Abstract

O câncer de bexiga é a quarta causa mais comum de câncer em homens nos Estados Unidos. comportamento invasivo é um dos principais determinantes do prognóstico. Neste estudo, identificaram-alvo de mamífero do complexo rapamicina 2 (mTORC2) como um regulador central da migração de células de cancro da bexiga e invasão. mTORC2 actividade foi avaliada pela extensão da fosforilação de AKT Ser473 em e determinado ser aproximadamente 5 vezes mais elevadas em amostras de cancro da bexiga invasivo humano em oposição a cancro da bexiga humano não-invasiva. As linhas de células malignas da bexiga imortalizadas, UMUC-3, J82 e T24 demonstrou maior actividade mTORC2 linha de base em relação à linha de células da bexiga papiloma benigno RT4-derivado e a linha de células uroteliais HU1 normal. As células de câncer de bexiga malignos também demonstrou aumento da migração em ensaios transpo� e denudação, o aumento da invasão de matrigel e aumento da capacidade de invadir espécimes bexiga humana. silenciamento de genes de rictor, um componente crítico de mTORC2, a migração de células de câncer de bexiga substancialmente inibida e invasão. Isto foi acompanhado por uma diminuição significativa na activação Rac1 e fosforilação de paxilina. Estes estudos identificam mTORC2 como um alvo importante para neutralizar a invasão cancro da bexiga

Citation:. Gupta S, Hau AM, Praia JR, Harwalker J, Mantuano E, Gonias SL, et al. (2013) Mammalian alvo da rapamicina Complexo 2 (mTORC2) constitui um factor determinante de cancro de bexiga Invasion. PLoS ONE 8 (11): e81081. doi: 10.1371 /journal.pone.0081081

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2013; Aceito: 08 de outubro de 2013; Publicação: 27 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gupta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Case Western Reserve University /Cleveland Clinic CTSA Grant Número UL1 RR024989 do National Cancer Institute, e um prêmio KL2 desenvolvimento de carreira (RR024990) para dE Hansel. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga por mais de 70.000 novos casos de câncer nos Estados Unidos por ano, com uma incidência global estimada de 386.000 casos por ano [1,2]. carcinoma urotelial (UCA) representa aproximadamente 95% de todos os cancros da bexiga, com os resultados dos pacientes influenciado principalmente pelo grau patológico e estágio [3]. Grade é um contribuinte principal ao comportamento em calciúria não-invasivo, que é subdividido em categorias de baixo grau e de alta qualidade. doença de baixo grau mostra recorrência frequente local na superfície da bexiga, mas a progressão raro doença invasiva [4]. alto grau doença progride à invasão em 40-50% dos pacientes [5]. Uma vez que ocorre invasão, sobrevivência específica da doença diminui com o aumento da fase patológica (ou seja, a profundidade de invasão na parede da bexiga), apesar da intervenção terapêutica.

O câncer de bexiga continua a ser uma doença relativamente pouco estudada e os mecanismos celulares que determinam a progressão do câncer não são completamente compreendidos. alto grau doença mostra muitas vezes

RB

e

TP53

mutações e

PTEN

exclusão; No entanto, estas alterações genéticas pode ser observado em ambas as lesões invasivas e não invasivas. Identificação de vias pró-invasivos no cancro da bexiga tem sido mais desafiador. Um trabalho recente demonstrou que o receptor-1 do factor de crescimento do fibroblasto (FGFR1) promove a invasão de células cancerosas da bexiga que expressam ZEB1, um marcador de epitelial-mesenquimal transição (EMT) [6]; inibição FGFR neste estudo reduziu a propagação metastática de células de câncer de bexiga ortotópica implantados. FOXQ1 expressão também foi associada com uma assinatura EMT em células cancerosas da bexiga e silenciamento de FOXQ1 aumento da expressão de E-caderina, diminuição da expressão de vimentina e atenuado comportamento invasivo [7]. O alvo da fosfoinositida 3-cinase-AKT de mamífero de rapamicina (mTOR) via tem sido identificada como uma via candidato na progressão do cancro da bexiga em diversos estudos recentes clinicopatológicas [8,9]. Embora tenhamos identificado um papel para mTORC1 na promoção da proliferação cancro da bexiga

in vitro

e crescimento de xenoenxerto de cancro da bexiga

in vivo

[9], o papel de mTOR sinalização na invasão câncer de bexiga não foi explorado.

mTORC2 é um alvo atractivo para a inibição da invasão de cancro da bexiga, porque foi demonstrado que afectam a remodelação do citoesqueleto, a adesão de células de cancro, e a migração [10-12]. mTORC2 se distingue de mTORC1 pela presença do rictor, protor e subunidades mSin1, que são necessários para a actividade de cinase completo [13,14]. efectores a jusante incluem AKT ea GTPases Rho (Rho, Rac e Cdc42) que regulam a adesão e migração [12,15,16]. mTORC2 também pode regular EMT [17], e tem sido implicada na invasão e metástase no cólon e do cancro da mama [10,18]. direcionamento seletivo de mTORC2 reduz a metástase do câncer em modelos de ratos [10]; no entanto, o seu papel na invasão e metástase de câncer de bexiga é desconhecida.

Neste estudo, examinamos o papel da mTORC2 na invasão de células de câncer de bexiga. Usámos espécimes de cancro da bexiga humanos para demonstrar que o aumento da actividade mTORC2 está associada a um fenótipo invasivo. Estes estudos são acoplados com

in vitro Comprar e romance

ex vivo

ensaios parede da bexiga invasão humanos para mostrar o papel crítico da mTORC2 na migração de células de câncer de bexiga e invasão. Alterações na sinalização de Rho GTPase são detalhados. Os resultados deste estudo indicam que mTORC2 pode ser um novo alvo emocionante na inibição da progressão do cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

RT4, UMUC3, T24 e células J82 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). células HU1 foram uma generosa doação de R. Rackley (Cleveland Clinic). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen Corp., Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Gibco) e antibiótico /antimicótico a solução (Sigma, Inc., St. Louis, MO). Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. privação de soro foi realizada durante 16 h, mantendo as células em meio sem soro, com soro fisiológico tamponado (PBS) três lavagens de fosfato durante este período de tempo. Para células soro-estimular, foi adicionado 10% de FBS. A rapamicina foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).

Paciente espécimes

Todas as pesquisas envolvendo participantes humanos foi aprovado pelo IRB Cleveland Clinic e consentimento escrito foi obtido de pacientes. amostras de tecidos frescos foram obtidos no momento da cirurgia, flash congelado e armazenado a -80 ° C. As secções congeladas foram analisadas por microscopia para confirmar que maior do que 90% das células em amostras submetidas a análise de imunotransf erência foram as células tumorais. o grau do tumor foi confirmada por um patologista. Para a análise de immunoblot, amostras de tecido foram homogeneizadas usando o poder Gen 500 homogeneizador (Thermo Scientific, San Diego, CA).

Rictor silenciamento

siGENOME controle não-alvo (NTC) siRNA e siGENOME SmartPool siRNA específico-rictor foi obtido a partir de Dharmacon (Thermo Scientific). As transfecções foram realizadas durante 48 h, utilizando os Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Invitrogen). Silenciamento foi confirmada por análise de imunotransf erência.

A análise de imunotransferência

As células e as amostras de tecido foram extraídas em tampão RIPA contendo mistura de inibidores de protease (Sigma) e inibidores de fosfatase cocktails 1 e 2 (Sigma) e submetido a SDS-PAGE em géis de gradiente 4-15%. As proteínas foram transferidas para membranas Hybond ECL (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), utilizando o sistema de transferência semi-seco Bio-Rad Transblot (Investigação de Ciências da Vida, Hercules, CA). As membranas foram bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C em solução de bloqueio. Os anticorpos, os quais foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA), orientada rictor (1: 1000), p-AKT (Thr308; 1: 1000), p-AKT (Ser473; 1: 1000), Pan-AKT (1 : 2000), p-S6 (1: 2000), o total de-S6 (1: 2000), e actina (1: 5000). As membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) à temperatura ambiente durante 1 h e desenvolvido usando ECF ™ transferência de Western embalagens de reagentes (GE Healthcare). Densitometria foi realizada utilizando software Imagequant (GE Healthcare).

espalhando celular e análise morfométrica

As células foram tripsinizadas e semeadas a baixa densidade em tiras de câmara de borosilicato lamela (Nalge Nunc International, Naperville, IL) revestidas com 20 ug /ml de fibronectina. Tempo de imagem lapso foi realizada utilizando uma Leica TCS-SP2 com uma Plan-Apochromat 63x /1.4 objetivo óleo NA (Leica, Buffalo Grove, IL) durante 24 h e morfologia celular foi analisada utilizando software Image J. (http: //rsbweb.nih .gov /ij /). A área total de células individuais foi quantificado para cada ponto de tempo correspondente e representados graficamente em relação ao tempo decorrido.

modificação de feridas zero ensaios de migração

ensaios de modificação de migração zero ferida foram realizados como previamente descrito [19 ]. Resumidamente, placas de cultura de tecidos foram pré-tratadas com 20 ng de fibronectina /mL em PBS durante 1 h. Uma fina tira de polidimetilsiloxano (PDMS) foi colocado no meio de cada poço e deixadas a aderir. As células foram semeadas em cima e incubou-se durante 18 h, após o que as tiras de PDMS foram removidos para revelar uma matriz de fibronectina imperturbável. Vários campos de visão por poço foram fotografadas em intervalos regulares usando o microscópio Leica DM IRE2 (Leica) e software de imagem Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

ensaios de invasão Transwell

Transwell invasão Os ensaios foram realizados como previamente descrito [9] utilizando membranas de 8 micron (Corning PET Life Sciences, Tewksbury, MA) revestidas com Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). As células foram semeadas sobre as membranas em meio isento de soro (SFM) e deixadas migrar durante 24 h para uma câmara emparelhado contendo meio suplementado com FBS a 10%. As membranas foram fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas em 0,1% de Triton X-100, e corados com DAPI. A parte superior da membrana foi limpa com uma mecha de algodão de modo a que apenas as células foram contadas transmigrando. Os campos de visão a 200x de ampliação foram fotografadas aleatoriamente usando o microscópio Leica DMR eo número de células presentes foi quantificada usando software ImageJ.

bexiga parede invasão ensaio

Para os ensaios fatia bexiga, fresco, cheio -thickness fatias de parede da bexiga foram obtidas de pacientes submetidos a cistectomia radical e foram obtidos a partir de porções livres da doença de parede da bexiga por um patologista urológicas. A membrana basal foi retirado para expor o tecido conjuntivo (lâmina própria) e o aspecto externo da gordura perivesical foi incorporado em ágar. O tecido foi mantido em meio RPMI /FBS a 10% com antibióticos /antimicóticos durante 7-10 dias. células cancerosas da bexiga foram marcadas com CellTrackerTM vermelho, semearam-se sobre a fatia de tecido, e incubou-se durante 3-7 dias, com mudanças de meio regulares em intervalos de 24 h. A fim de avaliar a profundidade invasiva de células de tumor, o tecido foi seccionado perpendicularmente em 10 micron intervalos ver todas as camadas de tecido e as células foram visualizadas usando hematoxilina e eosina (H E) de coloração, imuno-histoquímica e imunofluorescência. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência Leica DMR e software avançado Mancha (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Profundidade de invasão foi medida usando o programa Image-Pro Plus em imagens capturadas (Media Cybernetics, Rockville, MD). A imuno-histoquímica para detectar citoqueratina AE1 /3 foi realizada tal como anteriormente [9] descrita usando um corante Descoberta XT automatizado.

Microscopia de imunofluorescência

coloração de imunofluorescência foi realizada como previamente descrito [20]. As células foram fixadas em PBS suplementado com 2 mM MgCl

2, EGTA 2 mM, e 4% de formaldeído, permeabilizadas em PBS contendo 0,5% de Triton X-100, incubou-se com p-paxilina anticorpo (Cell Signaling; 1: 1000) e visualizadas com anticorpos secundários conjugados com Alexa-anti-coelho (Invitrogen). Os núcleos foram coradas utilizando DAPI.

Rac1 /RhoA ensaio de activação

RhoA /Rac1 ensaios de activação foram realizados como descrito pelo fabricante (celular Biolabs, Inc., San Diego, CA). Resumidamente, as células foram cultivadas até 50-70% de confluência, tratou-se com FBS durante 30 min e transfectadas com ARNsi de 72 h antes da colheita. As amostras de controlo foram incubadas com GTPyS. quantidades equivalentes de proteína foram incubadas com PAK1-PBD de agarose ou Rhotekin-PBD de agarose (Millipore, Billerica, MA) durante 1 h a 4 ° C. As contas de agarose conjugadas foram lavadas 3 vezes em PBS e fervidas em tampão de amostra de SDS-PAGE. A imunotransferência foi realizada com anticorpos primários que detectam Rac1 (BD Biosciences, 1: 1000) e RhoA (Cell Signaling, 1: 1000).

Resultados

sinalização mTORC2 é aumentada em cancros da bexiga humanos invasivos

não-invasiva de baixo grau (LG) O UCA é definido por folhas de papilares revestidas por urotélio com a polaridade retidos e somente pouca atipia citológica (Figura 1A). Este histologia correlaciona com mutações frequentes em

FGFR3

e

RAS

[21]. Em contraste, não-invasivo de alto grau (HG) calciúria mostra alargamento nuclear, hipercromasia, e perda de polaridade que é comumente associado com mutações em

TP53

e

RB

genes (Figura 1B) . Num subconjunto de casos HG UCA, comportamento invasivo é observado (Figura 1C) e isto está associado com resultados piorou. Foram avaliadas as atividades mTORC2 em amostras de LG Uca, HG Uca, e HG calciúria com invasão de determinar a fosforilação de AKT em Ser473 (p-Ser473). Imunotransferência sugeriu um aumento em p-Ser473 em não-invasiva HG calciúria em comparação com lesões LG (Figura 1D) e um aumento adicional no p-Ser473 nas lesões HG invasivos. Densitometria comparação de índices de AKT p-Ser473 /total foi realizada, com resultados normalizados para não-invasivo LG calciúria (Figura 1E). Apesar do pequeno número de amostras impedida significância estatística, p-Ser473 apareceu aumento nas patologias mais avançadas.

Nós comparamos

A

, não-invasivo papilar de baixo grau calciúria (não-inv LG ; barra de escala de 80 microns);

B

, não-invasivo de alto grau papilar calciúria (não-inv HG; barra de escala de 80 microns); e

C

, de alto grau invasivo calciúria para determinar a atividade mTORC2 (barra de escala 100 microns).

D

, imunotransferência para p-Ser473 como um marcador de actividade mTORC2 foi realizada e mostra maior actividade em ambos mTORC2 HG não-invasivo e lesões invasivas.

E

, densitometria foi utilizado para quantificar p-Ser473 /total de intensidades de sinal AKT; médias e erro padrão da média (EPM) foram normalizados para a intensidade média do sinal para as amostras LG não-invasivos.

mTORC1 e mTORC2 são ativados em malignas células cancerosas da bexiga

Nós comparamos mTORC1 e mTORC2 sinalização em células imortalizadas-hTERT normais uroteliais (HU1) [22], células RT4 benignos bexiga derivados do papiloma e UMUC-3, T24, e J82 células de câncer de bexiga invasivo. mTORC1 actividade foi determinada através da medição da fosforilação de p70 S6 quinase (p-S6), ao passo que a actividade foi determinada por mTORC2 níveis de p-AKT Ser473. Sob as condições da linha de base, em meio contendo soro, as células RT4 HU1 e mostrou baixos níveis de fosforilação de AKT na treonina 308 (Thr308-p), o que reflecte a activação de PI3K e PDK1 a montante de AKT (Figura 2A). p-Ser473 e p-S6 também foram baixas em células HU1 e RT4. As três linhas celulares de cancro da bexiga malignas demonstraram aumento dos níveis de p-Thr308, p-S6, e p-Ser473.

A

, immunoblotting mostra maior mTORC1 (p-S6) e mTORC2 (p -Ser473) atividade no maligno UMUC-3, T24 e células de câncer de bexiga J82, em comparação com células uroteliais HU1 normais e células RT4 benignas.

B

, a estimulação induzida por atividade mTORC2 soro em células de cancro da bexiga malignas. sinalização mTORC1 foi responsivo a rapamicina neste modelo; mTORC2 não foi.

Em seguida avaliou-se a actividade e mTORC1 mTORC2 em células cancerosas da bexiga que foram tornadas quiescentes por privação de soro e depois estimuladas pela adição de soro (Figura 2B). Em células RT4, p-Ser473 foi fracamente detectáveis ​​antes e após a estimulação do soro. Nas células T24 e J82, p-Ser473 foi mínima após privação de soro, mas aumentou substancialmente com a adição de soro. células UMUC-3 demonstrou p-Ser473 mesmo depois de privação de soro e um aumento modesto em p-Ser473 após a adição de soro. Estes resultados sugerem que mTORC2 é activada em resposta à estimulação com soro em células cancerosas da bexiga invasivo. Em contraste, p-S6 aumentada em resposta a estimulação com soro na benigna, bem como células de cancro da bexiga malignas. Baixas doses de rapamicina (10 nM), um inibidor da mTORC1, bloqueou seletivamente p-S6 e teve pouco ou nenhum efeito sobre a atividade mTORC2 [9].

Em experimentos curso de tempo em células J82, atividade mTORC2 aumentou rapidamente após a estimulação com soro e foi mantida por meio de, pelo menos, 6 h em cultura (Figura 3A). A cinética de mTORC2 (p-Ser473) activação e desactivação foram semelhantes aos identificados para mTORC1 (p-S6). Para confirmar que a atividade mTORC2 especificamente refletido p-Ser473, nós silenciados rictor em células J82 usando reunidas siRNA. Tal como mostrado na Figura 3B, rictor gene silenciador foi eficaz e completamente ablated fosforilação do resíduo Ser473 em AKT em resposta ao soro. A fosforilação do alvo mTORC1, S6, não foi afectada, demonstrando especificidade no caso silenciamento. Non-alvo de controle (NTC) siRNA não alterou os níveis rictor ou resposta à estimulação do soro. Resultados semelhantes foram obtidos em experiências com células T24 (resultados não mostrados). Estes resultados demonstram rictor eficaz gene silenciador e uma redução associada na sinalização mTORC2.

A

, a estimulação do soro em células J82 mostra altos níveis de mTORC2 atividade (p-Ser473) por 5 min que persiste a 6 h.

B

, rictor gene silenciador utilizando a reunião de siRNA reduz drasticamente rictor proteína detectável e ablates p-Ser473 relativamente ao observado em células transfectadas com ARNsi NTC. Não foi detectado qualquer efeito sobre mTORC1 sinalização (p-S6).

mTORC2 é um regulador crítico da migração e invasão celular em câncer de bexiga

Foi utilizado um ensaio de ferida-zero modificada para avaliar a migração celular em células de câncer de bexiga T24 que foram transfectadas com NTC ou siARN-rictor específica (Figura 4A). O substrato foi fibronectina-revestido. Em células transfectadas com ARNsi NTC, migração substancial foi observado apenas na presença de soro. Rictor-específica siARN reverteu os efeitos de soro sobre a migração celular. A Figura 4B resume os efeitos de silenciamento-rictor sobre a migração de células T24 como uma função do tempo. Diminuição estatisticamente significativa na migração de células foram associados com rictor gene silenciador de 10 a 24 h. Resultados semelhantes foram obtidos quando rictor foi silenciado em células J82 e migração celular foi estudada (resultados não mostrados).

A

, privação de soro bloqueada J82 motilidade celular câncer de bexiga. A adição de soro induzida por migração robusta de células J82, que foram transfectadas com ARNsi NTC, tal como determinado utilizando um ensaio modificado zero. A migração foi inibida por rictor gene silenciador. A barra de escala 100 microns.

B

, quantificação mostra uma diminuição da distância de migração de células transfectadas com ARNsi específico rictor-(□) em comparação com células transfectadas com ARNsi de NTC (▲). Também são exibidas as células que não eram estimulados com soro (♦). Um total de 6 quadros foram analisadas para cada ponto de tempo por condição.

C

, transpoço invasão em membranas Matrigel-revestidas mostra os números mais elevados de células de câncer de bexiga malignas que invadem. D, rictor gene silenciador reduz significativamente a invasão de células de todas as três linhas de células malignas na bexiga Transwell ensaio. (*) Estatisticamente significativa comparação utilizando teste t de Student, p . 0,05)

invasão de células de câncer de bexiga foi inicialmente estudada usando reconstituído Matrigel em câmaras de Boyden. Cada uma das três linhas celulares de cancro da bexiga malignas demonstraram significativamente aumentada através invasão de Matrigel, em comparação com as células RT4 não malignos (Figura 4C). Rictor gene silenciador diminuiu significativamente a invasão por células cancerosas da bexiga malignos (Figura 4D). Em células J82, invasão foi inibida em mais de 80%. A eficácia da rictor gene-silenciamento sugeriu que mTORC2 pode ser um importante alvo para a inibição da invasão de cancro da bexiga.

Bexiga humana invasão da parede por células de câncer de bexiga requer mTORC2

Para apoiar ainda mais a nossa hipótese de que mTORC2 pode ser crítico na regulação invasão de células de câncer de bexiga, desenvolvemos um romance

ex vivo

sistema modelo para testar invasão do normal parede da bexiga. seções de espessura total de bexiga humano adulto, que incluiu lâmina própria (LP; fibroblastos predominante do tecido conjuntivo com os vasos sanguíneos), muscular própria (MP; feixes densos de músculo liso) e gordura peri-vesical (gordura PV; tecido principalmente fibroadiposo e capilares ) foram ancoradas em agar e banhadas em meio de cultura celular (Figura 5A). Nós semeadas com estas preparações de células J82 maligna marcado com fluorescência e permitiu que essas células para penetrar a parede da bexiga durante 72 h. J82 células que foram submetidas a rictor gene silenciador ou tratadas com siRNA NTC também foram inoculadas sobre as preparações da parede da bexiga. células invasoras foram prontamente identificadas por microscopia de luz (Figura 5B). coloração imuno-histoquímica para pancitoqueratina (citoqueratina AE1 /3) confirmou que as células invasoras foram epitelial de origem (Figura 5C). imagiologia fluorescente de células invasoras é mostrado na Figura 5D. Um aumento significativo na invasão foi observada quando as células malignas J82 foram comparadas com células RT4 (p 0,05; Figura 5E). Rictor gene-silenciamento nas células J82 reduziu significativamente a profundidade invasiva (Figura 5F), indicando um papel essencial para mTORC2 na regulação da invasão de células J82 no nosso

ex vivo

sistema modelo humano.

Uma

, esquemática, que mostra a orientação de ensaio de invasão da parede da bexiga humana que inclui lâmina própria (LP), muscularis propria (MP) e gordura perivesical (gordura PV). B, H E secção mostrando que invadem as células J82 na lâmina após 72 h (barra de escala de 200 microns)

C

, células realçadas no painel anterior mostrou imunomarcação positiva para pancitoqueratina (barra de escala 100 microns).

D

, mancha de imunofluorescência mostra a invasão de células malignas J82 (vermelho), às 72 horas (barra de escala 50 microns).

E

, quantificação de invasão dos tecidos por RT4 e J82 células (mícrons).

F

, rictor gene-silenciamento inibe significativamente invasão da bexiga tudo por células J82. (*) Comparação estatisticamente significativa pelo teste t de Student, p . 0,05)

Rac1 é um efector a jusante da mTORC2 em células de cancro da bexiga

Em seguida, examinou os efeitos de rictor gene-silenciamento em células J82 espalhando. As células que foram transfectadas com ARNsi NTC e deixada espalhar-se sobre a fibronectina mostrou grandes extensões citoplasmáticos e uma aparência morfológica achatada (Figura 6A). Em contraste, rictor gene silenciador produziu células ovóides menores que falharam para espalhar. A quantificação da área da superfície coberta pelas células aderentes confirmou que rictor gene silenciador atenuou significativamente a propagação de células J82 (Figura 6B). Nós próxima utilizado J82 células para avaliar a fosforilação de paxilina, que regula a formação de adesão focal e volume de negócios e pode regular a formação de lamellipodium [23]. Rictor gene silenciador reduziu o nível de fosfo-paxilina em células malignas J82 em relação às células transfectadas NTC. Análise de activação Rac1 em células J82 mostrou uma redução substancial no nível de GTP-carregado (activado) Rac1 (Rac1-GTP) quando rictor foi silenciada (Figura 6D). A densitometria revelou que rictor knockdown reduzida para níveis Rac1 60,2% de células que expressam rictor. Em contraste, RhoA-GTP activado foi modestamente diminuiu silenciamento rictor, com rictor knockdown reduzir a actividade de RhoA a 83,3% de células que expressam rictor (Figura 6E).

células J82 foram ou transfectadas com ARNsi específico rictor-NTC ou ARNsi 72 h antes do início da experiência.

A

, coloração de imunofluorescência mostra grandes prolongamentos citoplasmáticos e fosfo-paxilina periférica em células que são transfectadas com NTC siRNA. Este é reduzido nas células com rictor gene silenciador. barra de escala de 30 microns.

B

, as áreas da superfície das células foram determinados por J82 células transfectadas com NTC (♦) ou específicos de rictor siRNA (▲) e deixou-se espalhar para os tempos indicados (média ± SEM, n 15 para cada vez ponto; (*) p 0,05).

C

, imunotransferência para fosfo-paxilina em células J82, que foram transfectadas com rictor-específico ou NTC siRNA e deixadas a aderir durante 30 min.

D

, GTP-Rac1 foi determinada em células J82 transfectadas com NTC ou siRNA específico do Rictor. Rictor knockdown reduziu os níveis de Rac1 para 60,2% do controle. As células com GTPyS foram analisados ​​como um controlo positivo e PIB como controle negativo.

E

, GTP-RhoA carregado em células J82 transfectadas com ARNsi ou NTC-rictor específica. Rictor knockdown reduziu os níveis de RhoA a 83,3% do controle.

Discussão

No câncer de bexiga, invasão local na muscular própria (músculo detrusor) é um determinante importante do prognóstico e paciente subsequente terapia. Vias de sinalização que estão envolvidos exclusivamente na invasão de células de câncer de bexiga deve ser os principais alvos para o desenvolvimento de terapias. No entanto, comumente descritas alterações genéticas e de sinalização em câncer de bexiga não foram consideradas no contexto da invasão. HG Uca, que desenvolve comportamento invasivo em um subgrupo de pacientes, muitas vezes abriga mutações no

TP53

e

RB

. As mutações e /ou perda destes oncogenes têm sido implicados na regulação do ciclo celular defeituosa [21]. Alterações na fosfatase e tensina homólogo (PTEN) lípido fosfatase /proteína têm sido demonstrados em aproximadamente 30% dos pacientes com cancro da bexiga e englobam deleção homozigótica do gene, perda de heterozigotia (LOH), e de mutação genética [24]. No entanto, o impacto final de

PTEN

em cascatas de sinalização a jusante tais como mTORC2 na invasão câncer de bexiga não é clara.

Neste estudo, demonstramos que a atividade mTORC2 se correlaciona com o grau cancro da bexiga humana e invasão. No nível mecanicista, mTORC2 controla células de câncer de bexiga espalhando, migração e invasão de Matrigel. mTORC2 também regula invasão cancro da bexiga em um romance

ex vivo

modelo de bexiga humana, que capta o complexo microambiente da parede da bexiga. Aumento de actividade resulta na activação de mTORC2 Rac1, que é conhecido por promover a difusão e migração de células [25]. Estes resultados sugerem que mTORC2 activado pode constituir um elemento de sinalização crítica e segmentado na invasão de cancro da bexiga.

mTORC2 representa um dos dois braços de sinalização da cascata de mTOR. mTORC2 existe como um complexo que inclui mTOR e mLST8 e distingue-se da mTORC1 pela presença de rictor, protor mSIN1 e [26]. Em contraste com o complexo mTORC1 que regula a tradução em resposta a factores de nutriente de estado e de crescimento, mTORC2 controla os processos que requerem remodelação do citoesqueleto, tal como espalhamento e a migração celular. mTORC2 pode ser activado por PI3K estimulada por insulina, que promove a associação de mTORC2 com ribossomas [27,28]. Monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e glicogénio-sintase-quinase-3β inibir a activação mTORC2 [16,29].

Uma vez activado, mTORC2 fosforila Ser473 em AKT, que tem sido propostas para regular a actividade de AKT e da estabilidade [30]. GTPases da família Rho são relatados para funcionar como principais efectores a jusante de mTORC2 [10,12,17,31]. migração de neutrófilos no sentido quimioatractores é regulada por mTORC2 por um mecanismo que envolve MyoII e regulação da actividade de RhoA [32]. Em células de cancro do cólon, rictor gene silenciador induz a transição epitelial-mesenquimal (TEM) e inibe a motilidade celular por efeitos sobre tanto RhoA e Rac1 [10]. Considerando reduzida de E-caderina foi reportado nas linhas de células malignas UMUC-3, J82 e T24 linhas celulares em relação a células RT4 [6], knockdown de rictor no nosso sistema de modelo não parece inverter este fenótipo (dados não mostrados).

Em nossos experimentos com células de câncer J82 bexiga, rictor gene-silenciamento substancialmente diminuição da ativação Rac1 e tem um efeito mais modesto em RhoA. Em muitos sistemas de células, existem caminhos para regular Rac1 e RhoA reciprocamente [33]. Assim, mesmo uma redução modesta na activação RhoA em associação com rictor gene silenciador pode ser significativo nas células cancerosas da bexiga. Os efeitos marcantes de silenciamento rictor na célula se espalhando, migração e invasão são consistentes com os nossos resultados bioquímicos sugerindo que Rac1 é dos principais alvos da mTORC2 no cancro da bexiga. Uma ressalva é que rictor downdown também reduz p-Ser473, o que pode induzir mudanças adicionais a jusante na sinalização AKT que poderiam impactar invasão independentemente da atividade GTPase Rho.

Ao comparar a ativação mTORC2 em linhas celulares de cancro da bexiga, descobrimos que células UMUC-3 foram detectável único em que p-Ser473 esteve presente mesmo na ausência de soro. O aumento no nível basal de p-Ser473 em células UMUC-3 provavelmente reflecte a deleção homozigótica do nulo

PTEN

nestas células [9,34], eliminando um importante supressor de sinalização mTOR. células UMUC-3 pode representar um modelo para as células de câncer de bexiga em que

PTEN

está mutado. Cancros com

PTEN

deleção ou mutação são muitas vezes resistentes a agentes anticancerígenos direcionados que funcionam a montante da PTEN, tais como aqueles contra o receptor do factor de crescimento epidérmico [35]. As células T24 e J82 podem ser preferidos os modelos de cancro da bexiga, que ocorre na ausência de

PTEN

mutação. Estas células demonstraram níveis essencialmente não detectáveis ​​de P-Ser473 na ausência de soro e forte estimulação da actividade mTORC2 quando o soro foi adicionado.

O envolvimento de Rac1 como um importante alvo a jusante de mTORC2 na regulação da invasão cancro da bexiga pode ligar uma série de descobertas recentes na literatura. Um estudo mostrou que Rac1 regula a invasão de células do cancro da bexiga e a reorganização da actina ligados a jusante de quinase-integrina (ILK) [36]. Outro grupo relatou que rictor pode interagir fisicamente com ILK [37] para induzir a fosforilação de AKT Ser473 no, o que representa uma assinatura específica para mTORC2. Rac1 foi reportado para interagir directamente com mTOR de uma maneira independente de GTP [38].

Em conclusão, os nossos estudos demonstram que mTORC2 é um regulador crítico da migração câncer de bexiga e invasão, com efeitos mediados principalmente através Rac1.