Abstract
níveis de miRNA são alterados de adenocarcinoma pancreático ductal (PDA), o tumor maligno do pâncreas mais comum e letal, e processamento de miRNA intacta é essencial para a especificação das linhagens durante o desenvolvimento pancreático. No entanto, o papel do processamento de miARN no PDA não tem sido explorado. Aqui se estuda o papel de miRNA biogênese no desenvolvimento PDA, excluindo o miRNA enzima de processamento Dicer em um rato modelo PDA impulsionado por Kras oncogênico. Descobrimos que a perda de Dicer acelera Kras conduzido desdiferenciação acinar e ductal acinar para metaplasia (ADM), um processo que tem sido demonstrado que precedem e promover a especificação de precursores de PDA. No entanto, sem restrições ADM também exibe altos níveis de apoptose. perda Dicer não acelerar o desenvolvimento de precursores de PDA Kras impulsionadas ou PDA, mas, surpreendentemente, observa-se que o mouse PDA pode se desenvolver sem Dicer, embora à custa da capacidade proliferativa. Nossos dados sugerem que o processamento de miRNA intactas está envolvido em ambos restringindo mudanças pró-tumorigênicos na diferenciação de pâncreas, bem como manter a viabilidade durante PDA iniciação
Citation:. Morris JP IV, Greer R, Russ HA, von Figura G, Kim GE, Busch A, et al. (2014) Dicer Regula Diferenciação e viabilidade durante Rato cancro do pâncreas Iniciação. PLoS ONE 9 (5): e95486. doi: 10.1371 /journal.pone.0095486
editor: Murray Korc, Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de janeiro de 2014; Aceito: 26 de março de 2014; Publicado em: 01 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Morris et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Trabalho em Grupo de Matthias Hebrok foi apoiado por uma bolsa da Cancer Action Network AACR pâncreas. www.pancan.org. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) parece desenvolver-se através de uma série de lesões precursoras ductal, incluindo o tipo mais comum, neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais). Ambos os PanINs e apresentam mutações no KRAS PDA, que pode ser um evento de iniciação. modelos de ratinho suporta esta noção de expressão alvo e persistente de Kras mutantes no epitélio pancreático do rato tanto recapitula o PanIN para PDA sequência observada em seres humanos, e é necessário para manutenção da doença [1], [2], [3]. A evidência a partir de modelos de ratinho sugere que o mutante Kras pode contribuir para a iniciação de PDA por reprogramação de células acinares numa conduta como linhagem capaz de se tornar PanINs através de um processo denominado acinar para metaplasia ductal (ADM) [4], [5], [6]. Esta capacidade de alterar a plasticidade pancreático pode ser um passo importante na iniciação PDA, como células acinares foram mostrados para ser dramaticamente mais sensível à Kras desenvolvimento PanIN dependente em comparação com células do ducto [7]. Uma vez que as tentativas de inibição directa de Kras oncogénicos têm sido geralmente mal sucedidos [8], que define mediadores críticos de diferenciação pró-tumorigénico e viabilidade a jusante do mutante Kras pode representar abordagens terapêuticas alternativas.
MicroRNAs (miARNs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes, que regulam a expressão gênica pós-transcricional. níveis de miARN aberrante está associada com o desenvolvimento de tumores, e conduzir a expressão inapropriada de oncogenes supressores de tumores e [9]. Cancro associado a níveis de miARN resultar da misexpression de miARNs específicos, bem como a desregulação da via de biogénese de miARN [10]. miRNAs são geralmente reprimidos em cancros humanos [11] e processamento de miRNA inibida promove tumorigênese [12]. No entanto, a perda de processamento de miARN pode ser incompatível com o desenvolvimento de alguns tumores [13], [14], [15], sugerindo que limites críticos de processamento de miARN pode ser envolvido na manutenção da viabilidade durante a transformação. Enquanto miARNs são misexpressed em PanINs e PDA, e são conhecidos para regular caminhos que contribuem para o PDA a iniciação e progressão [16], [17], [18], [19], o papel que o processamento de miARN desempenha no desenvolvimento de PDA não foi investigada.
ao excluir a enzima miRNA-processamento Dicer em um rato modelo impulsionado Kras de PDA, descobrimos que o processamento de miRNA regula a diferenciação e viabilidade durante a transformação de pâncreas Kras conduzido. Dicer eliminação promove Kras perda conduzido da identidade acinar e ADM, mas também resulta em aumento dos níveis de apoptose e diminuição da expressão de genes implicados na manutenção da viabilidade durante o desenvolvimento PanIN e no PDA. Surpreendentemente, descobrimos que o mouse PDA pode se desenvolver na ausência de Dicer, embora com redução da proliferação. Tomados em conjunto, este trabalho sugere um papel crítico para o processamento de miRNA na iniciação PDA Kras conduzido.
Resultados
Perda Dicer Acelera Kras Impulsionada eliminação ductal metaplasia
Dicer em células progenitoras pancreáticas início resulta em agenesia pancreática e morte pós-natal [20]. Por isso, testamos se um Pdx1 distinta impulsionado estirpe Cre,
Pdx1-Cre
tardia
, permitiu o desenvolvimento de pâncreas no cenário de perda de função Dicer.
Pdx1-Cre
tardias resultados na atividade de desenvolvimento atrasado em comparação com o motorista Pdx1-Cre empregado por Lynn
et al
, resultando em recombinação em um conjunto mais restrito de células adultas, especificamente a maioria dos ácinos, algumas células endócrinas, e raramente em células dos ductos [21]. Sugerindo requisitos temporais para Dicer no desenvolvimento do pâncreas,
Pdx1-Cre
tardia; Dicer
Flox /Flox
(
Dicer
Homo
) ratos prosperou e exibido desenvolvimento pancreático grosseiramente normal em p0, mesmo no contexto de diminuição significativamente a expressão Dicer em relação ao controle
Pdx1- Cre
tardia; Dicer
flox /+
ratos (
Dicer
Het
) (Figura S1 A, B, E).
Em 3 semanas de idade, acini, dutos, e ilhotas foram reconhecidos no
Dicer
Homo
ratos (Figura 1A), embora houvesse algumas áreas exócrinas com eosina diminuiu. Imunofluorescência revelou distribuição normal do marcador amilase acinar, ducto marcador CK19, e insulina marcador de células β (Figura 1B). morfologia exócrina foi perturbado embora, como que frequentemente se ácinos desorganizado com células pequenas e fragmentadas que não foram detectados nos controles (Figura 1B, figura S2), semelhantes às células acinares desorganizadas observadas em hypomorphs Dicer somáticas [22]. massa pancreática em
Dicer
Homo
ratos também foi reduzida (Figura 1D) no cenário de diminuição da expressão Dicer (Figura 1C). Apesar das mudanças na morfologia, não foi observada co-expressando células de amilase e elevados níveis de CK19 como observado em células acinares submetidos Kras ADM accionado (Figura S3), o que sugere que as células acinares desorganizadas não foram submetidos activamente ADM.
(A). Hematoxilina e Eosina (H E) coloração de três semanas pâncreas idade de
Dicer
camundongos Het Comprar e
Dicer
Homo
. (A) ácinos, (D) adesiva, e ilhotas (I). A barra de escala 100? M. (B) Imunofluorescência para amilase (vermelho), CK19 (verde), e insulina (azul) em 3 semanas de idade
Dicer
Het
e
Dicer
Homo
ratos. A barra de escala 100? M. (C). Redução da expressão de Dicer em 3 semanas em RNA extraído a partir de tecido de pâncreas genótipos indicados. Média ± DP, n = 3. (D). massa Pâncreas: rácio de peso corporal em 3 semanas em os genótipos indicados. P-valores são calculados a partir de duas caudas, não pareado testes t comparando
Dicer
Het Comprar e indicados genótipos. (Média ± SD,
Dicer
Het
n = 17,
Dicer
Homo
n = 14,
Kras; Dicer
Het n = 9, Kras ; Dicer
Homo n
= 14). (E). H E coloração de 3 semanas de idade
Kras; Dicer
Het
e
Kras; Dicer
Homo
ratos. Inserções: E-esquerda, foco rara de metaplasia e PanIN; direita, metaplasia ductal in
Kras; Dicer
Homo
ratos. A barra de escala 100? M. (F) Imuno-histoquímica para amilase, Sox9, CK19 em 3 semanas de idade
Kras; Dicer
Het
e
Kras; Dicer
Homo
ratos. barra de escala 100 mm
Para testar o efeito da perda de Dicer em Kras transformação pancreático impulsionado, geramos
Pdx1-Cre
tardia.; LSL-Kras
G12D; Dicer
Flox /Flox
(
Kras; Dicer
Homo
) camundongos. Assim como outros modelos de segmentação mutante Kras ao pâncreas embrionário,
Pdx1-Cre
tardia; LSL-Kras
G12D
ratos desenvolver gradualmente ADM, bem como PanINs, com PDA provenientes de alguns animais após longa latência [23]. Semelhante a tais modelos [1], com 3 semanas de idade, massa pâncreas em
Pdx1-Cre
tardia; LSL-Kras
G12D; Dicer
flox /+
(
Kras; Dicer
Het
) ratos foi ligeiramente, mas significativamente, aumento em relação ao
Dicer
Het
ratos (Figura 1D ). O compartimento exócrina em
Kras; Dicer
Het
camundongos pareciam grosseiramente normal, predominantemente composto de células acinares positivos amilase, com áreas raras de ADM negativo amilase e PanINs baixo grau expressam níveis moderados a elevados de CK19 e Sox9 (Figura 1F), ductal /embrionária pancreático marcadores progenitoras característicos da ADM Kras conduzido e formação PanIN [6]. Em contraste,
Kras; Dicer
Homo
pancreata exibido diminuição da expressão Dicer (Figura 1C), foram atrófica (Figura 1D), e possuía a substituição generalizada do compartimento de exócrina com estruturas de dutos metaplásicas semelhante a ADM rara em
Kras; Dicer
Het
ratos (Figura 1E). metaplasia ductal in
Kras; Dicer
Homo
ratos exibidos diminuição da expressão de amilase, baixa expressão de CK19 a moderada e forte expressão de Sox9 (Figura 1F). acumulação Sox9 também foi observado em estruturas de contenção alguns morfologia acinar (Figura 1F). metaplasia ductal não foi observada em P0 no
Kras; Dicer
Homo
ratinhos (Figura S1d), o que sugere que a deficiência de Dicer no contexto de Kras mutante não bloquear o desenvolvimento embrionário acinar, e ADM ocorre entre o nascimento e 3 semanas de idade. Portanto, a perda de Dicer no contexto do mutante Kras acelera dramaticamente ADM, um processo que tem sido demonstrado que tanto precedem e promover a formação conduzido Kras PanIN [4], [6], [24].
Dicer Perda Compromises acinar Identidade e promove Kras Impulsionada acinar para ductal Reprogramação
para explorar porque
Kras; Dicer
Homo
ratos sofrem acelerada Kras ADM impulsionado, perguntamos se Dicer células acinares deficiente inadequadamente exibir propriedades associadas a ADM, tais como marcadores de estresse acinar e perda de identidade acinar. Para se concentrar em células que tinham sido submetidos a recombinação Cre incluímos um alelo YFP induzível Cre expressa condicionalmente a partir do locus Rosa26 (
R26-EYFP). YFP coloração revelou que tanto o compartimento de exócrina em
Pdx1-Cre
tardia; Dicer
Flox /Flox; R26-EYFP
(
Dicer
Homo; YFP
) ratos e ADM no
Pdx1-Cre
tardia; LSL-Kras
G12D; Dicer
Flox /Flox; R26-EYFP
(
Kras; Dicer
Homo; YFP
) camundongos derivadas de células em que Cre estava ativo, e não de expansão de uma população un-recombinado (Figura 2B, D).
(a-D) Clusterin (azul) e YFP (verde) coloração em 3 semanas de idade
Dicer
Het; YFP
(A),
Dicer
Homo; YFP
(B),
Kras; Dicer
Het; YFP
(C), e
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratinhos (D). barra de escala 100 mm (e) Análise de RT-PCR de Dicer, miRNA-141 e 216B (à esquerda), acinares enriquecido genes amilase e Mist1 (centro), e genes duto enriquecido CK19 e Sox9 (direita) da YFP +, CD49f +, CD133- células de
Dicer
Het; YFP
(n = 4),
Dicer
Homo; YFP
(n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP
(n = 3), e
Kras; Dicer
Homo; YFP
(n = 3) ratinhos. A média ± SD. P-valores são calculados a partir de dois de cauda, desemparelhados t-testes comparando
Dicer
Het
e
Dicer
Hom °
valores de expressão CK19 e Sox9.
para determinar se a perda de Dicer levou a acinar estresse associado com a ADM, examinamos expressão de clusterina, um marcador de estressado, acini diferenciados-de [6], [25]. Clusterina foi principalmente ausente em YFP + células acinares de controle
Dicer
Het; YFP
e
Kras; Dicer
Het; YFP
ratos, mas estava presente em rara YFP + ADM no
Kras; Dicer
Het; YFP
animais (Figura 2A, C). Não sugerindo que as células deficientes Dicer estão sob estresse observado em ADM, clusterina só foi uniformemente observada em YFP + ADM no
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratos, mas também amplamente expresso em YFP + células acinares em
Dicer
Homo; YFP
animais (Figura 2B, D).
Para testar se o stress acinar correspondeu com a diminuição da identidade acinar, modificamos um protocolo de triagem previamente desenvolvido para o isolamento de células progenitoras pancreáticas [26] para separar especificamente acinar diferenciada e células ductais. Descobrimos que no pâncreas adultos, ácinos e ductos adulto expressar a epitelial marcador CD49f, enquanto dutos diferenciados também expressam CD133 (Figura S4B, C). RT-PCR para
amilase
e
Mist1
, e
CK19
e
Sox9
, enriquecida em células acinares e do duto, respectivamente, revelou que de classificação com base em CD49f e CD133 permitido para separação eficiente dessas populações (Figura S4A, 4D). Expressão de efectores Notch Hes1, Hey1 e Hey2, restrito a centroacinar e células do ducto terminal no pâncreas adultos [27], apareceu para segregar com o CD49f + CD133 + população duto (Figura S4E).
YFP +, CD49f + células CD133- foram ordenados de todos os 4 genótipos. Aos 3 semanas de idade níveis Dicer e expressão de 2 miRNAs abundantemente expressas foram consideravelmente reduzidas em células separadas de
Dicer
Homo; YFP
e
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratinhos comparada com controles com e sem Kras (Figura 2E esquerda). Para determinar o efeito da perda de diferenciação em Dicer exócrina, foi analisada a expressão de marcadores Amilase acinares e Mist1 e os marcadores de condutas CK19 e Sox9, +, CD49f + CD133- células em YFP. células de
Dicer
Homo classificadas; YFP
ratos exibido diminuiu consideravelmente expressão de
amilase Comprar e diminuiu modestamente
Mist1
comparação com células de
Dicer
Het; YFP
ratinhos (Figura 2E meio). Embora a expressão de marcadores de diferenciação acinar foram reduzidos, não observamos um aumento consistente nos marcadores ductal
CK19
ou
Sox9
nessas células (Figura 2E direita), semelhante à falta de generalizada misexpression CK19 observado na Figura 1D. Em células CD49f + CD133- de
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratos no entanto,
amilase
e
Mist1
expressão foi reduzida ainda mais, e
CK19
e
Sox9
expressão foi aumentado, em comparação com células . de todos os outros genótipos, em consonância com o aumento histológico em ADM
Curiosamente, também observamos um modesto, mas estatisticamente não significativa, tendência de redução na expressão Mist1 em células separadas de
Kras; Dicer
Het; YFP
ratos em comparação com
Dicer
Het; YFP
controlos, sugerindo que Kras mutantes por si só pode iniciar a comprometer a identidade acinares antes da indução de genes ou morfologia ductal. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a perda de Dicer compromete a identidade acinar e induz um estado salientou que acelera Kras impulsionado reprogramação ductal e ADM.
Dicer Loss não acelera PanIN ou Desenvolvimento PDA
Perda de acinar identidade e a ADM acelera o desenvolvimento PanIN [6], [24], [28], [29] e a ADM um desenvolvimento acelerado e PanIN, induzida por pancreatite aguda e crónica, por exemplo, pode resultar em latência PDA diminuiu [30], [31] , [32]. Portanto, espera-se observar um desenvolvimento mais rápido PanIN e PDA no
Kras; Dicer
Homo
camundongos em relação ao controle
Kras; Dicer
Het
ratos. Apesar da enorme diferença na ADM observada em 3 semanas em
Kras; Dicer
Homo
comparação com
Kras; Dicer
Het
ratos, quantificação de lesões pancreáticas intraepiteliais em um pequeno grupo de ratos em 9 semanas não revelou nenhuma diferença estatisticamente significativa na freqüência de lesões ductais positivos Alcian Blue, sugerindo que a perda Dicer não acelerar o desenvolvimento PanIN (Figura 3A , B, C). progressão da doença a longo prazo também convergiram independente do estado Dicer condicional. Não houve diferença estatisticamente significativa na sobrevivência de um pequeno grupo de idade
Kras; Dicer
Homo
e
Kras; Dicer
Het
ratos (sobrevivência média 336 contra 441,5 dias, χ
2 = 0,2271, p = 0,6637, calculada pelo teste de Logrank) (Figura 3F). 6/7 de
Kras; Dicer
Het
ratinhos desenvolveram localmente ou amplamente PDA invasivo que era geralmente moderadamente diferenciado, mas incluiu um câncer indiferenciado. 4 de 6
Kras; Dicer
Homo
ratinhos desenvolveram moderadamente diferenciado, localmente ou amplamente invasiva, PDA com frequência similar de metástases e morfologia celular (Figura 3D, E, Tabela S1).
(A-B) Representante Alcian coloração azul em 9 semanas em
Kras; Dicer
Het
(A) e
Kras; Dicer
Homo
ratos (B). f: gordura. A barra de escala 100? M. C, quantificação de lesões positivas azul de alcião de 9 semanas de idade
Kras; Dicer
Het
e
Kras; Dicer
Homo
ratos. As linhas indicam os meios. P-valor calculado a partir de uma de duas caudas, teste t não pareado. (D, E) histologia Representante do PDA de
Kras; Dicer
Het
(D) e
Kras; Dicer
Homo
ratos (E). A barra de escala 100? M. curva (F) Sobrevivência do
Kras; Dicer
Het
(n = 7) e
Kras; Dicer
Homo
(n = 6) ratos.
Dicer células excluídas foram mostrados para ser sem competitividade por células unrecombined em outros órgãos derivados da endoderme, no fígado, por exemplo, [33] e eliminação de células recombinadas poderia contribuir para a ausência de diferença esperada na progressão da doença em
Kras; Dicer
Homo
contra
Kras; Dicer
Het
ratos. Em contraste com o ponto de tempo três semanas quando as células acinares normais eram muito menos frequentes em
Kras; Dicer
Homo
contra
Kras; Dicer
Het
ratos, áreas consideráveis de tecido acinar normal foram encontrados em Kras; Dicer
H
o
m
o
ratos, neste ponto do tempo (Figura 3A, B). Observamos, também, a presença de gordura substituir o tecido do pâncreas em algum
Kras; Dicer
animais Homo
(Figura 3B). Exame de tecido distribuição YFP no pâncreas de
Kras; Dicer
Het; YFP
contra
Kras; Dicer
Homo; YFP
animais revelou uma diminuição notável na distribuição YFP em 9 semanas (Figura S5), sugerindo repovoamento com células que não tinham sofrido recombinação. Portanto, apesar de inicialmente promover a ADM que normalmente acelera PanIN PDA e desenvolvimento, progressão de PDA não é substancialmente aumentada na ausência de Dicer e podem estar associados com deficiência de selecção contra Dicer.
Perda Dicer Compromises viabilidade durante Kras Conduzido ADM
perda de Dicer leva a um aumento da apoptose num certo número de órgãos endodérmicas (por exemplo, fígado e intestino delgado [33], [34] para resolver se a falta de aceleração previsto de desenvolvimento PanIN em
Kras; Dicer
Homo
ratos pode envolver aumento da morte celular, auditamos TUNEL + /YFP + células a 3 semanas de idade em contraste com as células positivas duplas raras em
Dicer
Het;. YFP
e
Kras; Dicer
Het; YFP
ratos,
Dicer
Homo;. YFP
ratos exibido uma taxa relativamente maior de TUNEL + /YFP + células (Figura 4B, E) Além disso, encontramos um aumento adicional de células positivas duplas em
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratos em comparação com
Dicer
Het; YFP
e
Kras; Dicer
Het; YFP
ratinhos (Figura 4D, E). Curiosamente, a perda Dicer apareceu a sinergia com KRAS mutado para promover a morte celular, como
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratos exibiram significativamente mais apoptose que
Dicer
Homo; YFP
células (Figura 4E). Portanto, enquanto o processamento Dicer intacta constrange Kras impulsionado acinar para ductal reprogramação, alguns sinais dependentes Dicer pode ser necessária para manter a viabilidade durante metaplasia Kras conduzido.
(A-D) TUNEL (azul) e YFP (verde) coloração em 3 semanas de idade
Dicer
Het; YFP
(A),
Dicer
Homo; YFP
(B),
Kras; Dicer
Het; YFP
(C), e
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratinhos (D). A barra de escala 100? M. E. Quantificação de TUNEL + + YFP células em (A-D). A média ± SD.
Dicer
Het; YFP
(n = 3),
Dicer
Homo; YFP
(n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP
(n = 3), e
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratinhos (n = 4). P-valor calculado a partir de uma de duas caudas, teste t não pareado de TUNEL + células YFP + em
Dicer
Homo; YFP
e
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratos. F. acinares enriquecido e viabilidade genes de análise de expressão (esquerda) associada. análise de RT-PCR de Nupr1, Agr2, Itih4 e Reg3b em acinar células de
Dicer
Het enriquecido; YFP
(n = 4),
Dicer
Homo; YFP
(n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP
(n = 3), e
Kras; Dicer
Homo; YFP
(n = 3) ratos (direita). A média ± SD. P-valor calculado a partir de uma de duas caudas, teste t não pareado comparando expressão Agr2 em células classificados do
Dicer
Het; YFP
e
Kras; Dicer
Het; YFP
ratos.
Foi realizada análise de expressão para a tela de fatores dependentes Dicer potencialmente envolvidos na manutenção da viabilidade durante Kras ADM conduzido. Para sincronizar melhor ADM no
Kras; Dicer
Het
e
Kras; Dicer
Homo
ratos, utilizamos ceruleina pancreatite aguda induzida. Como previsto a partir de estudos anteriores [6], Ceruleína tratamento no controle, 3 semanas de idade
Kras; Dicer
Het
ratinhos levaram ao desenvolvimento da conduta de estruturas semelhantes a 2 dias após o tratamento (Figura S6A), e substituição generalizada do compartimento de exócrino com ADM, PanINs, fibrose e, 21 dias após o tratamento (Figura S6C). Espelhando a falta de desenvolvimento acelerado PanIN entre 3 e 9 semanas no
Kras; Dicer
Homo
ratinhos (Figura 3F), observou-se menos metaplasia e tecido acinar consideravelmente mais normal 21 dias após o tratamento ceruleina em
Kras; Dicer
Homo
ratinhos (Figura S6D). RNA-Seq Análise de RNA reunidos a partir de FACS isolado YFP +, CD49f +, células acinares CD133- a partir de 3 semanas de idade
Kras; Dicer
Het; YFP
(3 ratos) e
Kras; Dicer
Homo; YFP
(5 ratos) ratos 2 dias após ceruleina (Figura S6E) revelou ~ 120 genes reprimidos de forma significativa entre mutante e controle. Apoiar a observação de que a perda de Dicer compromete diferenciação acinar, 42 genes associados com células acinares terminalmente diferenciadas foram significativamente subregulado (Figura 4F, Tabela S2, conjunto completo de dados Tabela S3). Também foram reduzidos genes implicados na manutenção da viabilidade durante a regeneração ou tumorigénese, incluindo Nupr1 /P8, Agr2, Itih4 e membros da família de proteínas REG3 (Figura 4F, Tabela S2). Recentemente, tanto Nupr1 e Agr2 foram mostrados para ser sobre-expressa durante a progressão PanIN-PDA e para desempenhar um papel no desenvolvimento e manutenção PanIN PDA viabilidade [35], [36], [37]. a expressão da proteína da família REG3 é activada em resposta a pancreatite [38], e um membro da família Reg3b (também conhecido como PAP1) especificamente está implicada na manutenção da viabilidade acinar e pode actuar a jusante de Nupr1 [39], [40]. Embora Itih4 não tem sido implicada no desenvolvimento de PDA, tem sido mostrado para ser envolvido na manutenção da viabilidade a jusante do PDA mediador c-myc fundamental [41] num modelo de cancro do fígado [42]. A análise de RT-PCR destes genes candidatos em ácinos classificados de ratos três semanas de idade, revelou que a sua expressão inversamente correlacionada com a apoptose (Figura 4F, direita). Nupr1, Agr2, Itih4, e expressão Reg3b foi reduzida em células classificados do
Kras; Dicer
Homo; YFP
camundongos em relação ao controle
Dicer
Het; YFP
e
Kras; Dicer
Het; YFP
animais. Além disso, Agr2, expressão Itih4 e Reg3b foi reduzida em células separadas de
Dicer
Homo; YFP
ratos em comparação aos controles. Curiosamente, Agr2 também foi significativamente aumentada em células separadas de
Kras; Dicer
Het; YFP
ratos em comparação com células de
Dicer
Het; YFP
camundongos, sugerindo que Kras pode contribuir para Agr2 upregulation mesmo antes ADM ocorre. Portanto, a expressão Dicer é necessário para a manutenção do estado de diferenciação acinar maduro e para a expressão de genes pró-viabilidade durante Kras ADM conduzido.
Mouse PDA pode se desenvolver na ausência de Dicer
Dicer níveis foram mostrados para ser reguladores importantes da tumorigénese, actuando como um supressor de tumor haploinsufficient no contexto de Kras mutantes em ambos os tumores do pulmão e sarcomas, bem como em retinoblastoma [13], [14]. No entanto, os tumores nestes modelos parecem resultar de células que retiveram a expressão de pelo menos um alelo unrecombined condicional. Para determinar se as células deficientes Dicer eram capazes de contribuir para Kras PDA impulsionado testamos expressão Dicer e recombinação genômica de 3 linhas celulares PDA gerados a partir de
Kras; Dicer
Het
e
Kras; Dicer
Homo
ratos. Por RT-PCR, observou-se expressão Dicer semelhante em todas as três linhas de células derivadas de PDA
Kras; Dicer
Het
ratos (Figura 5A). Devido à elevada taxa de apoptose observada às 3 semanas de idade, a redução da expressão de genes que suportam o desenvolvimento PanIN, e a falta de progressão da doença acelerada, que se esperava observar a retenção de pelo menos um alelo em linhas PDA derivados de
Kras; Dicer
Homo
PDA. Surpreendentemente, descobrimos que uma linha exibida diminuiu drasticamente expressão Dicer, enquanto os dois restantes linhas expressou um nível semelhante, ou superior, como
Kras; Dicer
Het
linhas derivadas. PCR alelo específico revelou que Dicer recombinação correlacionada diretamente com a expressão (Figura 5B: “Undel”, sem condicional Dicer alelo recombinação; “Hemi”, recombinação de um alelo; “Homo”, recombinação de ambos os alelos). RT-PCR para 3 miARNs maduros relatada como sendo sobre-expresso em PDA humano [43], [44] revelaram uma redução em todos os 3 miARNs na linha suprimido homozigótica para menos de 95% do que expressa na linha não apagada (Figura 5C) . Portanto, Kras PDA accionado no rato parece ser capaz de evadir selecção negativa durante o início da doença e desenvolvem na ausência de Dicer. Como previsto a partir de modelos que demonstram que a regulação negativa, mas não a perda completa de processamento de miARN, pode melhorar a tumorigénese [12], [13], a linha hemizigótica suprimido cresceu mais depressa, enquanto o homozigoto suprimido linha mais lento (Figura 5D). Todas as 3 linhas de células também foram capazes de formar tumores quando implantados por via subcutânea em ratos imunodeficientes, com uma cinética que espelham as taxas de crescimento de cultura de células (Figura 5E). PCR específica para o alelo revelou que os tumores não resultaram a partir de células que sofreram recombinação espontânea (UnDel, hemi), ou a partir de uma sub-população contaminante de células competentes Dicer (homo), mas fez observar a presença do fragmento amplificado WT Dicer em tumores derivados da hemi e Homo linhas, indicativo de recrutamento estromal host (Figura 5F). Portanto, embora a eliminação Dicer prejudica a viabilidade durante as primeiras fases de neoplasia Kras conduzido, perda de Dicer não é mutuamente exclusiva com a transformação de pâncreas.
A. Dicer RT-PCR em linhas celulares PDA gerada a partir de
Kras; Dicer
Het
(azul) e
Kras; Dicer
Homo
(vermelho) camundongos. Cada barra representa os dados a partir de 3 poços independentes de cada linha celular. A média ± SD. B. PCR detecção de WT, unrecombined (UNREC) e suprimiu lócus genômico (DEL) Dicer em linhas celulares de A. Controles são amplificados DNA a partir de fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) de indicados genótipo Dicer após o tratamento Cre adenoviral. C. miARN QPCR para miARN-16, 107, 191 em linhas celulares derivadas de
Kras; Dicer
Homo
ratos. Cada barra representa 3 poços independentes de cada linha celular. A média ± SD. D. Crescimento de linhas celulares PDA derivados de
Kras; Dicer
Homo
ratos. Cada ponto representa os valores a partir de 3 poços independentes. A média ± SD. P-valor calculado a partir de uma de duas caudas, teste-t não emparelhado comparando o número de células em 72 horas em culturas de células e Undel sapiens. o crescimento do tumor E. subcutânea de linhas celulares PDA derivados de
Kras; Dicer
Homo
ratos. A média ± SD em cada ponto temporal. Undel (n = 7), hemi (n = 7), Homo (n = 12). F. PCR detecção de WT, UNREC e DEL Dicer lócus genômico em tumores subcutâneos no momento do sacrifício em E. Os controles são Dicer
fl
o
x /+ MEFs tratados com Cre adenoviral como em B. Tumor os DNAs são precedidos por amplificação de DNA a partir de linhas celulares parentais.
Discussão
Dicer função é essencial para o desenvolvimento de vários órgãos, incluindo os tecidos derivados de endoderme, tais como o fígado e o gut [33], [34]. Manutenção de expressão Dicer em progenitores positivos pancreáticas Pdx1 iniciais é necessária para o desenvolvimento tanto da endócrinas exócrinas pancreáticas e compartimentos [20]. Aqui, nós achamos que a função Dicer continua a ser importante durante o desenvolvimento do pâncreas e desempenha um papel na regulação da identidade acinar e viabilidade. O modelo utiliza um controlador de linha que inicia recombinação Dicer no pâncreas em desenvolvimento numa fase embrionária mais tarde do que o condutor utilizado por Cre Lynn e colegas [21]. Observamos efeitos brutos mínimos sobre o desenvolvimento do pâncreas, sugerindo requisitos fase sensível para o processamento de miRNA no estabelecimento e expansão exócrinas e endócrinas progenitores. No entanto, as células acinares que se desenvolvem são instáveis tanto em relação à sua diferenciação terminal e viabilidade. Elementos da identidade acinar são reprimidos e estresse celular e apoptose são ambos aumentado. Portanto, processamento de miRNA competente parece permanecer importante, mesmo no compartimento exócrina maduro.
Porque Dicer eliminação neste modelo permite o desenvolvimento pancreático fomos capazes de explorar o papel da função de Dicer em Kras desenvolvimento PDA mediada. modelos de ratinho revelaram que Kras oncogénicos podem actuar como um “regulador mestre” de desenvolvimento PDA, que estabelece linhagens que podem dar origem a PanINs e PDA e restante crítico para a progressão do [1], [2], [3]. Evidência considerável indica que as células acinares podem dar origem a PanINs submetendo-se a ADM, a um processo durante o qual as células acinares perder diferenciação terminal à custa de uma conduta, diferenciam-de como o estado [4], [5], [6], [7 ]. Kras ADM impulsionado ocorre de forma gradual, mas pode ser acelerado por comprometer a diferenciação acinar. Agressões tais como a pancreatite, o que faz com que a regeneração desdiferenciação associada [6], [45], a activação de progenitoras associadas vias (por exemplo, do entalhe [24]), e inactivação de genes que mantêm o estado acinar [28], [29], [46] tudo acelerar dramaticamente Kras ADM conduzido e desenvolvimento PanIN. Portanto, a perda de identidade acinar pode ser uma barreira chave para Kras especificação dependente de acinares derivados precursores PDA. Nossos dados sugerem que a perda da função Dicer remove a barreira diferenciação para ADM Kras conduzido. ADM ocorre em 3 semanas em
Kras;