Abstract

Gota digital de PCR (ddPCR) pode ser utilizado para detectar mutações de baixa frequência no pulmão conduzida-oncogene Câncer. A gama de

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mutações pontuais observados em NSCLC exige uma abordagem multiplex para detecção de mutações eficiente no DNA circulante. Aqui relatamos o projeto e otimização de três ensaios multiplex ddPCR discriminatórias que investigam nove diferentes

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mutações usando PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutação Os ensaios eo sistema Bio-Rad QX100. Juntas, essas mutações são responsáveis ​​por 95% das mudanças de nucleotídeos encontrados em

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no câncer humano. reações multiplex foram optimizados em DNA genômico extraído de

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linhas de células mutantes e testados em DNA extraído de tecido tumoral fixado a partir de uma coorte de pacientes com câncer de pulmão sem o conhecimento prévio do específica

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genótipo. Os ensaios ddPCR multiplex tinham um limite de detecção de melhor do que um mutante

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molécula em 2000 de tipo selvagem

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moléculas, que compara favoravelmente com um limite de detecção de 1 em 50 para o próximo sequenciamento geração e 1 em 10 para seqüenciamento Sanger. Multiplex ddPCR ensaios, assim, proporcionar uma metodologia altamente eficiente para identificar

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mutações no adenocarcinoma de pulmão

Citation:. Pender A, Garcia-Murillas I, Rana S, Cutts RJ, Kelly G, K Fenwick , et ai. (2015) Genotipagem eficiente de

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celular mutante não pequenas do pulmão usando uma abordagem multiplexada Gota Digital PCR. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10.1371 /journal.pone.0139074

editor: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Grécia, ITALY

Recebido: 12 de fevereiro de 2015; Aceito: 09 de setembro de 2015; Publicação: 28 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Pender et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:. os autores agradecem o apoio deste trabalho pelo Serviço Nacional de Saúde (Inglaterra), através de financiamento com o Instituto Nacional de Centro de Investigação em Saúde de Investigação Biomédica da royal Hospital Marsden. Eles também agradecem o financiamento do Instituto de Pesquisa do Câncer e Câncer Research UK, Programa de Medicina estratificada. Esta pesquisa também foi apoiado em parte pela Revere Charitable Trust, uma concessão educacional irrestrita da Pierre-Fabre Ltd., o Conselho Europeu de Investigação Avançada Grant RASTARGET eo Prêmio Wellcome Trust Senior Investigator, 103799 /Z /14 /Z. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O financiamento fornecido por Pierre-Fabre Ltd. não representa um interesse competindo para qualquer dos autores, e relativa ao emprego, nenhuma outra declaração relevante, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados é necessário. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1] e mais de 20 000 casos de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram diagnosticados no Reino Unido em 2012 [2]. Os oncogenes mais frequentemente mutados em adenocarcinoma de pulmão são o

RAS

GTPases da família e

EGFR

(25% e 15%, respectivamente [3]). O conhecimento do perfil molecular de adenocarcinoma do pulmão em estado avançado é crítico para a [4], particularmente na utilização de inibidores da tirosina-cinase EGFR e alq [5,6] de tomada de decisão terapêutica. A presença de um

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mutação pode também ser de importância terapêutica, se combinações de inibidores de MEK e taxano provar eficazes neste grupo de pacientes [7]. Obtenção de tecido tumoral adequada para a genotipagem conclusiva no cancro do pulmão pode ser problemático, no entanto [8]. Gota de PCR digital (ddPCR) é um método sensível de detecção de mutação quantitativa [9,10] que tem o potencial para a genotipagem com precisão de material derivado do paciente a partir de uma pequena quantidade de material de partida.

Detecção de

KRAS mutações hotspot

por ddPCR tem sido limitada pela variedade de potenciais alelos dentro de loci adjacentes, embora alguns

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mutações ocorrem mais comumente em câncer do que outros (Tabelas 1 e 2). As quatro mutações mais comuns são responsáveis ​​por 80% de todas as alterações KRAS nucleotídeos encontradas em cancros humanos (85% de todas as mudanças em NSCLC), enquanto os nove mutações mais comuns são responsáveis ​​por 95% de todas as mudanças e 97,5% das mutações do NSCLC. sondas de PCR digitais marcado com fluoróforo complementar uma sequência de DNA mutante particular e tão somente detectar um específico

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mutação. Usando estes ensaios em duplex com uma sonda para detectar o alelo mutante e uma sonda para detectar o alelo de tipo selvagem permitem o cálculo fracção alelo mutante para uma dada mutação, mas esta abordagem exige potencialmente múltiplos ensaios e a utilização de mais material antes da identificação correcta de o genótipo. Desenvolvimento de um ensaio multiplex combinando várias sondas de mutantes diferentes na mesma reacção é, por conseguinte, uma alternativa atraente. Multiplex

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PCR digitais foram descritas usando o sistema de Raindrop ™ Digital PCR (Raindance Technologies, Billerica, Massachusetts, EUA) em câncer colorretal avançado [11], mas não ainda com o sistema Bio-Rad QX100, um sistema acessível digital de PCR com sondas disponíveis comercialmente por vários

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mutações, nem tem uma ferramenta multiplex sido usada em câncer de pulmão.

Nós começamos a projetar multiplex ensaios digital de PCR que identificam com precisão nove

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mutações diferentes e demonstrar a aplicação destes ensaios ao material derivado do paciente utilizando o sistema Bio-Rad QX100.

materiais e Métodos

digital PCR ensaios com sondas

Cada sonda de PCR digital é um oligonucleótido específico para a região de interesse com um 5 ‘e um fluoróforo 3’ quencher. O fluoróforo é ou HEX para sondas específicas para sequências de tipo selvagem ou FAM para sondas mutantes.

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c.35G T (G12V;. Cat não dHsaCP2500592), c.35G A (G12D;. Cat não dHsaCP2500596), c.35G C (G12a;. Cat não dHsaCP2500586), c .34G A (G12S;. cat não dHsaCP2500588), c.34G C (G12R;. cat não dHsaCP2500590), c.34G T (G12C; dHsaCP2500584), c.37G T (G13C;. cat não dHsaCP2500595 ), c.38G a (G13D;. cat não dHsaCP2500598), c.183A C (Q61H;. cat não dHsaCP2000133), WT para c.35G T (WT para G12V;. cat não dHsaCP2500593), WT para c.35G a (WT para G12D;. cat não dHsaCP2000002), WT para c.35G C (WT para G12a;. cat não dHsaCP2000004), WT para c.34G a (WT para G12S;. cat não dHsaCP2000012 ), WT para c.34G C (WT para G12R;. cat não dHsaCP2000010), WT para c.34G T (WT para G12C;. cat não dHsaCP2000008), WT para c.37G T (WT para G13C; gato não dHsaCP2500595), WT para c.38G . a (WT para G13D;. cat não dHsaCP2000014) e WT para c.183A C (WT para Q61H;. cat não dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutation Ensaios (contendo ambos os iniciadores e sondas ddPCR) foram adquiridos de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA) e utilizado no presente estudo.

optimização Ensaio e quantificação de ADN

os ensaios de PCR digital foram otimizados usando DNA genômico linha de células (gDNA) ou oligonucleotídeos sintéticos como apropriado. linhas celulares utilizadas para este estudo foram autenticadas usando STR profiling pela instalação de serviços celulares na Research UK Cancer Research Institute de Londres e do Instituto de Pesquisa do Câncer. Estes incluíram NCI-H727 (

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G12V, pulmão), NCI-H358 (

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G12C, pulmão), A549 (

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G12S, pulmão), SK- LU-1 (

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G12D, pulmão), A427 (

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G12D, pulmão), HCT-116 (

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G13D, cólon) e NCI-H1975 (

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WT, pulmão). Todas as linhas celulares foram fornecidos diretamente pelo Cancer Research UK celular Serviços com excepção do HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA; cat no ATCC

®CCL-247

TM.). ADNg celular foi extraído utilizando o Kit de sangue e tecido DNeasy ™ (Qiagen, Venlo, Limburg, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante. Todo o ADN utilizado nas reacções subsequentes de PCR digitais, excepto os oligonucleótidos sintéticos, foi quantificado num sistema QX100 ddPCR humano usando ARNase P TaqMan ® Copiar Número ensaio de referência (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA). 1 mL de eluído foi adicionado a uma reacção de PCR digital contendo 10 uL ddPCR Supermix para sondas (Bio-Rad) e 1 uL de TaqMan Copiar Número ensaio de referência, humana, ribonuclease P (Life Technologies) num volume total de 20 uL. A reacção foi particionada em ~ 14.000 gotículas por exemplo num gerador de gotícula QX-100 de acordo com as instruções do fabricante. reacções emulsionada PCR foram passados ​​por uma placa de 96 poços (Eppendorf, Stevenage, UK) num L-tempestade GS4 termociclador (L-tempestade, Somerton, Reino Unido) a incubação das placas a 95 ° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 60 seg, seguido de 10 min de incubação a 98 ° C. O incremento da rampa de temperatura foi de 2,5 ° C /seg para todos os passos. As placas foram lidas num leitor de gotícula Bio-Rad QX-100 usando o software v1.4.0.99 QuantaSoft (Bio-Rad). Pelo menos uma poços de controlo negativo sem ADN foram incluídos em cada corrida. A quantidade de RNase P ADN amplificável foi quantificada a partir da concentração fornecida pelo software. Após quantificação, ADN da linha celular foi digerido utilizando a enzima de restrição 3 ™ HF-Hind (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA) a 37 ° C durante 1 hora.

Gota digital de PCR para a detecção de mutações KRAS

misturas reaccionais de PCR foram preparadas num volume total de 20 uL contendo: 10 ul 2x Supermix para sondas sem dUTP (Bio-Rad), ensaios com sondas de iniciador relevantes, o DNA (volume variável) e água livre de nuclease (Life Technologies corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA). Vários poços foram usadas se necessário para analisar o eluído ADN necessário. Pelo menos 500 pg de ADN equivalente de eluato foi analisado em cada ensaio multiplex para cada paciente. 20 ul de mistura reaccional de PCR foi transferida para um poço de amostra de um gerador de gotícula cassete descartável (Bio-Rad). 70 uL de óleo gota geração (Bio-Rad) foi então carregado para o poço de petróleo para cada canal e da caixa, carregada dentro de uma gota Gerador QX100 (Bio-Rad). As gotículas foram então transferidos para uma placa de PCR de 96 poços. reacções emulsionada PCR foram passados ​​por um G-tempestade GS4 termociclador incubação das placas a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 seg e 54 ° C durante 60 seg, seguido de 10 min de incubação a 98 ° C. O incremento da rampa de temperatura foi de 2,5 ° C /seg para todos os passos. As placas foram lidas num leitor de gotícula Bio-Rad QX-100 usando o software v1.4.0.99 QuantaSoft de Bio-Rad. Pelo menos um poço de controlo negativo sem ADN foi incluído em cada corrida. Cada poço foi então lidos usando o QX100 Gota Reader (Bio-Rad) e gotículas analisadas para emissão nos HEX ou FAM comprimentos de onda. Duas dimensões parcelas de amplitude exibindo medida HEX e FAM amplitude para cada gota mostram quatro principais populações de gotículas; gotículas que não contêm ADN amplificado, gotículas com apenas ADN mutante e alta amplitude FAM, gotículas com apenas ADN de tipo selvagem e de grande amplitude e do HEX gotículas com tanto de tipo selvagem e ADN amplificado mutante e alta FAM e HEX amplitude. Se várias cópias de tipo selvagem e o ADN mutante estão contidos na mesma gota, as gotas com maior FAM e HEX amplitude será lido. Estas gotículas foram excluídos de quaisquer análises ao longo deste estudo.

Digital PCR análise

Para avaliar a fracção alelo mutante, a concentração de ADN mutante (cópias de ADN mutante por gota) foi estimada a partir de a distribuição de Poisson. Número de cópias mutantes por gotícula mmu = -ln (1- (NMU /n)), onde NMU = número de gotas positivas para a sonda FAM mutante e n = número total de gotículas. A concentração de ADN na reacção foi estimado como se segue: = MDNAconc -ln (1- (nDNAcon /n)), onde nDNAconc = número de gotas positivas para a sonda mutante FAM e /ou HEX sonda de tipo selvagem e n = número total de gotículas. A fracção alelo mutante = mmu /MDNAconc. A freqüência do alelo mutante medida descreve a fração alelo mutante, expressa em percentagem.

Acesso DNA de tecidos FFPE e extração

formalina parafina fixado amostras incorporado (FFPE) de tumores de NSCLC excedente pacientes aos cuidados clínicos foram coletadas com o consentimento por escrito do paciente no The Royal Marsden NHS Foundation Trust. ADN tecido FFPE foi extraída (após macrodissection se necessário para assegurar 10% de conteúdo de tumor) usando o Kit Qiagen Tissue ADN FFPE (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA eluído foi armazenado a -20 ° C.

declaração Ética

Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito para este estudo (aprovação ética 13 /LO /1389, o Comité NRES Londres-Central), que incorporou DNA somática excedente do Programa estratificada Medicina Cancer Research UK (aprovação ética 11 /EE /0202, o Comitê NRES Leste de Inglaterra).

seqüenciamento Sanger

a região de interesse foi amplificado utilizando 10 | iM para a frente (5′-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 ‘) e reverso (5’-3-TTGGATCATATTCGTCCACAA ») primários, 10 uL AmpliTaq Gold® PCR master Mix (Life Technologies) e 3 ng de DNA derivado de FFPE molde ou 5 ng ADNg. As condições de PCR foram de acordo com as recomendações do fabricante. produto de PCR purificado foi então submetido a um passo de PCR utilizando didesoxinucle�idos cadeia de terminação (BigDye® 1.0, Life Technologies) e sequência de DNA posterior foi lido em um sequenciador automático.

Ion torrente de protões sequenciamento

Sequencing bibliotecas foram preparadas com o ião AmpliSeq cancro ™ ponto quente Painel V2 (Life Technologies) utilizando o protocolo de iões AmpliSeq Preparação da biblioteca de ADN com 3-5ng, de acordo com as instruções do fabricante. Após o código de barras, as bibliotecas foram quantificados usando qPCR e diluiu-se para 100 pM. As bibliotecas foram modeladas com o sistema de iões OneTouch2 (Life Technologies) e sequenciadas num chip PI utilizando o Ion PI OT2 200 Kit (Life Technologies), 520 fluxos e um comprimento médio de 112 bases de amplicão até uma profundidade média de x2721307. A sequenciação resultou em 45272-11767856 leituras por amostra.

Ion torrente chamador Variant v4.0-r73742 com nenhuma região Hotspot e configuração “Germ Linha de baixo rigor” foi usado para chamar variantes. Ler as contagens para todas as posições foram computados utilizando engavetamento (SAMtools v1.1 [12]) e esses dados foi analisado para possíveis variantes usando costume Perl e scripts R. Variantes em 3% relatado por ambos os métodos de análise e não relatou em 1000 banco de dados de Genomas Projeto (www.1000genomes.org) foram identificados como possíveis mutações somáticas. Os dados foram cruzados contra o v70 banco de dados Cósmico (cancer.sanger.ac.uk) para identificar possíveis mutações de ponto de acesso.

A análise estatística

A regressão linear foi realizada utilizando a fórmula r

2 = 1- (SS

reg /SS

tot), onde SS

reg refere-se à soma dos quadrados dos distâncias para melhor ajuste linha de regressão linear e SS

tot refere-se à soma de as praças de distâncias verticais a partir da hipótese nula (y = média de todos os valores de y) utilizando GraphPad Prism versão 6.0a (GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA).

KRAS multiplex especificidade do ensaio

92 poços de

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do tipo selvagem gDNA foram analisados ​​a cada multiplex. O limite de detecção foi de 0,05% para refletir nossos resultados medidos com cravado

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espécies gDNA mutantes (S8 FIG). gotículas individuais foram agrupados de acordo com sua amplitude HEX em dois grupos usando o algoritmo kmeans. Um limiar para mutantes foi estimada com base em 1,5 vezes a mediana dos valores FAM dessas gotas que pertencem ao cluster com HEX categorias mais elevadas. Os falsos positivos gotículas ‘mutante’ foram classificados como gotículas que havia no aglomerado HEX inferior, mas cujo valor superior ao limiar FAM para reflectir as amplitudes FAM e HEX medidos por qualquer das espécies mutantes KRAS testados no referido ensaio multiplex. Um resultado falso positivo foi definido como três gotas de falsos positivos ‘mutantes’ de acordo com a detecção de Melhores Práticas Diretrizes raros mutação [13]. Para avaliar a especificidade, calculamos a probabilidade binomial de atingir menos de três gotas ‘mutantes’ por 6000 gotículas de tipo selvagem para cada ensaio multiplex.

Resultados

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mutação duplex ddPCR

Nós testamos todos os

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ensaios ddPCR separadamente através de um gradiente de temperatura de recozimento para otimizar as condições de ciclos térmicos. Cada ensaio foi testado com o ADNg ou oligonucleótido apropriado sozinho e, em seguida, em duplex com o tipo selvagem e

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ADN mutante e ambos FAM e HEX sondas relevantes presentes. Diminuindo o recozimento temperatura aumentada amplitude FAM da sonda mutante para um patamar a 54 ° C para a

KRAS

G12V, D, A, S, R e C e G13C e 13D sondas (Fig 1). O

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sonda Q61H teve um aumento mínimo em amplitude FAM a 53,4 ° C, em comparação a 54 ° C. Todas as sondas testadas mostraram uma boa separação dos quatro grupos diferentes de gotas a 54 ° C, o que permite a identificação inequívoca e quantificação de populações de ADN diferentes.

populações de gotículas observados para cada ensaio duplex testado com o tipo selvagem e a linha celular mutante relevante ADNg ou oligonucleótido óptimo no recozimento por exemplo, temperatura G12V painel superior esquerdo mostra populações de gotículas observados com WT para o ensaio G12V, ensaio G12V, NCI-H727 gDNA e NCI-H1975 gDNA presente. HEX amplitude é de até 6000 no eixo X e FAM amplitude até 11000 no eixo dos Y de cada painel. Key:. Preto drops- gotículas vazios, febre catarral gotículas positivos DNA FAM mutantes, do tipo selvagem gotículas positivos DNA HEX estufa,-wild-type marrom e DNA mutante gotículas dupla positivos

KRAS

multiplex ddPCR projeto ensaio

Nós projetamos uma ferramenta multiplex com base em PCR digital para rastrear a mais comum

KRAS

mutações no adenocarcinoma de pulmão; G12C, G12D e G12V (https://www.sanger.co.uk/cosmic). De tipo selvagem ensaios com sondas para cada mutação foram testados em combinação com concentrações variáveis ​​de ensaios com sondas de mutantes, dando origem a populações de gotículas de diferentes mutantes FAM amplitude (Fig 2). A amplitude HEX de todos os ensaios com sondas de tipo selvagem foi encontrado para ser muito semelhantes e por isso o WT para G12C, WT para G12V e WT para ensaios G12D foram selecionados como referência para todos os

KRAS

G12 e G13 ensaios mutantes subsequentes . Das diferentes combinações de ensaios mutantes ensaiados, o ensaio multiplex que deu melhor separação das populações de gotículas usado 900 primers nm e 500 sonda G12C nM, 562,5 primers nm e 312,5 sonda G12D nm e 225 primers nm e 125 sonda G12V nm (Fig 2 , painel superior esquerdo).

KRAS

populações de gotículas mutantes G12C são indicados por um tracejado a vermelho quadrado,

KRAS

G12D populações mutantes por um tracejada azul quadrado e

KRAS

G12V populações mutantes por um amarelo frustradas quadrado. Cada ensaio multiplex, combinando todos os ensaios FAM e HEX relevantes,

KRAS

WT gDNA e G12V, D e C mutante gDNA, é mostrado no painel superior. O ensaio dúplex correspondente para cada mutação, utilizando a mesma concentração do FAM e do HEX ensaio com

KRAS

ADN WT e o apropriado

KRAS

ADN presente mutante, é mostrado abaixo nos painéis de cada ensaio multiplex. Multiplex 1 (painel superior esquerdo) é uma combinação de ensaio de 900 primers nm e 500 sonda G12C nM, 562,5 primers nm e 312,5 sonda G12D nm e 225 primers nm e 125 sonda G12V nm com 450 primers nm e 250 nm WT para a sonda G12C. Multiplex 2 usa a mesma concentração de G12V e WT para o ensaio G12C como Multiplex 1, mas também contém 450 primers nm e 250 sonda G12C nm e 675 nm e primers 375 sonda G12D nM. Multiplex 3 usa a mesma concentração de

KRAS

ensaios mutantes como no multiplex 2, mas com a WT para G12V ensaio sonda presente, usados ​​na mesma concentração que a WT para o ensaio G12C no Multiplex 1. Multiplex 4 é um ensaio combinação do ensaio G12C como no Multiplex 2 com 225 primers nm e 125 sonda G12D nm e 675 nm e primers 375 sonda G12V nm com o WT para o ensaio G12D na mesma concentração que a WT para o ensaio G12C no Multiplex 1. chave: black – gotículas vazias, gotas positivos FAM DNA mutante azuladas, com efeito de estufa do tipo selvagem gotículas positivos DNA HEX,-wild-type marrom e DNA mutante gotículas dupla positivos. A mesma escala é utilizada para todos os painéis (HEX amplitude até 7000 e FAM amplitude até 22000).

A capacidade para testar múltiplos

KRAS

mutações ajudaria a detectar sub populações -clonal aplicando a abordagem multiplex de amostras clínicas em que o material de partida é escassa. Para modelar isso, nós empregamos-line de células derivadas gDNA para as três mutações e testei com cada sonda em duplex para garantir a especificidade (S1 Fig). Na presença da sonda mutante G12D e

KRAS

G12D, V e C do ADN mutante, uma segunda população de gotículas mutante foi identificado no menor amplitude FAM para a população de ADN mutante G12D (caixa de eclodidos vermelho, painel superior esquerdo ). Esta população não foi observada quando cada espécie de DNA mutante foi testado em duplex com a sonda G12D (segundo painel da esquerda). Uma segunda população mutante semelhante foi observado com a sonda mutante G12V e todas as três espécies de ADN mutante, em comparação com cada mutante de ADN em duplex (painéis inferiores esquerdo). Esta segunda população, em particular, como visto com a sonda mutante G12D, pode cair na amplitude FAM esperado de um

KRAS

mutação diferente no ensaio multiplex e levar a detecção de mutações falso positivo. Para explorar ainda mais essa, o DNA de tecidos FFPE de um indivíduo conhecido por ter um

KRAS

12/13 mutação (F124), como verificado por Cobas® testes (Cobas®

KRAS

Ensaio de mutação, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey, EUA) foi analisada (Fig S1, painéis direitos). O ensaio multiplex identificada uma população de gotículas mutante com FAM amplitude que foi interpretado como um G12D ou mutação G12V. Quando a amostra foi testada em cada ensaio duplex individualmente, não se observou qualquer população mutante em qualquer G12V ou G12C, enquanto uma população com uma amplitude FAM menor do que o esperado com o G12D foi observada ensaio mutante. Por sequenciação subsequente e maior desenvolvimento da análise de PCR digital do DNA de tecidos, esta amostra foi posteriormente identificado como

KRAS mutante

G12a (Tabela 3).

A reactividade cruzada de

KRAS

ensaios de sonda em combinação

Devido às semelhanças entre as sequências de ADN dos vários

KRAS

mutações, significativa reatividade cruzada foi observada entre sondas concebidas para mutações dentro do mesma região. Isto foi particularmente evidente com sondas concebidas para substituições ao mesmo nucleotídeo ou seja,

KRAS

G12V, D e A e

KRAS

G12S, R e C. A reatividade cruzada do ensaio sonda com ‘ ‘DNA incompatíveis carregando um resultados diferentes

KRAS

mutação (S2 e S3 figos) em uma população de gotículas de diferentes FAM e Vic amplitudes relativamente próximas à população gota vazio e outra população perto da população verdadeira gota de tipo selvagem . A posição destas populações de gotículas adicionais dita a concepção de ensaios multiplex para reduzir o potencial má interpretação da

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genótipos. Portanto, três ensaios multiplex foram concebidas para combinar cada uma sonda para uma mutação na posição de nucleótidos 35, uma sonda para uma mutação na posição 34 e uma sonda para uma mutação em qualquer uma das posições 37, 38 ou 183.

KRAS

multiplex ddPCR otimização ensaio

multiplex a é uma combinação de ensaios FAM para

KRAS

G13C, G12C e G12V. Várias combinações de diferentes concentrações de sonda mutantes foram testados e o uso de uma sonda de tipo selvagem e para G12C G13C em concentrações variadas (S4 FIG). Houve sobreposição significativa entre a amplitude HEX das populações de gotículas de tipo selvagem e devido à proximidade das bases de nucleotídeos relevantes e a duração estimada da sonda, sentiu-se que 450 primers nm e 250 nm G12C, V ou D wild- tipo de sonda foi adequado para quantificação de ambos G12 e G13 de tipo selvagem populações. O ensaio ideal multiplex (S4 Fig, painel superior esquerdo) compreendeu 900 primers nm e 500 sonda mutante nM G13C, 450 primers nm e 250 sonda G12C nm e 225 nm e primers 125 sonda G12V nM. Multiplex B é uma combinação de ensaios FAM para

KRAS

G12S, G12D e G13D. De todas as concentrações testadas, a combinação ideal de ensaios com sondas mutantes foi 675 primers nm e 375 sonda G12S nM, 450 primers nm e 250 sonda G12D nm e 225 nm e primers 125 sonda nM G13D (S5 Fig, painel superior esquerdo). analisa Multiplex C

KRAS

mutações em G12R, G12a e Q61H. Ela exige uma sonda do tipo selvagem tanto para a posição G12 /13 e da posição Q61 para a quantificação precisa da freqüência do alelo mutante. O ensaio foi otimizado com 450 primers nm e 250 sonda G12C nm e 900 nm e primers 500 sonda Q61H nm como os ensaios de tipo selvagem. A melhor separação das populações de gotículas mutantes foi realizada com 675 primers nm e 375 sonda G12R nM, 450 primers nm e 250 sonda G12a nm e 900 nm e primers 500 nM Q61H sonda mutante (S6 Fig, painel superior esquerdo).

Todos os ensaios multiplex otimizados (Fig 3) foram testados para reatividade cruzada com várias espécies de

KRAS

DNA mutante (S7 Fig). Não há sobreposição entre as populações de gotículas desejadas e as populações para o outro

KRAS

espécies de DNA mutantes em todos os três multiplexes. Além disso, o posicionamento das populações de gotículas devido a reactividade cruzada é altamente reprodutível e pode ser utilizado para iniciar a identificar quais

KRAS

genótipo está presente num ensaio multiplex contendo outras sondas mutantes.

multiplex A (painel superior esquerdo) é uma combinação de ensaio de 900 primers nm e 500 sonda G13C nm (tracejada vermelha quadrada), 450 primers nm e 250 sonda G12C nm (tracejada azul quadrado) e 225 primers nm e 125 sonda G12V nM (amarelo quadrado tracejada). Multiplex B (painel superior central) é uma combinação de ensaio de 675 primers nm e 375 sonda G12S nm (tracejada vermelha quadrada), 450 primers nm e 250 sonda G12D nm (tracejada azul quadrado) e 225 primers nm e 125 sonda G13D nM (amarelo quadrado tracejada). Multiplex C (painel superior direito) é uma combinação de ensaio de 675 primers nm e 375 sonda G12R nm (tracejada vermelha quadrada), 450 primers nm e 250 sonda G12a nm (tracejada azul quadrado) e 900 primers nm e 500 sonda Q61H nM (amarelo quadrado tracejada). Multiplex C tem 900 iniciadores nm e 500 nM Q61H do tipo selvagem sonda para além de um ensaio de tipo selvagem G12C. Todas as outras populações de gotículas de tipo selvagem exibido, exceto no ensaio Q61H duplex, são 450 primers nm e 250 nm G12C do tipo selvagem sonda. Todos os painéis nas colunas esquerda e do centro mostram uma amplitude FAM-se a 18000 e uma amplitude HEX até 6000. Painéis na coluna da direita tem uma amplitude FAM-se a 18000 e uma HEX amplitude até 11000.

KRAS

multiplex ddPCR ensaio de caracterização

quantidades decrescentes de NCI-H358 (

KRAS

G12C) e A549 (

KRAS

G12S) gDNA foram incrementadas em

KRAS

do tipo selvagem gDNA (NCI-H1975) e testado no apropriado

KRAS

ensaio multiplex. O limite de detecção para

KRAS

G12C DNA mutante em multiplex A foi de 0,03% e para

KRAS

DNA G12S no multiplex B foi de 0,045% (S8 Fig, painéis superiores) a freqüência do alelo mutante medida bem correlacionada com quantidades decrescentes de cravado

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ADNg mutante em multiplex a e B (R2 = 0,9992 e 0,0998, respectivamente), demonstrando a linearidade da detecção de mutações nos ensaios multiplex. freqüência do alelo mutante mostrou pouca variabilidade intra-bem para qualquer um ensaio multiplex e alta reprodutibilidade entre dois operadores diferentes em três dias alternados durante uma gama de frequências de alelos (S8 Fig, meio e painéis inferiores).

Similar

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freqüência do alelo foi observado usando ensaios multiplex ou duplex, tanto linha de células de DNA (uma única espécie

KRAS

gDNA mutante e combinações de

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gDNA mutante em diferentes freqüências alélicas) ou oligonucleotídeos e DNA de tecidos FFPE (Fig 4; r2 = 0,9302, respectivamente, e 0,9542)

Foram analisados ​​vários poços de NCI-H1975

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do tipo selvagem gDNA com cada um dos três

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ensaios multiplex e calculada a probabilidade de detecção da mutação falso positivo, definindo o limite de detecção de 0,05% para refletir nossos resultados medidos com cravado

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espécies gDNA mutantes (S8 FIG). A especificidade de cada multiplex é 99,99995%, 99,99857% e 99,85578% para multiplexes A, B e C, respectivamente (S1 Tabela).

Comparação de

KRAS

ensaio de detecção mutante multiplex com seqüenciamento Sanger

Uma série de amostras contendo quantidades decrescentes de NCI-H358 (

KRAS

G12C) ou A549 (

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G12S) gDNA cravado em

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wild- tipo de ADN de (NCI-H1975) foram analisadas simultaneamente utilizando PCR e sequenciação digital de Sanger.

KRAS mutante

G12C DNA foi detectável utilizando multiplex Um para baixo a uma frequência de alelo mutante de 0,2%, enquanto que o pico mutante no cromatograma é visível apenas em uma freqüência do alelo mutante de 31,5% e não inferior a 10% (S9 Fig, painéis superiores).

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DNA mutante G12S permanece detectável por PCR digital utilizando multiplex B com uma frequência de alelos mutantes de 0,1%, mas só é visível utilizando sequenciamento Sanger em 17%. (S9 Fig, painéis inferiores).

Detecção de

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mutações no DNA de tecidos FFPE

DNA de tecidos FFPE extraído de 11 casos de avançada

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mutante NSCLC (S2 Tabela) foi analisada utilizando cada ensaio multiplex. A presença de um

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mutação 12/13 foi conhecida a partir de testes Cobas® anterior (Cobas®

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Teste de Mutação, Roche), mas os investigadores foram cegados para o específico

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genótipo. Pelo menos um

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mutação foi detectada em cada caso e dois casos tinham duas detectável

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clones (Fig 5). As mutações foram confirmadas com o ensaio apropriado duplex. A mutação baixo G12D frequência em caso S011 pode representar FFPE artefacto devido à desaminação frequente de nucleotídeos guanina durante o processo de preservação do material [14]. A mutação G12F em S018 foi identificado por sequenciação subsequente da amostra de tecido após a observação da população de gotículas reactividade cruzada em todos os ensaios multiplex. Além disso, duas espécies de KRAS mutante gDNA foram misturadas em um fundo de

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do tipo selvagem DNA (NCI-H1975) gDNA para criar três amostras contendo um clone KRAS maior e menor; C1 é uma combinação de NCI-H358 (

KRAS

G12C) e A549 (

KRAS

G12S) gDNA, C2 é uma combinação de NCI-H358 (

KRAS

G12C) e A427 (

KRAS

G12D) gDNA e C3 é uma combinação de A427 (

KRAS

G12D) e A549 (

KRAS

G12S) gDNA.