Abstract

Fundo

O câncer de pâncreas é uma doença letal com uma taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 1-5 %. A aceleração do exame histológico intraoperatória seria benéfico para uma melhor gestão do câncer de pâncreas, sugerindo um aumento na sobrevida. métodos ópticos não-lineares baseados em dois fótons de fluorescência animado (TPEF) e geração de segundo harmônico (SHG) de biomarcadores ópticos intrínsecos mostrar a capacidade de visualizar a morfologia dos tecidos frescos associados à histologia, o que é promissor para avaliação em tempo real intra-operatório de câncer de pâncreas .

Metodologia /Principais achados

a fim de investigar se os métodos de imagem ópticos não-lineares têm a capacidade de caracterizar histologia pancreática em resolução celular, estudamos diferentes tipos de tecidos pancreáticos usando livre-label TPEF e SHG. Em comparação com outros métodos de rotina para a preparação de amostras, sem tratamento de tecidos frescos foram encontrados para ser mais adequado para imagiologia óptica não-linear de tecidos pancreáticos. A morfologia detalhada do pâncreas de rato normal foi observada e relacionada com as imagens histológicas padrão. Em termos comparativos, as imagens preliminares de um pequeno número de tecidos de cancro do pâncreas induzida por químicos mostraram diferenças neoplásicas visíveis na morfologia das células e a matriz extracelular. Os xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneos foram ainda observados utilizando o microscópio óptico não linear, que mostra que a maioria das células são leucócitos aos 5 dias após a implantação, as células tumorais começam a proliferar em 10 dias após a implantação, e as fibras de colagénio extracelular tornar desordenada como os xenoenxertos de crescer.

Conclusões /Significado

neste estudo, imagem óptica não-linear foi utilizado para caracterizar os detalhes morfológicos de tecidos pancreáticos frescos pela primeira vez. Nós demonstramos que é possível fornecer em tempo real avaliação histológica do cancro do pâncreas pelos métodos de óptica não linear, as quais apresentam uma oportunidade para a caracterização do progresso de cancro do pâncreas e ainda mais espontânea aplicação de uma forma não invasiva.

Citation: Hu W, Zhao G, Wang C, Zhang J, Fu L (2012) Nonlinear Optical Microscopy para Histologia of Fresh normais e cancerosos do pâncreas tecidos. PLoS ONE 7 (5): e37962. doi: 10.1371 /journal.pone.0037962

editor: Irene Georgakoudi, Tufts University, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro de 2012; Aceito: 26 de abril de 2012; Publicado em: 24 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Maior de Pesquisa científica da China (No. 2011CB910401), National Natural Science Foundation da China (No. 61.178.077), Programa de New Century excelentes talentos em University (No. NCET-08-0216), eo Fundamental Fundos de investigação para a Central Universidades (HUST: 2011JC046). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com uma taxa de sobrevida em 5 anos global de 1-5% [1]. Um tratamento melhor pode contribuir para uma melhoria significativa na sobrevida do paciente [2]. consulta intra-operatória que envolve, principalmente, o exame da amostra excisadas cirúrgicas, é importante para o cirurgião para determinar as opções de tratamento mais apropriadas [3]. No entanto, está sujeita às restrições de tempo. Um diagnóstico de congelação única com alto nível de precisão leva 20 minutos, e é muito mais tempo quando vários cortes congelados são obrigados a executar em um único espécime [3]. Em tempo real, a histologia dos tecidos frescos ou viver sem corte ou processamento adicional, não só facilitaria a criação imediata ou a confirmação de um diagnóstico e estágio intra-operatório que irá influenciar o procedimento cirúrgico, mas também torná-lo possível avaliar todas as margens cirúrgicas para que o tumor é removido completamente sem comprometer a parte normal do pâncreas. avaliação das margens cirúrgicas preciso permite a melhoria da sobrevivência a longo prazo, uma vez que as margens cirúrgicas positivas ocorrem entre 37-50% dos pacientes submetidos a ressecção cirúrgica ea sobrevida global desses pacientes varia entre 8 e 14 meses [4]. detecção em tempo real de padrões morfológicos na resolução de uma única célula, que é um análogo da histologia, indica uma perspectiva atraente para a gestão intra-operatório ideal de cancro do pâncreas com benefício de sobrevivência favorável.

métodos ópticos, aproveitando não-invasão e alta resolução tempo-espacial, pode conseguir

in vivo

de imagem e detecção em estudos biomédicos. Espectroscopia de Raman, que é baseado na diferença na energia do fotão incidente e espalhados devido às vibrações moleculares, é sensível às mudanças de composição química em células e tecidos. Foi aplicada à diferenciação de tecidos normais e cancerosos pancreáticos a partir de um modelo de rato [5]. E espectroscopia de fluorescência de reflectância pode fornecer informação bioquímica dos tecidos para distinguir tecidos pancreáticos humanos diferentes, incluindo tecido normal pancreática, pancreatite, e adenocarcinoma pancreático [6], [7]. modelos de interação Photon de tecidos foram desenvolvidos para fornecer links quantitativas entre as medidas de reflectância e de fluorescência e as características histológicas de tecidos pancreáticos humanos, tais como o tamanho nuclear [8], [9]. No entanto, os parâmetros espectrais são difíceis de ser directamente combinado com as características morfológicas revelados pelo exame histológico convencional, em particular as alterações da forma e organização da matriz extracelular nuclear. caracterização mais detalhada da morfologia do pâncreas com resolução celular usando métodos ópticos é necessário para melhorar a detecção de neoplasia de pâncreas, implicando um novo meio de histologia em tempo real.

Nos últimos anos, microscopia óptica não-linear (NOM), principalmente incluindo TPEF e SHG, emergiu como uma ferramenta poderosa para identificar alterações estruturais e funcionais ligeiras em resolução celular. NOM tem a vantagem de resolução submicron espacial, resolução temporal milissegundo, ea capacidade óptico seccionamento em tecidos turvas [10], [11]. Um importante carácter de tal modalidade de imagem é que os biomarcadores ópticos endógenos nos tecidos podem ser empregues para proporcionar o contraste, o que faz com que seja possível a detecção de doenças humanas, sem a necessidade de fixação, o seccionamento, ou coloração. Intrínseca de dois fotões animado de fluorescência biomarcadores (TPEF) incluindo dinucleótido nicotinamida adenina (fosfato) [NAD (P) H] e flavina-adenina-dinucleótido (FAD) foram aplicados para revelar a morfologia das células, uma vez que NAD (P) H e FAD são os principais fluoróforos no citoplasma [12], [13]. Enquanto isso, as fibras de colagénio, que são proteínas estruturais importantes na matriz extracelular (ECM), pode implementar o processo intrínseco segunda geração harmónica (SHG) em tecidos biológicos de modo a reflectir o padrão de ECM [12], [13]. Além disso, o NAD intracelular (P) H e FAD também estão relacionadas com a razão redox das células, o que pode ser utilizado como um indicador do nível metabólico das células [14], [15]. NOM tem sido amplamente aplicada para visualização das estruturas celulares e de tecidos diferentes em tecidos de cancro do ovário, incluindo, da bexiga, gástrico tecidos, e assim por diante [14], [16] – [20].

em primeiro lugar, para o nosso conhecimento , caracterizou os detalhes morfológicos de tecidos pancreáticos usando TPEF sem rótulo e técnicas de SHG. Em um esforço para avaliar a viabilidade da NOM para a caracterização morfológica detalhada de tecidos pancreáticos, aplicamos TPEF sem rótulo e técnicas SHG de pâncreas de ratos normais e relacionadas com imagens tradicionais de coloração histológica. Vários meios de rotina para a preparação das amostras foram comparadas para adquirir imagiologia óptica não-linear óptima dos tecidos pancreáticos. Os tecidos de cancro do pâncreas induzida por químicos foram ainda caracterizadas e comparadas com amostras normais pancreáticas para validar a capacidade de NOM a revelar as alterações neoplásicas. A fim de avaliar o potencial do TPEF livre rótulo e técnicas de SHG para caracterizar diferentes estágios durante o crescimento do cancro do pâncreas, os xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneas colhidas em diferentes pontos de tempo depois do implante, foram analisados ​​quantitativamente com base nas suas características morfológicas.

Materiais e Métodos

os modelos animais

Um modelo de câncer de pâncreas induzida por substância química que se desenvolve espontaneamente cancro maligno no pâncreas foi utilizado para comparação de tecidos neoplásicos para tecidos normais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia. cuidados com os animais foi fornecido de acordo com os procedimentos descritos no “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório”, publicado pelos Estados Unidos National Institutes of Health. Os ratos Sprague-Dawley machos (100-125 g) foram obtidos a partir do Centro de animal experimental Tongji Medical College (Wuhan, China). Os tumores foram induzidos de acordo com um protocolo estabelecido anteriormente [21]. Em resumo, a anestesia foi induzida com éter vaporizado, seguido 10 minutos mais tarde por uma injecção intramuscular de pentobarbital (20 mg /kg) e cetamina (50 mg /kg). Os ratos foram submetidos a uma laparotomia mediana com exposição do segmento cabeça do pâncreas. O parênquima foi incisada paralela ao curso do ducto biliar comum, e um bolso foi desenvolvido no parênquima pancreático no local da incisão. 5 mg de cristais DMBA foram implantados e seguros no lugar por meio de um 6-0 prolene bolsa-corda de sutura. Os tumores foram colhidos e fotografada em 9 meses após a indução. Recentemente excisada tecidos a partir de um total de 12 (10 2 normal e cancro induzida quimicamente) ratos foram analisados ​​e comparados.

atímicos (nu /nu) em ratinhos um fundo BALB /c, adquirido a partir de Xangai Laboratory Animal Center (Shanghai SLAC animais de Laboratório Co. Ltd), foram utilizados para o estabelecimento do modelo de tumor pancreático subcutânea. Os experimentos seguiram os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional animal Ética da Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia. Seis a ratinhos machos de oito semanas de idade, foram criados sob condições específicas isentas de agentes patogénicos (SPF), com a temperatura mantida a cerca de 21 ° C e humidade de 60-70%, com luz artificial, durante 12 h. Os xenoenxertos de tumor foram desenvolvidas a partir da linha celular PANC-1 estabelecidos (ATCC, Rockville, MD) [22]. Cerca de 6 × 10

6 células PANC-1 foram inoculadas por via subcutânea para a esquerda em branco e os xenoenxertos de tumores subcutâneos foram colhidas a 5, 10, 20, 30 dias após o implante, respectivamente. Um total de 20 ratinhos com xenoenxertos de tumores (5 ratos para cada fase) foram usadas para imagiologia e análise quantitativa.

Preparação do pâncreas espécimes

Os animais foram sacrificados com uma overdose de isoflurano, e, em seguida, os tecidos pancreáticos foram dissecados e fotografada. Antes de imagiologia, os tecidos excisados ​​de fresco, incluindo os pâncreas de ratos normais, os tecidos de cancro do pâncreas induzida por químicos e os xenoenxertos de tumores subcutâneos, foram incubadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Metade de cada espécime foi então imediatamente fotografada e da recolha de todas as imagens foi terminado dentro de 1 hora após a dissecação. A outra metade de cada espécime foi usado para análise histológica.

Para investigar as condições ideais para a imagem óptica não-linear dos tecidos pancreáticos, as imagens ópticas não-lineares de armazenados, tecidos frios fixos e rato criopreservados pancreáticas foram comparados com os dos tecidos frescos, respectivamente, uma vez que a estrutura dos tecidos pode ser mantida por meio da fixação e tem sido relatado que os componentes fluorescentes intrínsecas (NAD (P) H e FAD) pode ser detectado com um elevado grau de precisão abaixo -80 ° C [23]. Os tecidos pancreáticos frio armazenados foram armazenados em 4 ° C durante 4 horas, 12 horas e 24 horas após a excisão, respectivamente. Os tecidos fixados foram tratados com 4% de paraformaldeído em PBS, durante 19 horas. Os tecidos criopreservados foram congeladas a -196 ° C em azoto líquido durante pelo menos 30 minutos. Todos os tecidos foram transferidos para PBS após o processamento e depois trabalhada à temperatura ambiente.

imagiologia óptica não-linear

imagiologia óptica não-linear foi realizada usando um sistema modificado baseado em um microscópio comercial (FluoView 1000, Olympus , Japão) equipado com um laser de Ti: safira (Mai Tai, Spectra-Physics), com uma taxa de repetição de 80 MHz (Fig 1).. A saída 750-nm do sistema de laser foi usada para a excitação, excepto quando indicado em contrário. A potência média do laser sobre a superfície da amostra foi de cerca de 15 mW. A taxa de digitalização é de 10 uS /pixel. Os sinais emitidos são recolhidas pelo objectivo de focagem (60 × /1.2 NA de imersão em água, Olympus). Dois filtros passa-banda (FF01-380 /14-25 e FF01-445 /45-25, Semrock) foram empregados antes de os tubos fotomultiplicadores para detectar os sinais de SHG e TPEF, respectivamente. O sinal de SHG foi confirmada pela propriedade de dependência do comprimento de onda, desde que não havia nenhum sinal detectado no 380/14 nm gama de comprimentos de onda mais longo do que 780 nm. A renderização de volume 3D do ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, Maryland) foi utilizado para a apresentação da imagem.

Análise quantitativa do tamanho nuclear e colágeno

Para cada etapa do subcutâneo xenoenxertos de tumores pancreáticos, células 80 nas imagens ópticas não lineares foram visualmente escolhido e os diâmetros do núcleo foram medidos manualmente para estimar tamanhos nucleares. Os tamanhos médios nucleares para os xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneas colhidas em diferentes fases foram calculados, respectivamente.

Para a análise de colagénio, o teor de fibras de colagénio para cada amostra foi avaliado pela proporção do número de pixels que o colagénio fibras representam-se ao número total de pixels da imagem. 40 axiais imagens consecutivas a partir da superfície foram calculados para obter o valor teor médio para todas as amostras. O método cinzento matriz de co-ocorrência nível (GLCM), que é um método de análise de textura com base na estimativa da função de segunda ordem condicional conjunta de densidade de probabilidade [24], [25], foi usado para caracterizar a morfologia das fibras de colagénio.

a significância estatística foi calculada com contraste linear ANOVA utilizando o software SPSS (SPSS). Todos os valores de p de 0,05 ou menos foram considerados significativos referido como tal no texto.

Análise histológica

Os tecidos pancreáticos foram fixadas com formalina a 10% tamponada neutra, e secções embebidas em parafina com uma espessura de 5 um foram rotineiramente preparada. As secções de tecido foram posteriormente corados com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson, respectivamente. A coloração de hematoxilina-eosina foi utilizado para avaliar a morfologia celular, e tricromo de Masson foi usada para a detecção de fibras de colagénio em tecidos pancreáticos. imagens histológicas foram adquiridos utilizando um microscópio óptico (IX81, Olympus, Japão) equipado com um objectivo de 20 × ar e uma cor câmera digital industrial (DFK 41BU02, A fonte de imagem Europe GmbH, Alemanha).

Resultados e Discussão

Visualização de detalhes morfológicos de pâncreas normais de ratos

pâncreas é uma glândula importante tanto com funções endócrinas (Fig. 2a) com uma cápsula de tecido fino conectivo fibroso que enwraps parênquima pancreática exócrina e. A porção exócrina do pâncreas consiste em cachos de uva-like de células acinares pancreáticas chamados ácinos, que sintetizam e segregam enzimas digestivas no duodeno através de sistemas ductal. As células acinares pancreáticas mostram uma forma piramidal com citoplasma apical contendo grânulos de zimogénio e um núcleo proeminente situada perto da membrana da célula basolateral. A porção endócrina do pâncreas é responsável por cerca de 1-2% da massa total de pâncreas, e é composta de ilhéus pancreáticos dispersos que contêm grupos de diferentes tipos de células produtoras de hormonas.

(A) A organização anatómica do pâncreas de ratos normais é composta por ácinos exócrinas e ilhotas pancreáticas endócrinas. RBC: glóbulo vermelho. (B) A imagem óptica não-linear do pâncreas de ratos normais a uma profundidade de imagem de 6 mm. A estrutura de código de cores vermelho é o colágeno, e a cor verde para o componente fluorescente. barra de escala é de 30 mm. (C) A imagem óptica não-linear do pâncreas de ratos normais a uma profundidade de imagem de 23 mm. Os asteriscos, pontas de flechas e setas indicam os núcleos, células acinares, as fibras de colágeno, respectivamente. (D) A imagem óptica não-linear do pâncreas de ratos normais a uma profundidade de imagem de 27 mm. O círculo pontilhada indica o padrão de acini pancreática. (E) O ácinos pancreáticos pode ser observada na imagem hematoxilina e eosina. (F) trichrome imagem Mostra pequena quantidade de fibras colágenas da Masson são distribuídos ao redor do acini de amostras pancreáticas de rato normais.

A imagem óptica não-linear a uma profundidade de imagem de 6 mm mostra a cápsula de tecido conjuntivo fibroso na superfície do pâncreas (Fig. 2B), como indicado pelo sinal de SHG. No parênquima pancreático, os núcleos de células não fluorescentes aparecem regiões escuras e redondas localizadas perto da membrana celular basolateral (asteriscos na Fig. 2C) e a acinares pancreáticas indivíduo (setas na Fig. 2C), as células podem ser claramente identificados na camada superficial ácinos (profundidade da imagem de 23 mm). Além disso, uma pequena quantidade de fibras de colagénio (setas na Fig. 2C), distribuídas na matriz extracelular em torno do ácinos, que está em correspondência com as imagens coradas com tricromo de Masson (Fig. 2F). A Figura 2D mostra que as células acinares são dispostas num padrão (círculo tracejado) semelhante à montagem da estrutura dos ácinos exócrinos (Fig. 2A) na camada profunda (profundidade de imagem de 27 uM). Os cachos de uva-like das células acinares, também pode ser observado nas imagens correspondentes hematoxilina-eosina-coradas microscópicas (Fig. 2E). No entanto, em comparação com as imagens microscópicas ópticas não lineares, as imagens histológicas são difíceis de visualizar a cápsula fibrosa e da conformação 3-D das células acinares. Um filme suplementar também é fornecido para mostrar uma pilha de profundidade resolvida do pâncreas (S1 Video). Além disso, o arranjo 3-D das células acinares é ainda validado por coloração dos núcleos com um corante fluorescente (Figura S1). Os nossos resultados demonstram que a microscopia não linear tem a vantagem da visualização 3-D do pâncreas sem cortar tecido ou co-registo sobre os métodos histológicos.

O ilhéu de pâncreas normal é relatado para ser penetrado por uma densa rede de capilares e rodeado por uma cápsula de colagénio finas e folha glial que separa as células endócrinas exócrinas do componente [26]. No entanto, não houve qualquer padrão semelhante para as ilhotas presentes nas imagens ópticas não-lineares, possivelmente por causa da escassa população de ilhotas. Maior área de imagem com corantes específicos pode facilitar ainda mais a identificação da estrutura dos ilhéus pancreáticos.

Os resultados provam que a fluorescência intrínseca dos TPEF células pancreáticas e o sinal de SHG das fibras de colagénio na matriz extracelular pode visualizar a morfologia das células pancreáticas e componentes extracelulares por meio de microscopia óptica não linear.

Origem de contraste intrínseca

está bem documentado na literatura que as principais fontes de sinal TPEF no citoplasma são NAD (P) H e de FAD com espectros de emissão que o pico a 460 nm e 530 nm, respectivamente [13], [14], [27]. Detectamos a autofluorescência na gama de 500-550 nm no comprimento de onda de excitação de 750 nm e descobriram que a intensidade é muito menor do que na gama de 425-470 nm (dados não mostrados). Uma vez que os fluoróforos intrínsecas mostram forte emissão no canal de 425-470 nm quando excitado a 750 nm, especula-se que a fluorescência intrínseca dos tecidos pancreáticos vem principalmente de NAD (P) H, e FAD tem um contributo menor para a emissão intrínseca.

colagénio fibrilar foi reportado para mostrar uma estrutura não-centrosymmetrical, tornando-se assim um contribuinte principal para o sinal de SHG nos tecidos biológicos [13], [28]. De acordo com a morfologia e a distribuição das fibras reveladas pelas imagens SHG, é esperado que a origem do sinal de SHG a partir do pâncreas de ser as fibras de colagénio na matriz extracelular.

As condições ideais para imagiologia intrínseca dos tecidos pancreáticos

foi relatado que a concentração de NAD (P) H e FAD está associado com a relação de redox, que é sensível a alterações na taxa metabólica celular e o fornecimento de oxigénio vascular [29]. Por conseguinte, temos fotografada 4 ° C armazenados, fixo, e cyropreserved tecidos pancreáticos para investigar as condições óptimas para a imagiologia óptica não-linear dos tecidos pancreáticos. Em comparação com os tecidos frescos (Fig. 3a), as imagens ópticas não lineares dos tecidos pancreáticos armazenados em 4 ° C durante 4 horas mostram a morfologia dos ácinos do pâncreas com menor contraste (Fig. 3B). Apenas algumas células pancreáticas podem ser observados com a diminuição da intensidade de fluorescência no tecido pancreático armazenado em 4 ° C durante 12 horas (FIG. 3C)), enquanto que a fluorescência intrínseca se tornar insignificante e as células podem ser mal identificados por aqueles armazenados em quatro ° C durante 24 horas (Fig. 3D). A redução da intensidade da fluorescência intrínseca e a perda das células pancreáticas podem resultar a partir da diminuição da viabilidade dos tecidos pancreáticos sob a privação de oxigénio e de nutrição após ressecção. Particularmente, o processo de autodigestão induzida pela lesão do pâncreas podem provavelmente acelerar o dano dos tecidos pancreáticos.

A fluorescência intrínseca de (A) os tecidos frescos, tecidos armazenados em 4 ° C para (B) 4 horas, (c) 12 horas, e (d) 24 horas, (e) os tecidos fixos, bem como (F) Os tecidos congelados foram detectados. barra de escala é de 30 mm.

Figura 3E mostra que a organização do acini pancreática intacto foi preservado após a fixação. No entanto, a intensidade da fluorescência diminuída significativamente, possivelmente devido à desnaturação da proteína durante o processo de fixação e as alterações nas concentrações de quencher [29]. Em comparação, os tecidos criopreservados pancreáticas mostrou ainda mais baixa fluorescência na Figura 3F, uma vez que o NAD celular (P) H, podem desaparecer por causa da morte das células após a congelação e descongelação até à temperatura ambiente durante a imagem

.

A resultados anteriores mostram que a morfologia dos tecidos pancreáticos podem ser delineadas com mais precisão por imagiologia de tecidos frescos, sem processamento adicional. Portanto, os tecidos pancreáticos foram incubadas em PBS fresco foram utilizados para a análise subsequente. Nós também investigaram o comprimento de onda de excitação óptimo para a imagiologia óptica não-linear dos tecidos pancreáticos, uma vez que a fluorescência intrínseca é relativamente fraca. O comprimento de onda de excitação é sintonizado na faixa de 730-840 nm realizar imagem tecido pancreático. Verificou-se que a 750 nm era o comprimento de onda óptimo para o sistema de imagem microscópica utilizou. A potência do laser sobre a superfície das amostras foi testado para obter imagens com elevada relação sinal-ruído. No caso de uma potência média de cerca de 15 mW, não houve fotodano visível ou fotobranqueamento após a aquisição de uma série de cortes axiais consecutivos.

a comparação dos tecidos normais e cancerosos pancreáticas

A tecidos de cancro do pâncreas induzida por químicos foram fotografadas e as imagens associadas com histológicos (Fig. 4). Em comparação com os pâncreas normal, tamanho nuclear e maior variação marcada em tamanho e forma nuclear pode ser observado nos tecidos de cancro do pâncreas induzida por químicos, que é coincidente com as características típicas de células cancerosas. Além disso, a densidade das fibras de colagénio aumentada, o que se assemelha a fibrose estromal manifestada intensiva em doentes com cancro pancreático [30]. As diferenças óbvias da aparência morfológica entre os tecidos de câncer de pâncreas induzida por químicos normal e indicam que os métodos ópticos não-lineares mostram a capacidade de detectar lesões neoplásicas em tecidos pancreáticos anormais.

As células de câncer de pâncreas (A) com vários tamanho e forma, bem como fibras de colagénio lineares podem ser identificadas na imagem óptica não linear. A estrutura de código de cores vermelho é o colágeno e a cor verde para o componente fluorescente. barra de escala é de 30 mm. A imagem hematoxilina e eosina (B) e (C) imagem tricrômico de Masson mostrar a morfologia dos tecidos pancreáticos cancerosas em correspondência com (A).

Crescimento dos xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneos

Os xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneas colhidos aos 5 dias após a inoculação é composto principalmente por fibras de colagénio e células pequenas onduladas que podem ser leucócitos (Fig. 5a). Em comparação, as células nos xenoenxertos tumorais colhidas aos 10 dias após a inoculação mostrar núcleos aumentados, o que indica que as células cancerosas começam a proliferar (Fig. 5B). Além disso, as fibras de colagénio são lineares e dispostos radiante a partir das células de cancro, que podem contribuir para a penetração do tumor ao longo das fibras. As quantidades de células tumorais aumentou nos tecidos tumorais colhidas aos 20 dias após a inoculação (Fig. 5C), ao mesmo tempo que diminuiu em colhidas aos 30 dias após a inoculação (Fig. 5D), o que implica que não é a necrose no centro do tumor . Como os xenoenxertos de desenvolver, as fibras de colagénio são mais fragmentadas e irregulares, e a densidade das fibras diminuída, que pode ser associada com a degradação e remodelação da matriz extracelular durante o crescimento dos xenoenxertos tumorais.

A xenoenxertos de tumores pancreáticos colhidas em diferentes fases, incluindo (a) de 5 dias, (B) 10 dias, (C) 20 dias, e (D), 30 dias após a implantação, foram fotografadas e relacionado com a histologia convencional. As imagens de SHG (vermelho cor-codificada), as imagens TPEF (cor verde-codificada), e o 3-D imagens sobrepostas SHG /TPEF são mostrados nas primeiras três colunas, respectivamente, enquanto as imagens hematoxilina e eosina e imagens com tricromo de Masson são apresentados nas duas últimas colunas. Todas as imagens 3-D é 211 uM × 211 uM × 50 mm. barra de escala é de 30 mm.

As imagens histológicas mostram que extensa necrose está presente nos xenoenxertos de tumores colhidos em 5 dias após a inoculação, e na maioria das células são neutrófilos, que contêm três ou quatro lobos nucleares (Fig. 5A). Aos 10 dias após a implantação, a maioria das células são células de tumor, e as fibras de colagénio são lineares longas abundantes presente (Fig. 5B). Aos 20 dias após o implante, elevada densidade de células tumorais e pode ser visto relativamente menor teor de fibras de colagénio ocorre (Fig. 5C). Finalmente, no dia 30 após o implante, necrose espalhados pode ser observado na região central do tumor (Fig. 5D). Verificou-se que os resultados de TPEF livre rótulo e imagiologia de SHG são consistentes com os métodos de coloração histológicos tradicionais.

A análise quantitativa do tamanho nuclear mostra que o diâmetro dos núcleos das células colhidas aos 10 dias após a inoculação cai entre que foi colhida em 5 dias (cerca de 6 ^ m) e as colhidas após 20 dias (principalmente variaram entre 10 uM e 13 uM). Isto indica que o proporation de células tumorais aumenta a neutrófilos como os xenoenxertos de crescer (figura 6, p . 0,001, ANOVA contraste linear entre o tamanho de 5 dias e os 20 dias depois; n = 5 para cada grupo). Ele revela que o tamanho do núcleo das células pode ser obtida utilizando imagiologia óptica não-linear, a qual é importante para a detecção de células tumorais. A densidade das fibras de colagénio foi também calculada para os xenoenxertos tumorais colhidas em diferentes fases, respectivamente. Pode ser visto que a quantidade das fibras de colagénio decresce gradualmente à medida que o tumor cresce e a densidade a 5 dias diferiram significativamente dos depois de 20 dias (Fig. 7a). Para a quantificação das alterações estruturais das fibras de colagénio, o método GLCM foi utilizada para análise da textura. Correlação é uma característica estrutural extraído de GLCM e pode ser usado para avaliar a direcção da textura. Como indica a Figura 7B, as curvas de correlação dos tecidos tumorais colhidas após 10 dias são mais baixos do que aqueles colhidos em 5 dias, o que corresponde às fibras de colagénio mais desordenados. A Corr

50, calculada pela distância de pixel em que a correlação caiu para 50% do valor inicial, é significativamente maior nos xenoenxertos colhidos em 5 dias, em comparação com as colhidas aos 10 dias, 20 dias e 30 dias (Fig . 7B; p = 0,035, ANOVA de contraste linear; n = 5 para cada grupo). Os resultados quantitativos acima são consistentes com a aparência visual das imagens ópticas não lineares.

O tamanho nuclear de 5 dias é significativamente inferior do que aqueles em 20 dias e 30 dias. *, P 0,001, ANOVA contraste linear. O tamanho da amostra é de 5 para cada grupo (5 ratos). +, Valores extremos no diagrama de box-and-whisker;

bares

, a extensão total dos dados.

(A) A densidade de colágeno diminui à medida que os xenotransplantes tumorais crescer. A densidade dos tumores em 5 dias é significativamente mais elevada em comparação com aqueles aos 20 dias (*, p = 0,033, ANOVA de contraste linear) e 30 dias (**, p = 0,005, ANOVA de contraste linear). +, Valores extremos no diagrama de box-and-whisker;

bares

, a extensão total dos dados. (B) A organização das fibras de colágeno mudanças durante o crescimento dos xenoenxertos de tumores pancreáticos subcutâneos. Uma comparação global dos valores de correlação mostra a maior diferença entre os xenoenxertos de tumores colhidos aos 5 dias e as colhidas após 10 dias, como indicado pela Corr

50 valor, a distância em que a correlação cruzada de 50% da correlação inicial. *, P = 0,035, ANOVA de contraste linear. O tamanho da amostra é de 5 para cada grupo (5 ratos). As barras de erro são um desvio padrão acima e abaixo de cada ponto de dados.

Os neutrófilos e necrose observados nos xenoenxertos de tumores subcutâneos colhidas em 5 dias são possivelmente devido à resposta inflamatória durante a reação tumor-hospedeiro, uma vez que foi relatado que o sistema imunitário do hospedeiro residual pode participar na regressão do tumor em estágios iniciais após a inoculação de xenoenxertos de tumores [31].