Abstract

As proteínas da superfície celular CD133, CD24 e CD44 são marcadores putativos para o câncer estaminais populações de células no cancro do cólon, associados a tipos de câncer agressivos e mau prognóstico. É importante entender como esses marcadores podem predizer os resultados do tratamento, determinado por fatores como radiorresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre EGFR, CD133, CD24 e CD44 (incluindo isoformas) níveis de expressão e sensibilidade à radiação, e, além disso, analisar a influência das isoformas AKT nos padrões de estes marcadores de expressão, para melhor compreender o subjacente mecanismos moleculares na célula. Três linhagens de células de câncer de cólon foram utilizados, HT-29, DLD-1, e HCT116, juntamente com DLD-1 isog�nicas

AKT

knock-out linhas celulares. Todas as três linhas celulares (HT-29, HCT116 e DLD-1) expressa quantidades variáveis ​​de CD133, CD24 e CD44 e os dez por cento do CD133 e CD44 células que expressam (CD133

alta /CD44

alto) foram mais resistentes à radiação gama do que a dez por cento com menor expressão (CD133

baixo /CD44

baixo). A expressão de AKT foi menor na fracção de células com baixo CD133 /CD44. Depleção de AKT1 ou AKT2 usando knock out células mostraram pela primeira vez que a expressão de CD133 foi associada com AKT1 mas não AKT2, ao passo que a expressão de CD44 foi influenciado pela presença de um ou outro ou AKT1 AKT2. Havia vários genes na via de adesão celular que tinham significativamente maior expressão no

AKT Página 2 de linha de células KO em comparação com o

AKT

1 KO célula-line; genes no entanto importantes no epitélio a via de transição mesenquimal (

CDH1

,

VIM, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2

e

CDH2)

fez não diferem. Os nossos resultados demonstram que a CD133

alta /CD44

alta expressando células de cancro do cólon são associados com AKT e aumento da resistência à radiação, e que a AKT isoformas diferentes têm diferentes efeitos sobre a expressão de marcadores de células estaminais do cancro, que é uma consideração importante quando o direcionamento AKT em um ambiente clínico

Citation:. Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius B, Stenerlöw B, Nestor M (2014) Avaliação do Cancer Stem Cell marcadores CD133, CD44, CD24: Associação com AKT isoformas e resistência à radiação em células de cancro do cólon. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10.1371 /journal.pone.0094621

editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Setembro, 2013; Aceito: 19 de março de 2014; Publicação: 23 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sahlberg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Swedish Cancer Society, www.cancerfonden.se. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é um dos tumores malignos diagnosticados mais comuns no mundo. Diversos estudos identificaram subpopulações de células de cancro colo-rectal que são mais resistentes aos tratamentos do cancro tais como agentes quimioterapêuticos e radiação [1], [2]. O sucesso do tratamento depende da eliminação destas subpopulações altamente resistentes, e não apenas a massa do tumor principal. Estas células são muitas vezes referidas como cancro de células estaminais ou células iniciadoras de tumores, e vários marcadores de superfície celular têm sido mostrados para ser expresso nestas populações de células [3]. CD133, CD44 e CD24 são três marcadores proposta de células-tronco em câncer colorretal, mas desencorajadoramente a distribuição difere entre pacientes e linhas de células tumorais [4]. Por conseguinte, é de grande interesse para compreender a sua função e como os marcadores interagem uns com os outros.

CD24 é uma proteína da superfície celular, que é ancorado no lado externo da membrana plasmática. Acredita-se que tem um papel essencial na diferenciação celular, e também é expresso em células envolvidas no sistema imunitário, tais como linfócitos B, onde regula positivamente a proliferação de células T activadas. expressão de CD24, também está descrito no sistema nervoso central [5]. A distribuição no câncer colorretal está sob disputa, embora estudos anteriores mostraram que entre 50 e 68% dos pacientes que sofrem de cancro colorectal expressa CD24 com um alto grau [5], [6], e ainda que subpopulações positivas CD24 de células de câncer de cólon -lines possuem haste propriedades da célula-like [7]. Em contraste, as células de tumor de cancro da mama cabeça e pescoço e de iniciação tem sido mostrado para ser CD24 negativo [8], [9].

CD133 (também chamado Prominin-1) acredita-se estar associada com tumorigenicidade e progressão da doença. O aumento da regulação do CD133 no câncer colorretal se correlaciona fortemente com mau prognóstico e metástase hepática síncrona [10], embora o papel preciso e função de CD133 é desconhecida.

CD44 tem um papel na facilitação da célula para célula e célula-matriz interacções através da sua afinidade para o ácido hialurónico e está envolvido na adesão célula-e o conjunto de factores de crescimento na superfície da célula. CD44 é codificada por um único gene, incluindo 20 exões. A forma padrão (referido como CD44s) consiste de exão 1-5 e 15-20. Os exões variáveis ​​são identificados como V1-V10, respectivamente. A utilização diferencial dos 10 exões variantes gera múltiplas variantes de CD44 (CD44v) com diferentes combinações de produtos variante exão. Várias isoformas de CD44 surgir por inserção de um ou mais dos exões variantes no esqueleto comum partilhada por todas as formas de CD44. O papel destas isoformas variantes não é completamente compreendido, embora alguns são acreditados para mediar um passo crítico na metástase do cancro do cólon [8], [11], [12]. CD44 podem ser co-imunoprecipitada com a família de quinases de tirosina receptores ErbB tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e que também interage com o receptor HER2, HER3 e HER4 [8], [13]. EGFR acredita-se desempenhar um papel importante na regulação e manutenção das células de haste do cancro, principalmente por meio de sinalização a jusante através da Phospho-inositol 3-quinase (PI3K) /AKT [14], [15].

é AKT uma cinase serina /treonina com três isoformas diferentes, AKT1, AKT2 e Akt3 expressa a partir de genes separados e três activada por muitos estímulos, tais como vários receptores do factor de crescimento (por exemplo, EGFR), receptores de células B e T. Tem um papel central em muitas funções celulares responsáveis ​​pela proliferação, sobrevivência, crescimento, anti-apoptose, a captação de glicose, metabolismo, angiogénese e radiorresistência [16]. AKT, também se acredita estar envolvido na epitelial para mesenquimal (EMT) via que leva a um aumento da motilidade, reduziu a adesão intercelular, a progressão do tumor e transformação maligna. A via de EMT é, portanto, envolvido na invasão de células de cancro e metástase [17]. Os indutores da EMT, tais como ligandos do receptor tirosina-quinase ou factor de crescimento transformante beta (TGF-p), Wnt e Notch, desencadeia uma cascata de sinalização celular que provoca a supressão da adesão celular da proteína E-caderina. O processo envolve a regulação positiva de agindo repressores de transcrição directos, como Caracol, Lesma, caixa de forkhead C2 e Zeb1, Zeb2, bem como Twist and E47 que indiretamente reprimir E-caderina. Outros marcadores de EMT são N-caderina, vimentina e Fibronectina-1, que são expressos em células mesenquimais [18]. EMT também tem sido mostrado para ser envolvido em células-tronco de cancro em que as células de cancro do cólon com uma elevada expressão de CD133 /CD44 mostraram EMT após cultura a longo prazo [18], [19].

AKT tem sido proposto para ser co-expressa com CD133, proporcionando a população de células que expressa CD133, com uma maior resistência para agentes quimioterapêuticos, mas os detalhes sobre esta interacção não são conhecidos [20], [21]. CD44 é acreditado para correlacionar negativamente com AKT [22]. No entanto, vários estudos têm demonstrado que a AKT é em vez fosforilada quando estimulante de CD44 com o ligante, provocando um efeito de sobrevivência das células [23] – [25], e é provável que as isoformas de CD44 tem um papel regulador podendo tanto activar e suprimir o activação de AKT. si A radiação também foi demonstrado que o aumento da expressão de AKT, CD133, e de reduzir a expressão de CD44 em células de cancro colorrectal [26]. No entanto, anteriormente não foi estudada a importância das diferentes isoformas AKT sobre a CD133 ou a expressão de CD44.

Demonstrámos recentemente que tanto AKT1 AKT2 e são importantes na resposta à radiação [27]. Batendo-out tanto

AKT

1 ou

AKT Página 2, ou ambos simultaneamente, aumentou a sensibilidade à radiação ea taxa de reunir dupla cadeia de DNA foi prejudicada no

AKT

1 /2 linhas de células KO. No presente estudo, investigamos as diferenças nos padrões de expressão de CD133, CD24, CD44 e EGFR em três cólon câncer linhas celulares; HT-29, HCT116 e DLD-1. Analisamos também a sensibilidade à radiação das células cancerígenas do cólon classificadas para CD133

alta /CD44

alto e CD133

baixo /CD44

baixa expressão, e investigou ainda mais a influência de duas isoformas AKT (AKT1 , AKT2) na CD133 e a expressão de CD44, incluindo as isoformas de CD44 variante de splicing. AKT3 não é expresso nas linhas celulares estudadas, e, por conseguinte, foi excluída. Além disso, validado o efeito da AKT sobre a expressão gênica em uma análise transcriptomic em grande escala de múltiplas vias.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O cell- cancro do cólon linhas HT-29 e HCT116 foram adquiridos a partir da cultura American Tissue Coleção (ATCC, Manassas, VA, EUA), números de catálogo ATCC CCL-221 e ATCC CCL-247, respectivamente. DLD-1 X-MAN isog�nicas linhagens de células foram obtidas a partir Horizon Descoberta Ltd com as diferentes isoformas AKT geneticamente bateu-out, número de catálogo HD-R00-001, HD-R00-002 e HD-R00-003. As células foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura (superfície Nunclon, Roskilde, Dinamarca) em meio de McCoy 5A (Flow Irvine, Reino Unido) com soro de bovino fetal a 10% (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA), 2 mM de L-glutamina, penicilina 100 IU /ml e 10 ug /ml de estreptomicina (Biochrom kg, Berlim, Alemanha). As células foram cultivadas numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C e tripsinizadas com tripsina-EDTA, 0,25% de tripsina, EDTA a 0,02% (Biochrom kg, Berlim, Alemanha).

celular triagem com Citometria de fluxo

Para análise de citometria de fluxo das linhas de células foram colhidas usando não-enzimática solução de dissociação de células (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) ou 0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA, (Biochrom kg , Berlim, Alemanha). Após a ressuspensão das células em meios de cultura de células, as células foram contadas e lavadas em PBS com 0,5% de BSA e recolhidas por centrifugação. As células foram incubadas durante 10 a 30 minutos com os anticorpos marcados, ver Tabela 1. Após o anticorpo marcação das células foram lavadas em PBS com BSA a 0,5% antes da análise por citometria de fluxo foi realizada num SORP LSRII BD (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, EUA). Morrendo e as células mortas foram coradas com iodeto de propídio e excluídos da análise. Duplicatas e células mortas também foram excluídos por gating com o FSC e SSC. Para a célula-ordenação para ensaio clonogênica a diva FACSVantage SE ou FACSAriaIII celular classificador (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, EUA) foram utilizados.

Cell-ciclo Análise

As células foram fixadas com 70% de etanol, 30% de PBS e mantida em -20 ° C durante pelo menos 24 horas. As células foram centrifugadas durante 10 minutos, em 2000G 4 ° C e lavadas duas vezes com PBS antes da incubação com 5 ug de propídio iodo /0,1% de NP-40 (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) em PBS, juntamente com 5 ug de RNase (Sigma Aldrich , St. Louis, EUA) durante 30 minutos à temperatura ambiente. A análise foi feita com citometria de fluxo (BD Biosciences LSRII).

clonogênica Ensaio

A associação entre a expressão de CD133 e CD44 e sensibilidade à radiação foi avaliada por triagem e coleta CD133

alta /CD44

/CD44

baixa expressando células de alta e CD133

baixos. O número de células após separação foi determinada com um contador de células (contador de células TC 20 automatizada, Biorad ciências da vida, Hercules, CA, EUA)), e uma certa quantidade de células foi pré-colocadas em placas em 25 cm

2 frascos de cultura de tecido. No dia seguinte, as células foram expostas a radiação aplicada externamente utilizando uma

fonte de 137Cs (Melhor Theratronics Gammacell 40 Exactor, Springfield, EUA). Após um período de tempo de incubação de 8-14 dias, as células foram lavadas em PBS e fixadas com etanol a 99,5% durante 5-10 min. As colónias foram coradas com Hematoxilina de Mayer (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Suécia) durante 20-30 min e em seguida lavado com água. Colónias com mais de 50 células por colónia foram contados e a eficiência de plaqueamento (PE = número de colónias em células não tratadas /número de células semeadas) ea fração de sobrevivência (SF = número de colónias em células tratadas /número de células semeadas × PE) foram calculados e plotados.

análises estatísticas

citometria de fluxo análises foram avaliados utilizando BD software FACSDiva 7,0 (BD Biosciences). Os dados do ensaio clonogênica foi processado com o Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) e gráficos foram tabulados e analisados ​​com ANOVA one-way, em GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EUA). Foi utilizado um nível de significância de 95%. Esta análise avaliou se as fracções de sobrevivência das células separadas CD133 e CD44 irradiadas foram significativamente diferentes umas das outras para cada dose de radiação.

Western Blot

As células foram cultivadas em placas de Petri de 3 cm durante pelo menos três tempos de duplicação lysation antes ou três culturas de células separadas de DLD-1 foram classificadas por citometria de fluxo (ver acima) e o volume do tampão de lise foi ajustado para o número de células colhidas em cada frasco. Os lisados ​​foram preparados pós-tratamento por lavagem das células com PBS gelado seguido por adição de 10 000 000 células /ml de tampão de lise contendo 1% de Tween-20, Tris 20 mM (pH 8,0), 137 mMNaCl, 10% de glicerol, 2 mM de EDTA, 1 mM de ortovanadato de sódio activados (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) e cocktail de inibidor de protease (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) e incubação em gelo durante 30 min. Os lisados ​​foram centrifugados durante 10 min em 4 ° C. O sobrenadante foi transferido para tubos novos e o sedimento descartado. A concentração de proteína do ligado foi determinado por ensaio de proteína BCA (Pierce). Quantidades iguais de proteína foram carregadas numa Tris-acetato 3-8% de gel SDS-PAGE (Life Technologies, Carlsbad, CA) e depois transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Millipore) por transferência húmida. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada durante 1 h em 5% de BSA, PBS e depois incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Anticorpo específico para CD133 /1 (W6B3C1) era de Miltenyi Biotech (Heidelberg, Alemanha) e CD44 (103014) a partir de BioLegend (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos contra FOXO3a (2497), fosfo-FOXO (2599) e GSK-3beta (9315) e fosfo-GSK3B (9323) eram todos de Cell Signaling Technology (Beverly, MS, EUA). AKT1 (sc55523 e AKT2 (sc5270) eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anticorpos contra β-actina (A5441) foi da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA). Após lavagem em PBS com 1% Tween-20, a membrana foi incubada com o anticorpo de rábano marcado com peroxidase secundário (626.520 e 656.120) (Invitrogen, Camarillo, CA, EUA) ou (405,405) (BioLegend, San Diego, CA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. bandas imuno-reactivas foram visualizadas em uma câmera CCD (SuperCCD HR, Fujifilm, Japão) após o tratamento com Immobilon solução electro-quimioluminescente (Millipore, Billerica, MA, EUA) durante 5 min.

Microarray Expression Analysis

Duas passagens separadas de DLD-1 parental,

AKT

1 KO,

AKT Página 2 KO e

AKT

1/2 células KO foram cultivadas a 70% confluência e o ARN foi extraído (RNeasy mini-prep, Qiagen, Valencia, CA, EUA) a concentração de RNA foi medida com ND-1000 espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Wilmington, dE) e a qualidade do RNA foi avaliada usando o sistema de Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA). 250 nanogramas de RNA total de cada amostra foram utilizadas para gerar ADNc amplificado e biotinilado sentido de cadeia simples a partir de todo o genoma expresso de acordo com o GeneChip WT PLUS Reagente manual kit de utilizador (P /N 703174 Ap 1 Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) . GeneChip HTA matrizes (GeneChip transcriptoma humano matriz 2.0) foram hibridizados durante 16 horas numa incubadora a 45 ° C, rotação a 60 rpm. De acordo com o Expression GeneChip Wash, Stain e verificação manual (PN 702.731 Rev 3, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) as matrizes foram então lavadas e coradas utilizando o Fluidics Station 450 e, finalmente, digitalizados utilizando o Scanner GeneChip 3000 7G.

Microarray Análise de dados

os dados brutos foi normalizado no Console de Expressão software gratuito fornecido pela Affymetrix (https://www.affymetrix.com) utilizando a média multi-matriz robusta método (RMA), primeiro sugerido por Li e Wong em 2001 [28], [29]. A análise posterior dos dados de expressão gênica foi realizada na estatística linguagem de computação R livremente disponível (https://www.r-project.org) usando os pacotes disponíveis a partir do projeto Bioconductor (www.bioconductor.org). A fim de procurar os genes diferencialmente expressos entre pais e

grupos AKT

KO um Bayes empírico moderado t-teste foi aplicado, utilizando o pacote ‘limma “[30]. Para abordar o problema com o teste múltiplo, os valores de p foram ajustados usando o método de Hochberg Benjamini e [31]. Os dados normalizados foi ainda avaliada utilizando recursos DAVID Bioinformatic 6,7 a juntamente com Kyoto enciclopédia de genes e genomas (KEGG) do banco de dados via (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) para classificar funcionalmente e agrupar os genes relacionados epiteliais para caminhos de transição mesenquimal [32], [33].

a confirmação da

AKT

1 e

AKT Página 2 de Knock-out com PCR

RNA total foi isolado de DLD-1 parental,

AKT

1 KO,

AKT Página 2 KO e

AKT

1/2 células KO com RNeasy mini-kit (Qiagen, Valencia , CA, EUA). O ADNc foi sintetizado a partir de 0,1 ug de ARN total utilizando RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit com iniciadores de hexâmero aleatório (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e a PCR foi realizada com a Taq ADN Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) com primers contra AKT1 (Fwd: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) ou AKT2 (Fwd: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC)

a transfecção com siRNA contra AKT1 em DLD-1 células parentais

As células foram. transfectadas com siAKT1 silenciador (Ambion por Life Technologies, Carlsbad, CA) com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) (senso: 5 ‘GCGUGACCAUGAACGAUUtt e anti-sentido: 5’AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). As células transfectadas foram incubadas em 37 ° C num

2 incubadora de CO durante 48 horas antes da análise da expressão CD133, CD44 e CD24 em citometria de fluxo, ver acima.

reactivação de AKT1 em ou AKT2 DLD-1

AKT

1/2 células KO

DLD-1

AKT

1/2 células KO cultivadas a uma confluência de 30-50% em McCoys antibiótico-livres meio de células (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) durante 24 horas antes da transfecção. As células foram transfectadas com pcDNA3 myr HA AKT1 e pcDNA3 myr HA Akt2 plasmídeos gentilmente cedidas por William Sellers (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, EUA), através Addgene (Cambridge, MA). Lipofectamine 2000 e OptiMEM eram da Life Technologies (Carlsbad, CA). As células transfectadas foram incubadas em 37 ° C num CO

2 incubadora durante 72 horas antes de analisar adicionalmente a CD133, CD44 e expressão de CD24 por citometria de fluxo, ver acima.

Resultados

CD133, CD44, CD24 e expressão do EGFR no cancro do cólon linhas celulares

O CD133, CD44, CD24 e expressão EGFR em três linhagens de células de câncer de cólon foi analisada com citometria de fluxo, consulte a Figura 1A. Houve uma diferença na expressão de CD133, CD44, CD24 e EGFR entre as linhas celulares. CD44 foi exibido como uma população que se estende de baixo para expressão elevada em todas as três linhas celulares. A detecção da expressão de CD24 foi dependente do anticorpo anti-CD24. A maior expressão de CD24 foi observada nas células HT-29 com as células positivas de 95%, utilizando o anticorpo de CD24 a partir de MACS), ver figura 1B. CD133 foi expresso na maioria das células HCT 116 e HT-29, ao passo que apenas 14% das células DLD-1 eram positivos para CD133. Todas as três linhas de células expressa EGFR. Cerca de 80% do HT-29 e HCT116 onde positivo para EGFR enquanto 40% foram positivos em DLD-1.

A) HT-29, HCT116 e DLD-1. Os padrões de expressão nas dotplots são de um fluxo representante citômetro experimento. A grade demonstra a margem entre alta e baixa expressão da proteína definida pelos controlos isotípicos. B) A expressão de células positivas de CD24 em citometria de fluxo depender do anticorpo anti-CD24. A tabela mostra a porcentagem de células positivas CD24 utilizando três anticorpos CD24 diferentes.

Radiosensibilidade de CD133

alta /CD44

alto e CD133

baixo /CD44

baixo Expressando células

a associação entre a expressão de CD133, CD44 e sensibilidade à radiação foi avaliada por triagem e coleta CD133

/CD44

células baixo expressam elevados e CD133

baixo /CD44

altos , seguido pela exposição ao aplicado externamente radiação gama, e analisadas com ensaios clonog�icas, veja a Figura 2. a maior resistência à radiação no CD133

alta CD44

população elevada /em comparação com o CD133

baixo /CD44

população de baixa foi observada em todas as linhas celulares. Estas diferenças foram estatisticamente significativas para todas as doses de radiação (2, 4 e 6 Gy) para as células DLD-1, ver Figura 2C, a 4 e 6 Gy para células HCT116, e a 4 Gy para as células HT-29, ver Figura 2A e B, com um valor P 0,05 (one-way ANOVA). Não havia nenhuma ou uma pequena diferença na expressão de CD24 na CD133

alta /CD44

alto e CD133

baixo /CD44

população de baixa, exceto em HCT116 onde havia células CD24 menos positivos na o CD133

baixo /CD44

baixa fração. O número de células positivas para EGFR nas frações escolhidas foram quase o dobro na CD133

alta /CD44

elevado em comparação com o CD133

baixo /CD44

baixa fração de HT-29 e DLD-1 células enquanto em HCT116 havia apenas uma pequena diferença na expressão EGFR entre as frações. A sensibilidade à radiação de células não triados é mostrado na Figura S1.

ensaio clonogénico de A) HT-29, B) e HCT116 C) As células DLD-1. A parte superior e inferior 10 por cento do CD133 e CD44 células que expressam foram ordenados por citometria de fluxo (CD133

alta /CD44

alto ou CD133

baixo /CD44

baixo) ea radiação sensibilidade foi analisada utilizando clonogênica ensaios. Os controlos de ambas as fracções foram normalizados e definido como 100% de sobrevivência. As barras de erro representam o erro padrão da média de pelo menos duas experiências separadas com amostras em triplicado. A maior resistência à radiação no CD133

alta /CD44

população elevada em comparação com o CD133

baixo /CD44

população de baixa foi observada em todas as linhas celulares. Estas diferenças foram estatisticamente significativas para todas as doses de radiação (2, 4 e 6 Gy) para as células DLD-1 (Figura 2C), a 4 e 6 Gy para células HCT116, e a 4 Gy por células HT-29 (Figura 2A e B ) com um valor de P 0,05 (one-way ANOVA). A percentagem de células positivas para EGFR, CD24 com anticorpo biociência BD ou CD24 com Miltenyi Biotech /MACS foram analisadas com citometria de fluxo.

A expressão de AKT em CD133

positiva /CD44

positiva e CD133

População negativo negativo /CDD44

em DLD-1 |

As diferentes populações de CD133

positiva /CD44

positiva, CD133

negativo /CD44

positiva e CD133

negativo /CD44

negativa em células DLD-1 foram classificadas, recolhidos e analisados ​​para a expressão de AKT com western blot, veja a Figura 3A e B. a expressão de AKT total foi menor no CD133

/CD44

populacional negativo negativo em relação à população positiva para CD44 e /ou CD133. padrão similar foi observado para AKT1 e AKT2, veja a Figura 3B.

) células DLD-1 A, foram ordenados por citometria de fluxo e diferentes populações com CD44

positiva /CD133

negativo (Q1), CD44

positiva /CD133

positivo (Q2), CD44

negativeCD133

negativo (Q3), foram coletadas. B) As células separadas foram ainda analisados ​​com western blot para AKT total AKT1 ou AKT2 e betaactin expressão.

Influência da AKT isoformas na expressão de CD24, CD133 e CD44

desde a expressão AKT foi diferente no CD133 ordenada

positiva /CD44

positiveand CD133

negativo /CD44

populações negativas, a influência das isoformas AKT foi avaliada usando a célula-line câncer de cólon DLD-1 e

AKT

1,

AKT

2 e

AKT

1/2 linhas celulares de knock-out isogênicos, veja a Figura 3AB, e confirmação de knock-out na Figura S2. A intensidade de fluorescência média (IFM) da expressão de CD44 foi aumentada de 100% em parental a 150% em

AKT

1 KO e

AKT Página 2 KO e 250% no

AKT

1/2 KO célula-line, veja a Figura 4A e B. além disso, a expressão CD133 foi reduzida quando AKT1 foi nocauteado como visto no

AKT

1 KO, bem como no

AKT

1/2 células-line KO. No entanto, única knock-out de

AKT Página 2 como visto no

AKT Página 2 de células-line KO não reduzir o nível de CD133, veja a Figura 4A. A expressão de CD24 foi completamente abolida na

AKT

1/2 KO, mas aumentou no single

AKT

1 ou

AKT

2 linhagens de células KO veja a Figura 4C. A influência das isoformas AKT sobre a expressão de CD24, CD133 e CD24 foram ainda verificados com ARNsi contra AKT1 e pela reintrodução de AKT1 ou AKT2 no DLD-1

AKT

1/2 linha celular de KO, ver figuras S3 e S4. Para além disso, confirmou-se que não havia nenhuma diferença na distribuição do ciclo celular entre as linhas celulares, ver Figura 4D.

A) Nas células parentais, aproximadamente 10% das células eram células positivas CD133. No entanto, no

AKT

1 e

AKT

1/2 bater-outs, as células positivas CD133 foram reduzidos para 0,3 e 0,1%, respectivamente. Isto não foi visto no

AKT Página 2 de linha de células knock-out, onde 33% das células foram positivos para CD133. B) A intensidade de fluorescência média de CD44 normalizados para o parental a linha de células DLD-1 aumentou para 150% em

AKT

1 KO, 160% no

AKT Página 2 KO e 300% em

AKT

1/2 células-line KO. As barras de erro representam o desvio padrão (DP) de pelo menos duas experiências. C) A percentagem de células positivas de CD24 analisados ​​com dois anticorpos diferentes de CD24 a partir de BD Biosciences e Miltenyi /MACS em citometria de fluxo. Os desvios padrão são de experiências repetidas. D) a distribuição do ciclo celular em 1 DLD-1/2 células KO parentais,

AKT

1 KO,

AKT Página 2 KO e

AKT

.

Influência de AKT Isoformas sobre a expressão de CD44 variante Isoformas

a maioria (98-100%), de DLD-1, HCT116 e células HT-29 foram positivas para CD44, detectado com um anticorpo que detecta todas as variantes de CD44. O padrão de expressão de CD44 isoformas variantes V3, V4 /5, v6, v7 e v7 /8 foram investigados no DLD-1 dos pais e

AKT

1/2 linhas celulares KO ver Tabela 2. Apenas um pequeno quantidades (~1-6%) de células foram positivas para as isoformas variantes CD44 (expressão em células individuais, ao vivo), e sem mudanças significativas nos níveis de expressão entre AKT proficientes e deficientes linhas celulares DLD-1. No caso de CD44v7, que teve um maior nível detectável, a expressão foi ligeiramente reduzida na

AKT

1/2 células KO comparação com parental.

As análises bioquímicas de DLD- 1

AKT

Bata para fora Cell-linhas

análise de Western blot avaliado ainda mais a expressão da proteína CD133 e CD44, bem como Fox0 e GSK3β e sua influência por isoformas AKT. A expressão de CD44 foi regulada no

AKT

1 KO,

AKT Página 2 KO e

AKT

1/2 linhas celulares KO comparação com parental eo CD133 expressão foi reduzida em

AKT

1 KO e

AKT

1/2 linhas celulares KO, mas não no

AKT Página 2 KO célula-line como visto no fluxo análise de citometria. O

AKT

1, A

KT

2 e

AKT

1/2 linhas celulares KO tinha uma expressão reduzida de fosforilada Fox01 e Fox03a, bem como uma expressão reduzida em total de Fox03a em

AKT

1/2 células-line KO. No entanto, não houve diferenças na expressão de fosforilada (S9) ou total GSK3β entre o

AKT

KO linhas celulares, ver Figura 5A.

expressão A) Proteína de CD44, CD133, fosfo-FOXO, FOX03a total, a fosfo-GSK3β e GSK3β totais a partir da análise de western blot. B) A expressão genética, aumento da regulação (+), a regulação negativa (-) ou não alterado (NC), de CD44, CD24, CD133, FOX01, FOX03, FOX04, GSK3β e LYN no DLD-1

AKT

1 KO,

AKT Página 2 KO ou

AKT

1/2 células KO em comparação com DLD-1 células parentais.

Diferenças em Gene Expression em os DLD-1 AKT isoformas knock-out linhas celulares

análise de expressão gênica foi realizada para investigar as diferenças entre o isogênico

AKT

isoformas knock-out linhas celulares veja a Figura 5B. Genes foram consideradas significativamente para cima ou jusante regulada com relações de ≥ 1,5 dobrar e com p 0,05. O knock-out do

AKT

1 e

AKT

2 isoformas foi confirmada nas linhas celulares DLD-1 e da expressão gênica de CD44 e CD133 confirmou os resultados da citometria de fluxo e ocidental análise de mancha. CD44 foi regulada no

AKT

1,

AKT

2 e

AKT

1/2 linhas celulares KO comparado a linha de células parental e CD133 foi para cima regulado no

AKT Página 2 KO, mas regulada para baixo em

AKT

1 e

AKT

1/2 linhas celulares KO. A expressão de CD24 foi menor no

AKT

1/2 células-line KO comparação com parental no entanto; não houve diferença nos

AKT

1 ou

AKT

2 linhagens de células KO. FOXO1 foi regulado para cima em

AKT

1 KO e

AKT

1/2 células-line KO, enquanto FOXO3 só foi regulado para cima em um único

AKT

1 KO e

AKT

2 linhagens de células KO. Não houve diferença na expressão FOXO4 entre as linhas celulares. LYN foi regulada apenas no

AKT

1/2 KO no entanto, não houve diferença na expressão de GSK3β entre as linhagens de células, consulte a Figura 5B.

Avaliação das Diferenças no epitelial para mesenquimal transição, Notch, Wnt e Adesão celular Pathways entre

AKT Página 2 KO e

AKT

1 KO linhas celulares

Um marcador para epitelial para mesenquimal (EMT ) é a redução da adesão celular. Havia vários genes na via de adesão celular (

CLDN1, ITGB8, NEO1

e

PVRL3

) que teve significativamente maior expressão no

AKT Página 2 KO célula-line em comparação ao

AKT

1 célula-line KO. Além disso, a indução de EMT envolve receptores Notch e Wnt e de tirosina-quinase.