que 90% de células A549 foram Aldefluor-positiva. (Médio) fluxo Representante citometria perfil de CD44 expressão (ITCF) em 3 células NSCLC. Praticamente 100% de A549, células H460, H1299 e CD44-positivas foram (valores médios sendo 97,2%, 99,3%, e 99,2%, respectivamente; n = 3). (Inferior) Citometria de fluxo análise da expressão CD133 (PE) em células 3NSCLC. Não havia quase nenhuma expressão de CD133 nestas três linhas de células NSCLC.

Em células cancerosas da próstata PC3, quase 100% das células são positivas para CD44 [34]. No entanto, existem células PC3, que expressam níveis muito elevados de CD44 na superfície celular (i.e., CD44

oi) e esses níveis baixos de CD44 (i.e., CD44

LO). De importância, CD44

células PC3 oi demonstrou potenciais clonais e clonog�icas significativamente maiores do que os isogênicos CD44

células lo PC3 [34]. Com base nesta analogia, nós purificado a CD44

oi (ou seja, superior a 10%) e CD44

lo (isto é, inferior a 10%) H460 células (Figura 4A). Como esperado, o CD44

oi células H460 expressa altos níveis de mRNA CD44 do que os CD44

lo H460 células (

P

= 0,0009) (Figura 4B). Notavelmente, mediada por sobre-expressão de lentivírus miR-34a no CD44

oi H460 células significativamente inibiu o crescimento tumoral (Figura 4C, E e F). O mais impressionante, os antagomirs anti-miR-34a [20] promoveu drasticamente a taxa de crescimento de regeneração do tumor e tumor de CD44

lo H460 células em todos os três doses celulares (100 k, 10 k, e 1 k) testadas (Figura 4D , G-J).

(A-B) nível de expressão de CD44. (A) diagramas representativos de citometria de fluxo de expressão de CD44 (FITC) em células H460. (B) os níveis de mRNA CD44 em purificadas CD44

hi e CD44

lo H460 células avaliados por qRT-PCR. (C, E, F) sobre-expressão de miR-34a em CD44 purificado

oi H460 células por infecção lentiviral regeneração do tumor inibida. (C) indicados são incidência de tumores (tumores desenvolvidos /número de injeções;%), tempo de colheita (incluindo datas de injeção e terminação reais), peso médio do tumor (em gramas, F), e

valores P Compra de os pesos dos tumores. imagens tumorais brutas não são na mesma escala. (E) A curva de crescimento do tumor. (D, G-J) Anti-miR-34a promoveu o crescimento do tumor de CD44 purificado

lo H460 células. (D) indicados são incidência de tumores (tumores desenvolvidos /número de injeções;%), tempo de colheita (incluindo datas de injeção e terminação reais), peso médio do tumor (em gramas, G), e

valores P Compra de os pesos dos tumores. imagens tumorais brutas não são na mesma escala. (H-J) A curva de crescimento de tumor em três doses diferentes de células.

Em resumo, demonstrámos que o miR-34a superexpressão holoclone inibe a formação de células NSCLC e expansão clonogénico in vitro e, mais importante, tumores a regeneração in vivo. Estes efeitos inibidores de miR-34a pode ser devida aos seus efeitos sobre as células estaminais NSCLC semelhante. Em apoio a esta possibilidade, aplicada expressão de miR-34a especificamente no CD44

oi H460 células inibiu significativamente a sua actividade de regeneração de tumor enquanto os antagonistas de miR-34a promovido drasticamente a regeneração do tumor em CD44

lo H460 células. Estas observações são consistentes com CD44 ser um alvo directo e funcional de miR-34a na próstata [20] e algum outro cancro [31] e células sugerem que o miR-34a regula negativamente a capacidade de iniciação do tumor de NSCLC CSCs. O trabalho futuro terá como objectivo elucidar os mecanismos subjacentes e as interações entre miR-34a e expressão de CD44 em células NSCLC.

Informações de Apoio

Figura S1.

miR-34a inibe o crescimento do tumor H460 e ALDH

oi células H1299 expressam níveis mais elevados de ARNm de CD44. (A-C) Lentivirus mediada miR-34a sobreexpressão em células H460 inibiu o crescimento tumoral. (A) Os pesos dos tumores de endpoint. (B e C) curvas de crescimento do tumor em duas doses diferentes de células. (D) Os níveis de mRNA CD44 em

hi e correspondentes ALDH

lo H1299 células ALDH purificados avaliados por qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090022.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos T. Davis para a assistência em todos os experimentos tumorais e P. Whitney para FACS. Agradecemos também a outros membros do laboratório Tang para discussões úteis e apoio.