Sumário

O potencial de aplicação de rotulagem ponto quântico multiplexado (MQDL) para a detecção de câncer e prognóstico e monitorização respostas terapêuticas atraiu os interesses dos bioengenheiros, patologistas e biólogos cancerosas. Muitos estudos publicados afirmam que MQDL é eficaz para a detecção de biomarcadores de câncer e útil no diagnóstico e prognóstico do câncer, esses estudos não foram normalizados em relação determinações bioquímicas e moleculares quantitativas. No presente estudo, foi utilizado um modelo de célula cancerosa molecularmente caracterizado próstata humana exibindo activado c-Met sinalização com epitelial para mesenquimal (EMT) e progressão metastática letal para ossos e tecidos moles como o padrão-ouro, e comparou a-Met c celular sinalização de rede neste modelo, em espécimes clínicos humanos de tecido de cancro da próstata e num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata humana resistente à castração. Observamos c-Met sinalização de ativação da rede, que se manifesta por aumento fosforilada c-Met em todos os três. A rede de sinalização a jusante de sobrevivência foi mediada por NF-kB e de Mcl-1 e EMT foi impulsionado pelo activador do receptor do ligando NF-kB (RANKL), ao nível da célula única em espécimes clínicos de cancro da próstata e o modelo xenoenxerto. Os resultados foram confirmados por em tempo real de RT-PCR e Western blots em um modelo de células de cancro da próstata humano. MQDL é uma ferramenta poderosa para avaliar a expressão do biomarcador e oferece insights moleculares para a progressão do câncer, tanto a nível de células e tecidos com alto grau de sensibilidade

Citation:. Hu P, Chu GC-Y, Zhu G, Yang H, Luthringer D, Prins L, et ai. (2011) multiplexada Quantum Dot Labeling da Contato c-Met Sinalização no cancerosas humanas da próstata resistente à castração. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10.1371 /journal.pone.0028670

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de outubro de 2011; Aceito: 12 de novembro de 2011; Publicação: 21 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação 2PO1CA098912 e 1RO1CA122602 dos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer, e Award Prostate Cancer Foundation Challenge (LWK Chung). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Semi-condutores pontos quânticos (QDs) nanopartículas fluorescentes foram reconhecidas como um dos grandes avanços recentes em nossa capacidade de detectar biomarcadores relevantes expressas por células, tecidos e soros [1], [2], [3 ], [4], [5]. As propriedades ópticas e electrónicas únicas dos QDs incluem as suas bandas estreitas e simétricas de emissão, a emissão de luz e o material tamanho–sintonizável, de superfície elevada em relação ao volume, fotoestabilidade, o brilho do sinal e sensibilidade e excitação simultânea de múltiplas cores de fluorescência tornando possível detectar múltiplos alvos simultaneamente ao nível da célula individual [3], [6]. rotulagem ponto quântico, QDL, é superior aos corantes orgânicos convencionais para celular e coloração de tecidos, especialmente desde que a ampla largura de banda último rendimento com sobreposição de emissão de sinais e são altamente susceptíveis a fotodegradação. biomarcadores multiplexação com cores diferentes fornece vantagens significativas em relação aos corantes orgânicos ou fluorescentes tradicionais para a detecção e análise das alterações dinâmicas em proteínas e ácidos nucleicos em células ou tecidos sob condições fisiopatológicas. QDL tem sido aplicada com êxito para detectar os níveis de expressão de genes de

em

in situ associada com processos biológicos importantes, tais como epiteliais para mesenquimal [6] em metástase do cancro [7], biomarcadores proteína no sangue, a presença de ácidos nucleicos, microRNA e metilação do DNA no soro ou tecido extratos com amostras de códigos de barras para o processamento rápido por protocolos automatizados [8], [9], [10]. No presente estudo, foram empregados multiplexado rotulagem ponto quântico (MQDL) para detectar a via de sinalização celular c-Met-mediada activado levando a EMT, o crescimento do câncer e osso e metástase dos tecidos moles em um modelo de metástase de câncer romance de próstata [11], [ ,,,0],12], [13]. Confirmou-se os níveis de expressão do gene avaliada por MQDL com a expressão do gene, tal como determinado por RT-PCR e Western blots. Em seguida, aplicado o protocolo MQDL para determinar se a via de sinalização celular de c-Met e EMT são activados em um modelo animal resistente à castração cancro da próstata (CRPC) e em amostras de cancro da próstata clínicos obtidos a partir de pacientes com contagens elevadas de Gleason e metástases ósseas. Observou-se que a ativação de c-Met está intimamente ligada à EMT em células cancerosas e sua subsequente aumento da migração, invasão e metástase [14], [15], [16]. c-Met activação do sinal no cancro da próstata humana tem implicações clínicas importantes: 1) c-Met de sinalização a jusante impulsiona EMT e migração de células de cancro, invasão, metástase e a sobrevivência em diversos modelos de tumores sólidos humanos, incluindo o cancro da próstata [15], [17], [18], [19]. 2) Uma vez que a segmentação de c-Met e a sinalização a jusante VEGFR2 com um inibidor de tirosina quinase múltipla sintético, CABOZANTINIB (GG-184), resultou num notável resolução de metástases ósseas e dos tecidos moles em um grande número de pacientes com tumores sólidos, incluindo pacientes CRPC [20 ], [21], que seria importante para mostrar se estas vias de sinalização celular pode ser activada em amostras clínicas e em modelos de xenoenxerto de tumor relevantes. Nós usamos uma linha de células de cancro da próstata humana para demonstrar que a ativação do c-Met confere EMT e câncer de próstata óssea e metástases de tecidos moles e investigados em profundidade a ativação de sinalização c-Met por molecular análises com resultados confirmados por MQDL. Em seguida, empregou MQDL para avaliar a activação de sinalização de c-Met em amostras de tecido de cancro da próstata clínica e correlacionados com os resultados de um modelo de xenoenxerto de cancro da próstata humana resistente à castração. Mostrámos que MQDL, juntamente com Vectra análise de imagens, melhora a capacidade de perfis quantitativa de biomarcadores individuais ao nível da célula individual. Uma série de biomarcadores associados com EMT, tais como a diminuição da expressão de EpCAM, e aumento da expressão de N-caderina, vimentina e RANKL, e a activação do sinal de c-Met, incluindo o VEGF, a neuropilina 1, PC-Met e fosfo (P) -nf -κB p65 [15], [22], foram analisados. Os resultados destes estudos mostraram um notável paralelismo de EMT e activação de c-Met entre o modelo de células de cancro da próstata, o modelo de xenoenxerto de CRPC e espécimes clínicos de cancro da próstata. As metodologias estabelecidas no presente estudo poderia ser de valor significativo no futuro próximo para caracterizar outras vias de sinalização ativadas em amostras clínicas, interrogar mecanismos moleculares progressão do câncer subjacente, identificar alvos druggable, e acompanhar a resposta clínica de pacientes para intervenção terapêutica.

Materiais e Métodos

cultura de células e transfecção de células

a linha de células LNCaP, gentilmente cedido pelo falecido Dr. Gary Miller, da Universidade do Colorado (Denver, CO), foi cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lowrenceville, GA), penicilina (100 ug /ml) e tetraciclina (100 U /ml) a 37 ° C em atmosfera humidificada com 5% de CO

2. O estabelecimento de clones com superexpressão da proteína RANKL foi relatado anteriormente [23]. Resumidamente, um ADNc de comprimento completo que codifica RANKL humana de OriGene (Rockville, MD) foi clonado unidireccionalmente para P3 × FLAG- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) nos sítios das enzimas de restrição NotI e XbaI. Após a transfecção de células de LNCaP em 75% de confluência com RANKL marcada com Flag e do plasmídeo neo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) numa placa de 6 poços, durante 48 h, as células foram tripsinizadas e semeadas a 15 cm de placa. As células LNCaP-neo e LNCaP-RANKL estáveis ​​foram sujeitas a selecção com G418 (400 ug /ml) e clones de células individuais foram isoladas e mantidas em 200 ug /ml de G418 para o ARN e a extracção de proteína e de imunoensaio usando oito poços compartimentado lâminas (Thermo Scientific, Rochester, NY). Foram selecionados três LNCaP-RANKL e 2 clones de células LNCaP-neo. Uma vez que os seus fenótipos bioquímicos foram semelhantes usamos um clone de cada para o estudo.

transcriptase reversa (TR) de PCR

O ARN total a partir de células foi isolado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ; Germantown, MD) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar (cDNA) foi gerado a partir de 3 g de RNA total utilizando SuperScript® III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen; 1 ml de cDNA foi sujeita a análises de PCR usando os seguintes iniciadores: RANKL F, 5′-TGG ATC ACA GCA CAT CAG AGC AG-3 ‘; R RANKL, 5′-TGG TCA GGC TAT ATC ATC TCG AAC-3′; E-caderina F, 5’-CCG AAG CAG CAG TAC ATT CTA CAC G-3 ‘; E-caderina R , 5’-TCG GTT CTT CAC GTG CTC AAA ATC C-3 ‘; N-caderina F, 5′-GAT GTT GAG CAG GTA CGT AAT; N-caderina R, 5′-CGG TCT GGA GGT TGG CGA-3′ ; vimentina F, 5′-GGA GGA CTC GGT CTT CTC; vimentina R, 5’-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 ‘, c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA;. c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA Os ciclos de reacção de PCR envolvido um desnaturação inicial a 94 ° C durante 10 min, 36 ciclos de 94 ° C, 1 min, 55 ° C, 30 seg; para RANKL72 ° C, 1 min seguido de uma última de 72 ° C para extensão de 10 min para E-caderina. e a amplificação do gene N-caderina, as reacções de PCR correu durante 32 ciclos e as temperaturas de emparelhamento foi de 55 ° C e 47 ° C, respectivamente durante 30 segundos. para a amplificação vimentina e GAPDH, as reacções de PCR correu durante 28 ciclos com as temperaturas de recozimento a 48 ° C durante 30 seg. Os produtos de PCR amplificados foram detectados e analisados ​​em gel de agarose a 1%

análise Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA contendo 1 × cocktail inibidor de protease (Thermo Fisher Scientific; Rockford, IL). e centrifugados, e os sobrenadantes foram recolhidos e quantificada utilizando o Bradford Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Os lisados ​​de células (20-30 ug) foram resolvidas num 4-12% Bis-Tris de gradiente de SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) sob condições redutoras, seguido de transblotting para membrana de nitrocelulose (Biorad Laboratories; Hercules, CA), e bloqueadas em 5% de leite desnatado /PBST durante uma hora à temperatura ambiente (TA) e incubadas com Abs primário diluído em tampão de bloqueio, a 4 ° C durante a noite. A fonte e a diluição de Abs primários foram: RANKL (SC-74261; 1:400), a E-caderina (SC-7870; 1:1000), vimentina (SC-6260; 1:500), c-Met (SC- 10; 1:500) (Cruz Biotechnology de Santa; Santa Cruz, CA), N-caderina (# 610920; 1:200) (BD Transduction Laboratories; San Jose, CA e Santa Cruz Biotechnology), p-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G; 1:500) (Invitrogen), p-p65 de NF-kB (Ser536) (# 3033; 1:1000), NF-kB p65 (# 4764; 1:1000) (Cell Signaling tecnologia; Danvers, MA). Produção e utilização de anticorpos do receptor de andrógeno (PG21; 1:500) foram anteriormente relatados [24]. As membranas foram lavadas 3 × com PBST, incubadas com conjugados com peroxidase anti-rato ou anti-coelho secundário Abs à TA durante uma hora e lavadas 3 × com PBST. Os sinais foram visualizados utilizando o reagente ECL Plus (GE Healthcare Biosciences; Pittsburg, PA). Restore Plus ocidental Tampão Stripping Blot (Thermo Fisher Scientific) foi utilizada antes da re-sondagem com Abs diferente.

experimentos in vivo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado do Institutional animal Care e Use Committee (IACUC # 2999, Cedars-Sinai Medical Center, e A10-0100, University of British Columbia). LNCaP-RANKL e células LNCaP-neo (1 × 10

6 células /50 ul de PBS) foram inoculadas em intracardial com 5 a 7 semanas de idade, ratinhos nus atímicos macho (Charles Ri ver, n = 20 para LNCaP-RANKL e n = 15 para LNCaP-neo). Todos os ratos foram monitorados regularmente para a formação de tumor metastático, que ocorreu pela primeira vez em 8 semanas. Os animais foram sacrificados em 12 semanas.

amostras de tecido do câncer de próstata

formalina-fixo e (FFPE) amostras de cancro da próstata humano foram obtidas junto ao Departamento de Patologia do Cedars-Sinai Medical Center parafinado (IRB # Pro 00.021.228). espécimes clínicos adicionais de tecido de cancro da próstata foram obtidas do Dr. Fouad Habib, da Universidade de Edimburgo, na Escócia, e Dr. Hua Yang, da Universidade Jilin, na China. O uso de amostras clínicas foi aprovado pelos tecidos humanos comitês de revisão institucionais nas respectivas instituições.

xenotransplantes CRPC

Para estabelecer protocolos de trabalho para a rotulagem QD único e seqüencial múltipla, optamos por utilizar um LTL -313 modelo de xenotransplante CRPC uma vez que imita o câncer de próstata resistente à castração e fornece amostras de tecidos múltiplos consistentes e prontamente disponíveis críticas para o desenvolvimento e estabelecimento de um novo protocolo MQDL. tecidos FFPE de um câncer de próstata resistente à castração (CRPC) LTL-313 (Living Tumor Laboratory, www.livingtumorcentre.com) modelo de xenoenxerto foram obtidos a partir de Vancouver Cancer Center, BC Cancer Agency, em Vancouver, Canadá. A linha de tumor LTL-313 foi desenvolvido a partir de amostra de biopsia de agulha da próstata a partir de um paciente idoso de 80 anos diagnosticada com cancro da classificação de Gleason 8 próstata com um nível de soro de PSA de 17 ng /ml na altura do diagnóstico [25]. O protocolo de desenvolvimento de linha de tumor foi aprovado pelo Conselho de Administração da University of British Columbia Ética em Pesquisa Clínica, de acordo com as Diretrizes sobre Animais de Laboratório do Instituto de Ciências Animais Experimentais (uso espécime humano estava com aprovações de University of British Columbia, Canadá (IRB # UBC BCCA REB # H04-60131). Resumidamente, para estabelecer o câncer de próstata resistente à castração, frescos tecidos tumorais LTL-313 a partir da 5ª geração da enxertia foram cortados em 3 × 3 × 1 pedaços mm e re-enxertados nas cápsulas subrenal de ratinhos NOD-SCID machos. os animais foram mantidos durante a formação de tumores durante dois meses antes da castração para remover androgénios. Três semanas após a castração, quando o volume do tumor foi significativamente reduzido, os restantes tecidos tumorais foram colhidas e preparado como blocos de tecido FFPE. Xenongraft tecidos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de 9 tumores de ratos castrados e 5 tumores a partir de 5 anfitriões intactas rato suplementados com testosterona que haviam sido submetidos a operação simulada.

reagentes de imunoensaio

Os anticorpos primários (ABS) e suas fontes foram: monoclonal Abs para EpCAM humana (VU-1D9) e RANKL (12A668) da Novus Biologicals (St. Charles, MO); monoclonal Ab a c-Met (25H2) e monoclonal de coelho Ab a E-caderina (24E10) a partir de Cell Signaling Technology; Ab policlonal de coelho para o receptor de androgénios, AR, (PG 21), fornecido pelo Dr. Gail Prins da Universidade de Illinois (Urbana, IL); policlonal de cabra Ab a neuropilina-1 (C-19), de coelho policlonal Abs para N-caderina (H-63), Mcl-1 (S-19), P-NF-kB p65 (Ser 536), e VEGF (A -20) de Santa Cruz Biotechnology, Inc .; e Ab policlonal de coelho para P-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) a partir de Invitrogen. Abs secundário utilizado no estudo foram preparadas de um cocktail de Abs biotinilado de rato, coelho, e IgG de cabra (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). QDs tamponada com fosfato salino (PBS) e estreptavidina conjugada com a 565-, 585-, 605-, comprimentos de onda de 625-, 655- e 705 nm como uma solução estoque uM foram adquiridos a partir de Invitrogen.

imuno-histoquímica (IHQ ) coloração

IHC seguido o nosso protocolo publicado [26] com pequenas modificações. FFPE secções (4 mm) foram desparafinizadas, re-hidratadas, e submetida a recuperação de antigénios. Após incubação em solução de enzima endógena dupla bloco (DEEB, Dako, Carpinteria, CA) durante 10 minutos, a secção foi tratada com o anticorpo primário diluído com uma solução de diluente de anticorpo (Dako), como segue: RANKL (1:100), c-Met ( 01:50), a neuropilina 1 (1:100), o receptor de androgénio (1:200), N-caderina (1:100), Mcl-1 (1:100); p65 p-NF-kB (Ser536) (1:100), VEGF (1:50) e pc-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), vimentina (1:100) e E-caderina ( 1:200) a 4 ° C durante a noite. A secção foi, então, lavadas 3 vezes em PBST (PBS contendo 0,2% de Tween 20) durante 5 minutos por lavagem. Para detectar coloração específica, a secção foi tratada durante 30 minutos com EnVision

+ Dual Link System-HRP (Dako), o qual continha anticorpos de cabra conjugado com peroxidase de rábano a Ig de coelho e rato. A seção foi lavado 3 vezes por 5 minutos cada, e as manchas específicas foram desenvolvidas com 3,3′-diaminobenzidina (Dako).

Single QD Labeling (SQDL)

O protocolo de coloração IHC foi modificada para a rotulagem QD única. QDs estreptavidina conjugada (565-, 585-, 605-, 625-, 655- e 705 nm) foram preparados como 10 nM em PBS com 6% livre de IgG, livre de protease BSA (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) . Antigen recuperado tecidos ou amostras de células fixadas foram incubadas em PBS contendo 2,5% de soro de cavalo (Vector Laboratories) e 20% de estreptavidina Bloco Reagent (Invitrogen) durante 20 minutos, seguido por tratamento com Abs primários, tal como descrito acima na secção imunorreagentes acima em PBS mais 1% de soro de cavalo e 20% Biotina Bloco Reagente (Invitrogen) a 4 ° C durante a noite. Depois de um minuto PBST 3 × 5 (PBS + 0,4% de Triton X-100) amostras de lavagem foram incubadas com o cocktail de Ab secundário à temperatura ambiente durante 30 min e depois incubadas com o respectivo estreptavidina-QD a 37 ° C durante 60 min. No final de cada incubação, as amostras foram submetidas a rotina de 3 × 5 minutos PBST (PBS + 0,4% de Triton X-100) de enxaguamento. Após a lavagem final, as lâminas foram montadas em meio de montagem aquosas contendo 4’6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Vector Laboratories) para a imagiologia. As diluições Ab foram descritos na seção IHC acima.

multiplexada QD Labeling (MQDL)

O protocolo de rotulagem QD single foi modificado para MQDL, em que uma secção de tecido único foi submetido a coloração para vários marcadores de uma forma sequencial. Para cada teste biomarcador, etiquetagem iniciada com um bloqueio de estreptavidina, seguido de reacção primária Ab e Ac biotinilado de incubação secundária, e reacção com QD estreptavidina conjugada a um comprimento de onda especificado. As secções foram incubadas sequencialmente (com um 3 × 5 minutos de lavagem após cada incubação PBST). Abs primárias e diluições em MQDL eram idênticos aos utilizados para SQDL. As sequências de imunorreacção foram: 1) Anti-A neuropilina-1 Ab, 2 horas, temperatura ambiente; IgG de cabra anti-cavalo biotinilado, à temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD705, a 37 ° C, 1 hora. 2) Anti-P-C-Met Ab, a 4 ° C, durante a noite; IgG anti-coelho de cavalo biotinilado, à temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD655 a 37 ° C, 1 hora. 3) anti-VEGF Ab, à temperatura ambiente, 2 horas; IgG anti-cavalo biotinilado de coelho, em roomtemperature, 30 min; estreptavidina-QD625 a 37 ° C, 1 hora. 4) Anti-p-p65 NFkB-Ab a 4 ° C, durante a noite; cavalo biotinilado anti-IgG de coelho, à temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD565 a 37 ° C, 1 hora. 5) Anti-RANKL Ab à temperatura ambiente, 2 horas; IgG anti-rato de cavalo biotinilado, à temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD585 a 37 ° C, 1 hora. 6) de montagem em meio de montagem contendo DAPI aquosas. Ab concentrações foram descritos na secção de IHC. Secções de células de cancro da próstata humano LNCaP FFPE-RANKL foram utilizadas como um controlo positivo. Para controlo negativo, Abs primários foram substituídos com isotype- e ABS controlo espécies-matched e aplicado a uma secção de tecido imediatamente adjacente, e MQDL foi realizada em paralelo com a lâmina de tecido marcado com o Abs primária testar.

Imagem aquisição

Um sistema de imagem espectral Cri (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) com built-in software v3.1 Nuance foi usado para documentar imagens multiespectrais seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para cada campo de tecido de cancro, imagens seriais foram adquiridas a um intervalo de comprimento de onda de 10 nm 450-800 nm, uma gama escolhida correspondente a QDs fluorescentes activas. Ele gera uma imagem “cubo” não processado como uma pilha de 36 imagens separadas com cada imagem que contém a informação espectral completa para cada pixel em um determinado comprimento de onda. Todas as imagens foram obtidas em 400 × ampliação, com uma exposição de 50 milissegundos. Para evitar variações na rotulagem, devido à heterogeneidade celular, cinco imagens de diferentes sites de tecido canceroso foram tomadas para cada amostra de tecido para posterior quantificação.

Deconvolution Imagem

Foi utilizado deconvolução imagem ou protocolo desmistura para extrair rotulagem específico por um QD especificado. Uma biblioteca espectral para 565, 585, 605, 625, 655, e 705 nm foi construído para deconvolução por performimg vários SQDLs usando receptor de andrógeno (AR) anticorpo sem DAPI última contracoloração em secções de tecido em série adjacentes. A rotulagem positiva de AR foi confirmada por coloração IHC paralelo em tecidos adjacentes. O espectro de DAPI foi obtido pela montagem do tecido adjacente no meio de montagem aquoso contendo DAPI. Espectros de autofluorescência de tecidos foram adquiridos para cada tecido a partir de uma lâmina de controlo negativo (ver secção MQDL) preparado por IHC sem marcadores fluorescentes. redução de autofluorescência foi realizada utilizando software plug-in Análise de Componentes Real. A biblioteca espectral foi então usado para unmix o cubo. As contribuições espectrais separadas para os dados ‘cubo’ são emitidas como mapas de intensidade de cor designados. Estas imagens representam a distribuição de cada um dos QDs e autofluorescência no tecido. Após a deconvolução das imagens, a rotulagem fundo foi filtrado e apenas os verdadeiros sinais positivos foram mostradas nas imagens das figuras apresentadas.

Signal Quantificação

A biblioteca espectral foi usada para deconvolute o cubo de imagem para extrair rotulagem de QD individual usando informar software v1.3 (Caliper), seguindo a estratégia recomendada. Em primeiro lugar, um conjunto de treinamento que compreende duas classes de tecido foi criado: “cancro” e “não-câncer”. O software foi treinado nessas áreas usando os espectros de ambos os counterstain DAPI ea imunomarcação QD multiplexados e testado em 50 células seleccionadas aleatoriamente a partir de cada imagem para determinar a precisão de diferenciar as duas classes. Este processo foi repetido até novas iterações não melhorou a precisão. H /E imagens histológicas foram em seguida utilizados para localizar as células cancerosas com base na rotulagem DAPI nuclear. Um algoritmo incorporado foi então utilizada para definir a citoplasmática vs subcelulares regiões nucleares. Com base na análise de imagens em 400 × ampliação, as configurações dos limites ideais aproximada: escala fixa 200, tamanho mínimo de blob 20, de tamanho máximo blob 10.000, limiar de circularidade 0, borda nitidez 0, preencher buracos habilitado (parâmetros nucleares); distância interior para núcleo 1, a distância exterior ao núcleo 7, citoplasma mínima da amostra de tamanho 1, o alcance do sinal mínimo 0, máximo alcance do sinal 65535 (parâmetros citoplasmáticos). Para eliminar os sinais não específicos para o espectro especificado, uma área acelular dentro do campo a ser analisado foi usado como marcação de fundo. QD intensidade de fluorescência de cada célula foi exportada para uma planilha Excel (Microsoft, Seattle, WA) e submetidos à análise estatística [27], [28].

Resultados

Desenvolvimento de um QD quantitativa protocolo de rotulagem para a avaliação da expressão do gene associado com a ativação de c-Met de sinalização e EMT em células LNCaP humanas cultivadas de forma estável tansfected com RANKL

osso modelo de LNCaP e metástases de tecidos moles: Um romance LNCaP modelo de metástase óssea foi desenvolvido por transfecção estável desta linha de células com RANKL (LNCaP-RANKL), que acciona EMT nas células transfectadas. Quando as células que sobre-expressam RANKL LNCaP foram injectados em ratinhos intracardial eles exibiram um aumento da incidência de metástases ósseas e dos tecidos moles (Tabela 1).

Validação dos componentes de sinalização de c-Met activado que levam a EMT por RT- PCR, Western blot e único Quantum Dot Etiquetagem, SQDL: Comparação da expressão de genes entre o controlo de LNCaP-neo estável e células LNCaP-RANKL utilizando RT-PCR e Western blot mostrou evidência de activada de c-Met sinalização através do aumento da expressão de c-Met, PC-Met, e p65 NFkB-p (figura 1). As células foram submetidas morfológicas (Painel A) e bioquímicas (pains B e C) para epitelial mesenquimal, com diminuição da adesão intercelular mediada pela E-caderina e EpCAM, e aumento da N-caderina, vimentina e RANKL. Estas avaliações de activação sinalização c-Met e EMT foram submetidas a análises SQDL com um esforço específico para confirmar se a ativação c-Met e EMT ocorreu neste modelo de células de cancro da próstata progressão. SQDL confirmou que, em comparação com células de controlo de LNCaP-neo (Figura 2a), as células LNCaP-RANKL (figura 2B) tinha activada de c-Met de sinalização tal como revelado por uma elevada expressão de RANKL, c-Met, PC-Met e p-NFkB p65 e evidência de EMT, um interruptor caderina de expressão elevada de N-caderina, vimentina e RANKL, mas a diminuição da expressão de e-caderina e AR. análises quantitativas (Figura 3) de 1.000 células cancerosas selecionados aleatoriamente por informar software (Caliper) apoiou os dados de imagem em que tanto a expressão AR e E-caderina foi drasticamente diminuída e ativados c-Met sinalização componentes levaram a EMT, como expressão elevada de c-Met, PC-Met, p-NFkB p65, foram observadas N-caderina, vimentina, e RANKL em LNCaP-RANKL, quando comparadas com células LNCaP-neo. Este protocolo SQDL quantitativa foi adotado para a expressão do gene análises de um modelo de xenotransplante CRPC LTL-313 estabelecida.

células LNCaP transfectadas-RANKL EMT induzidas em histomorfologia (A) e expressão do gene em mRNA (B) e proteína (C ). Os dados representam uma das 3-RANKL estavelmente transfectadas e neo-2 estavelmente transfectada clones de células LNCaP.

QD Diferencial marcação de proteínas foi realizada em LNCaP-neo (A) e LNCaP-RANKL (B) células utilizando coloração nuclear DAPI como referência. Para cada análise, QD marcado expressão da proteína é apresentada em pseudo, com a imagem sobreposta de sinais de DAPI e QD (Incorporada). × 400.

intensidade média baseia-Cell conta de 1.000 cada um dos clones LNCaP neo e transfectadas-RANKL foram quantificados utilizando informar software. Foram observadas alterações estatisticamente significativas na expressão da proteína (

P Art 0,05)

Validação de c-Met sinalização ativação e EMT no modelo CRPC LTL-313 com resultados confirmados por. IHC e SQDL

Para entender o significado clínico de c-Met sinalização ativação e EMT no modelo LNCaP-RANKL e os aumentos associados em metástases do câncer de próstata, definimos a c-Met via de sinalização e EMT em uma CRPC modelo de xenotransplante LTL-313 obtida a partir do Tumor de estar Laboratory (livingtumorcentre.com). Foram incluídos sinalização associada genes adicionais de c-met tal como neuropilina-1, VEGF, P-Akt, VEGFR2, Mcl-1 e Ar, que foram caracterizados como mediadores de sobrevivência a jusante de c-Met de sinalização [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. A Figura 4 mostra que o aumento de c-met genes associados a sinalização e a diminuição da expressão de AR em CRPC LTL-313 xenoenxertos mantidos em hospedeiros machos castrados, como avaliada por IHC (Painel A) e SQDL (Painel B) em comparação com os xenoenxertos mantidos em ratinhos intactos com a suplementação de andrógenos.

o c-Met ativado e proteínas EMT associados foram detectadas no modelo de xenotransplante CRPC LTL-313 por IHC convencional (a) e SQDL (B). Castração aumentou um painel de genes no cancro da próstata xenotransplante LTL-313 e diminuição da expressão do AR em comparação com enxertos obtidos de hospedeiros intactas por ambos IHC e SQDL. × 400.

análise MQDL demonstrou activado c-Met e EMT em um LTL-313 modelo de xenotransplante CRPC e amostras de tecido de cancro da próstata humano primários e metastáticos. Uma série de xenoenxertos de cancro da próstata humanas obtidas a partir do laboratório vivo do tumor foi usado para testar o protocolo MQDL quantitativa. Foi selecionado o modelo de LTL-313 para esta tarefa porque este modelo apresenta características CRPC com uma propensão para a linfa principalmente metástases, pulmão e fígado com metástase óssea pouco frequente, quando os tumores são implantados e cresceu sob as cápsulas renais. Testamos a hipótese que os tumores cresceram em ratos castrados iria desenvolver resistência castração e ter c-Met activado de sinalização que conduz a EMT, quando comparados com os tumores cultivados em ratinhos suplementados com androgénio exógeno (Figura 5A). Foram feitas três abordagens: 1) para estabelecer um protocolo MQDL robusto para detectar e quantificar um painel de expressão dos genes nos-313 LTL espécime de tecido modelo CRPC com os resultados comparados com SQDL; 2) usar este protocolo MQDL quantitativo estabelecido para confirmar se a ativação de c-Met e EMT ocorrer nos CRPC LTL-313 tecidos mantidos nos hospedeiros castrados; e 3) para demonstrar pelo protocolo padronizado MQDL a activação de c-Met e indução de EMT em ambos os tecidos humanos de cancro da próstata metastático e esquelético. A Figura 5B mostra analisa a MQDL quantitativa de neuropili-1, PC-Met, VEGF, p65 p-NFkB, e RANKL, relatada previamente para ser associada com a activação do sinal de c-Met [15], [22] e EMT [26], [31] em células cancerosas humanas da próstata e no modelo CRPC LTL-313. Mostrámos activada de c-Met sinalização e EMT, como demonstrado por um aumento da expressão de neuropilina-1, VEGF, e RANKL proteína e activação de PC-Met e p65 p-NFkB no modelo de tumor CRPC LTL-313 com uma maior expressão e activação de estes genes em xenoenxertos tumorais LTL-313 mantidas em comparação com os ratinhos castrados intactas. Como um controlo interno para minimizar a possível interferência de fluorescência de sondas múltiplas QD, foi realizada MQDL lado a lado com o protocolo SQDL (ver acima). A expressão elevada dos genes estudados 5 verificou-se ser estatisticamente significativa por meio de análises quantitativas inFom (Figura 5B). Nós determinamos este painel de 5 genes em amostras de câncer de próstata primário com diferentes escores de Gleason e descobriram que a expressão de neuropilina-1, VEGF, pc-Met, RANKL e p-NFkB p65 foram mais elevadas em pouco diferenciado (escore de Gleason 10) do que moderadamente diferenciadas (Gleason 7, 3 + 4) do cancro da próstata (Figura 6). Estes resultados, tomados em conjunto, confirmou que a rotulagem QD é altamente sensível e versátil e pode ser utilizado para perfis de expressão de gene de multiplexagem em modelos experimentais ao nível da célula individual.

secções de tecido de tumor a partir de hospedeiros individuais intactos e castrados foram submetidos ao seqüencial MQDL. expressão aumentada de genes ativados c-Met foi detectado em tecidos tumorais de anfitriões castrados. (A) Uma pilha de imagens múltiplas (cubo), coloração nuclear (DAPI), e expressão de genes individuais (em pseudocolors) são mostrados. sinais de expressão de genes foram sobrepostos com os sinais nucleares DAPI para se obter uma imagem composta para análise. × 400.