células

Abstract

Fundo

Tumor

in vivo

encontrar diversos tipos de microambientes, tanto em o local do tumor primário e de metástases em locais distantes. Entender como as várias propriedades mecânicas destes microambientes afetar a biologia das células tumorais durante a progressão da doença é fundamental na identificação de alvos moleculares para terapia de câncer.

Metodologia /Principais Achados

Este estudo usa géis de poliacrilamida flexíveis como substratos para o crescimento de células em conjunto com uma nova abordagem proteómica para identificar as propriedades de linhas celulares de cancro dependentes de rigidez que contribuem para o seu crescimento diferencial em substratos macios e rígidas. Em comparação com células que crescem em substratos mais rígidos /rígidas ( 10.000 Pa), células em substratos macios (150-300 Pa) exibiu um ciclo celular mais, devido principalmente a um prolongamento da fase G1 do ciclo celular, e foram metabolicamente menos activo, que mostra a diminuição dos níveis de ATP intracelular e uma redução marcada na síntese de proteínas. Usando rotulagem isótopo estável de aminoácidos em cultura (SILAC) e espectrometria de massa, foram medidas as taxas de síntese de proteína de mais de 1200 proteínas celulares sob condições de crescimento em substratos macios e duros rígidos /. Foram identificadas proteínas celulares cujas sínteses foram preferencialmente inibidas ou seja preservada em matrizes moles. A primeira categoria incluídas proteínas que regulam as estruturas do citoesqueleto (por exemplo, tubulinas) e glicólise (por exemplo, fosfofrutoquinase-1), enquanto que a última categoria incluídas proteínas que regulam vias metabólicas principais necessários para a sobrevivência, por exemplo, visfatina, um regulador do salvamento NAD pathway.

Conclusões /Significado

as propriedades celulares de células cancerosas dependentes de rigidez que crescem em matrizes moles são uma reminiscência das propriedades das células cancerosas dormentes, por exemplo, a taxa de crescimento lento e metabolismo reduzido. Nós sugerimos que o uso de géis relativamente macios como substratos de cultura de células permitiria vias moleculares a ser estudado sob condições que refletem os diferentes ambientes mecânicas encontradas por células cancerosas em cima metástases para locais distantes

Citation:. Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman NE, Grigera PR, Jeffery ED, et al. (2012) Matriz de Rigidez Cancer regula o crescimento celular através da modulação metabolismo celular e da síntese da proteína. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10.1371 /journal.pone.0037231

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 14 de fevereiro de 2012; Aceito: 16 de abril de 2012; Publicado em: 18 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Tilghman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações Institutos Nacionais de Saúde (NIH) -National Cancer Institute (NCI) CA40042 (JTP) e NIH 1U54 GM64346 (JTP e JWF) (www.nih.gov) e financiamento do Coulter Prêmio parceiros Translational Foundation (www. whcf.org) (JTP). EMB foi apoiado pelo NIH-NCI T32 CA09109. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Sensing as propriedades mecânicas da matriz extracelular (ECM) é um mecanismo central para a regulação da proliferação e diferenciação de uma variedade de tipos de células, tanto in

in vitro

e

in vivo

. Muitas evidências implica alterações nas vias de sinalização que regulam a resposta de células micro-ambientais para pistas como acontecimentos críticos na iniciação do tumor, progressão, metástase tumoral e talvez dormência [1], [2]. Além disso, o aumento da rigidez do tecido, devido à acumulação local de uma matriz de colagénio densas, reticulado é uma característica da progressão do cancro nos tecidos moles e é a base para a detecção de diversos tipos de tumores por palpação física [3], [4].

Análise de linhas celulares de cancro humano em cultura de células é quase sempre realizada utilizando células de cultura em plástico rígido, ou, menos frequentemente, em Matrigel ou de agar mole, as propriedades mecânicas do que são mal definidos e /ou de difícil modular. Temos anteriormente descrito um método de alto rendimento simples para a cultura de células tumorais sobre substratos flexíveis biologicamente relevantes usando ECM conjugado de poliacrilamida (PA) géis que pode abranger uma gama rigidez abrangendo módulos de elasticidade de 100 pascais ([Pa] ou N /m2) -150.000 Pa [5]. Neste ensaio que utilize um sistema de ensaio de 96 poços que as matrizes de geles PA variando rigidez em incrementos definidos pelo utilizador ao longo da placa [6]. Nós temos utilizado neste ensaio para avaliar o modo como as alterações na rigidez do ECM modular as propriedades biológicas de células tumorais, incluindo o crescimento, morfologia e propriedades migratórias. As linhas celulares de cancro testadas foram agrupados em duas categorias baseadas em seus perfis de proliferação: linhas “rigidez dependentes” apresentaram aumento do crescimento celular como rigidez extracelular aumentou, enquanto “rigidez independente” linhas cresceram igualmente bem em todo o espectro testado de rigidez matriz. Importante, as células que cresceram pouco em géis macios exibiu diminuição da difusão e migração sob estas condições e cresceu fracamente quando introduzidos no ambiente do tecido mole do pulmão. A linha de carcinoma do pulmão A549 dependente da rigidez respondeu a cultura em géis macios expressando o marcador epitelial diferenciado E-caderina e diminuindo a expressão do factor de transcrição Slug mesenquimais. Do mesmo modo, a rigidez também foi encontrada para modular a transição epitelial-mesenquimal-a em células epiteliais normais [7]. Estas observações demonstram que as propriedades mecânicas do ambiente da matriz desempenham um papel significativo na regulação da proliferação e as propriedades morfológicas de células cancerosas, e que o “perfil de rigidez” é uma propriedade intrínseca de cada linha celular de cancro.

muitas linhas celulares de cancro responder aos microambientes menos rígidas pela proliferação mais lentamente; No entanto, alterações no metabolismo celular devido a alterações na rigidez do microambiente ainda não foram bem caracterizados. alterações celulares em processos metabólicos como a síntese de proteínas pode ser especialmente relevante como células tumorais entrar em um estado “adormecido”, principalmente em locais de metástases distantes onde as células foram introduzidas para um microambiente estrangeira [8], [9]. Neste estudo, investigou as propriedades de linhas celulares de cancro dependentes de rigidez que contribuem para o seu crescimento diferencial em substratos de poliacrilamida moles e rígidas. Em comparação com células que crescem em substratos mais rígidos /rígidas, as células em substratos macios (150-300 Pa) exibiu um ciclo celular mais, devido principalmente a um prolongamento da fase G1 do ciclo celular, e foram metabolicamente menos activo, que mostra a diminuição dos níveis de ATP intracelular e uma redução marcada na síntese de proteínas. Para identificar as proteínas que apresentam as taxas de síntese diferenciais quando as células são cultivadas em moles em relação géis firmes, utilizou-se uma aplicação recentemente desenvolvida de rotulagem isótopos estáveis ​​de ácidos aminados em cultura (SILAC) e espectrometria de massa para medir as taxas de síntese de proteína de mais 1200 proteínas celulares em condições de crescimento em substratos macios e duros rígidos /[10]. Considerando que as taxas globais de síntese de proteínas diminuir acentuadamente em células dependentes de rigidez cultivadas em substratos moles, foram identificadas proteínas celulares cujas sínteses foram preferencialmente inibidas por cultura em substratos moles e proteínas cuja sínteses foram relativamente preservados quando crescendo em matrizes macios. A primeira categoria incluídas proteínas que regulam as estruturas do citoesqueleto (por exemplo, subunidades de tubulina) e glicólise (por exemplo, fosfofrutoquinase P-1 e ATP sintase), ao passo que a última categoria incluídas proteínas que regulam vias metabólicas essenciais necessários para contrariar a danos por espécies reactivas de oxigénio, tais como os membros da família da redutase de aldo-ceto e visfatina, um regulador da via de salvamento NAD. As propriedades celulares de células cancerosas dependentes de rigidez que crescem em matrizes moles são uma reminiscência das propriedades de células dormentes de câncer, ou seja, a taxa de crescimento lento e metabolismo reduzido. Estes dados apoiam a ideia de que a rigidez do microambiente pode modular a proliferação de células de tumor por modulação de processos celulares fundamentais. Além disso, a tecnologia de placa macia pode proporcionar uma plataforma única para o estudo de células de cancro submetidos a regulação dinâmica da proliferação em resposta a alterações no ambiente mecânica, fornecendo assim insights sobre como as alterações do microambiente modular o crescimento de células de câncer em modelos animais experimentais e em pacientes.

resultados

progressão do ciclo celular de células dependentes de rigidez em gel macio

Temos demonstrado que um painel de linhas celulares de cancro podem ser agrupadas com base na capacidade de proliferação em moles ( 1000 Pa) géis revestidas com colagénio. As células A549 (carcinoma do pulmão) e células MDA-MB-231 (carcinoma da mama) são classificados como tempos de exposição de duplicação “rigidez-dependente” e que são pelo menos duas vezes mais em moles em relação as matrizes rígidas. Em contraste, as células mPanc96 “independente de rigidez” (carcinoma pancreático) crescem igualmente bem em moles em comparação com as matrizes rígidas e têm tempos de duplicação semelhantes sob estas condições ([5], observações não publicadas).

Para compreender o base molecular para o crescimento lento das linhas celulares de cancro dependentes de rigidez em matrizes moles, medimos os reguladores-chave da progressão do ciclo celular, bem como o tempo necessário para que as células transversal do ciclo celular em substratos flexíveis ou rígidos. A ciclina D1 é crítica para que as células entram no ciclo celular, e a perda de expressão da ciclina D1 é um marcador para as células que tenham saído do ciclo celular e são quiescentes [11]. Além disso, a expressão da ciclina D1 foi mostrado para ser regulado pela rigidez da matriz através da activação dependente de FAK de Rac em células não transformadas [12]. A expressão de ciclina D1 em células de cancro dependente de rigidez foi medida para determinar se as células de sair do ciclo celular quando cultivadas em géis macios. células rigidez dependente A549 ou MDA-MB-231 foram cultivadas em 150 Pa, 4800 Pa, ou 19200 géis Pa para 2 ou 5 dias, e expressão da ciclina D1 foi medida por western blot. Ambas as linhas celulares expressaram ainda ciclina D1, mesmo quando cultivadas nas (150 Pa) géis macios (Figura 1). Estes dados indicam que as células dependentes de rigidez não sair do ciclo celular, mesmo em géis macios em que as células apresentam um crescimento mais lento.

células A549 e células MDA-MB-231 foram cultivadas em 150 Pa, 4800 Pa, ou 19200 géis de poliacrilamida Pa para 2 ou 5 dias. As células foram lisadas e analisadas por western blot para a expressão de ciclina D1 (painel superior). A expressão de GAPDH foi analisada como um controlo de carga (painel inferior). A mancha é representativa de três experiências.

Uma vez que as células A549 dependente da rigidez não sair do ciclo celular, quando plaqueadas em géis macios, e somente ~ 5% das células sofrem apoptose nestas condições [5 ], a hipótese de que estas células estão a avançar através do ciclo celular mais lentamente do que quando estão a crescer em substratos rígidos. Para examinar a taxa de progressão através de etapas específicas do ciclo celular, a A549 de linha de carcinoma do pulmão dependente de rigidez foi cultivada em (19200 Pa) geles moles (150 Pa) ou rígidas durante dois ou cinco dias e em seguida pulsadas durante 30 minutos com o nucleótido análogo bromodesoxiuridina (BrdU) para marcar a população de células que sofrem a síntese de ADN. O tempo gasto em cada fase do ciclo celular foi determinada por FACS para controlar a população de BrdU-positivas como as células progrediu durante as fases S e G2 e acumulada na fase G1 [13]. Como mostrado na Figura 2, as células em géis macios evoluíram mais lentamente através da fase G1 do ciclo celular em comparação com as mesmas células que crescem em matrizes rígidas (Figura 2), consistente com uma diminuição global no metabolismo celular ou processos anabólicos que afectam o celular “crescimento” fase do ciclo celular. Uma vez que os perfis do ciclo celular são semelhantes após 2 e 5 dias em géis macios, é provável que isto representa uma medição de estado estável, em oposição à possibilidade de que o crescimento celular é gradualmente diminuindo ao longo do tempo. Com base no comprimento calculado do ciclo celular para células crescendo em moles em relação géis firmes, após 5 dias, a proporção de células em matrizes rígidas contra macio seria 1:4.3. A mesma proporção de crescimento em moles em relação géis firmes (1:4.3) foi observado pela contagem manual o número de células presentes em cinco dias, validando assim os cálculos BrdU de pulso-caça.

células A549 foram pulsadas com BrdU durante 30 minutos, seguindo o crescimento do gel moles ou duras, durante 2 dias. Rotulagem células A. com BrDU para análise do ciclo celular. As células são pulsadas com BrDU durante 30 min, e a população BrdU-positivo é seguida ao longo do tempo medida que passa através das fases do ciclo celular. B. Scatter histogramas lote de células marcadas com BrdU no mole (painel superior) ou géis firmes (painel inferior), coradas para conteúdo de DNA (eixo X) e BrdU (eixo Y). Os tempos indicados são os tempos, em horas, após o pulso de BrdU. C. Análise de progressão do ciclo celular foi realizada no gráfico de dispersão histogramas a partir das células cultivadas em géis durante 2 dias (esquerda) ou 5 dias (para a direita).

O metabolismo celular em células dependentes de rigidez cultivadas sobre geles macios

a fase G1 do ciclo celular e assenta sobre os eventos metabólicos celulares e é crítica para a síntese de proteínas estruturais e enzimas que contribuem para a geração de novos organelos e o crescimento global da célula. Porque a fase G1 do ciclo celular foi prolongada em células dependentes de rigidez cultivados em géis macios, a hipótese de que pode haver alterações metabólicas em condições de crescimento de substratos macios. Cultivar a A549 dependente da rigidez ou células MDA-MB-231 em geles moles para 2 dias resultou numa redução de aproximadamente 50% nos níveis de ATP em comparação com células que crescem em géis firmes (Figura 3). Tal como o alongamento da fase G1, os níveis mais baixos de ATP celular são consistentes com uma diminuição no metabolismo celular quando as células dependentes de rigidez são cultivados em géis macios.

os níveis de ATP foi medida em células A549 (esquerda) ou As células MDA-MB-231 (à direita) após cultura sobre geles de poliacrilamida durante 2 dias. Os dados representam a média de dois experimentos realizados em triplicado ± S.E., de células em (19200 Pa) géis moles (300 Pa) ou duros. Os níveis totais de ATP foram normalizados para o número de células. * P . 0,05

Efeito de rigidez na síntese de proteínas em células cultivadas em gel macio

Por causa da fase G1 prolongada e a diminuição dos níveis de ATP em células cultivadas em géis macios , determinou-se a rigidez da matriz podem regular a síntese de proteína líquida em células dependentes de rigidez. Para avaliar as alterações na síntese global de proteínas, e para identificar proteínas que podem ser diferencialmente sintetizados sob suave versus condições rígidas, utilizou-se uma aplicação recentemente desenvolvida de rotulagem isótopo estável de aminoácidos de cultura de células (SILAC) em conjunto com espectrometria de massa [10 ]. As células A549 dependente da rigidez e células mPanc96 independente de rigidez foram cultivadas em meios SILAC por duas gerações em placas de cultura de tecidos de plástico para rotular totalmente o proteoma com aminoácidos “pesados” (Figura 4A). As células foram então plaqueadas em géis macios, quer ou rígidas e ainda cultivadas em aminoácidos “pesado” para um período adicional de 4 dias. As células foram então incubadas durante 24 horas ( “impulso”), em meio “leves” (normal de meios de cultura de tecidos), e as proteínas celulares foram isolados a partir de cada uma das amostras e resolvidos em SDS-PAGE. As proteínas presentes nas amostras macias e duras foram analisados ​​tomando dez fatias de gel de cada faixa de proteína e sujeitando cada um a digestão com tripsina. a síntese de proteínas durante o líquido 24 horas “impulso” foi medido por determinação da relação de luz pesado para péptidos por espectrometria de massa para as proteínas nas amostras macias e duras. Uma experiência preliminar com células A549 cultivadas em plástico produziu pesado para proporções de luz (H /L) rácios de péptidos que eram semelhantes aos de células A549 cultivadas em géis firmes (0,6246 ± 0.2326 para o plástico contra 0,5482 ± 0.1785 para géis firmes). Figura 4B mostra boxplots para os rácios H /L de proteínas identificadas para as células A549 e mPanc96 em géis moles e duras usando SILAC. A proporção média pesada /leve dos péptidos nas células A549 em géis macios foi significativamente maior (p 0,05) do que nas células em géis firmes, indicando que a síntese líquida de proteínas foi reduzida em células em géis macios, (ou seja, menos de amino luz ácidos foram incorporadas durante o pulso na célula crescer em substratos moles em comparação com substratos rígidos). Em contraste, os pesados ​​rácios /luz de péptidos em células mPanc96 não foram significativamente diferentes entre as células que crescem em geles moles ou duras (p 0,05). (Figura 4B)

células A549 foram submetidos à análise SILAC para determinar taxas de síntese de proteínas no gel macio ou duro. A. Visão geral do procedimento SILAC. As células A549 foram cultivadas em geles moles ou duras durante 4 dias na presença de meios de “pesados”, seguido por uma incubação de 24 horas com meio de “light”. As células foram lisadas, as proteínas celulares foram digeridos com tripsina e os péptidos resultantes foram analisados ​​por espectrometria de massa. B. Boxplots de pesado à luz (H /L) proporções de proteínas a partir de células A549 (à esquerda) ou células mPanc96 (à direita) cultivadas em (150 Pa) substratos rígidos (19200 Pa) ou moles. distribuições /L relação H são significativamente diferentes entre duro e macio para células A549, mas não para células mPanc96 usando testes t não pareado bicaudal. As caixas contêm os dados entre os 25 e 75 percentil, e a linha dentro da caixa indica a mediana. A linha a tracejado na parte superior do gráfico indicará o limite, acima do qual os valores aberrantes foram truncados.

A análise de espectrometria de massa identificou 631 proteínas específicas nas células A549 e 729 proteínas específicas nas células mPanc96 (Tabelas S1 e S2). taxas relativas de síntese (razão H /L) para as proteínas individuais foram então comparados entre as células cultivadas em condições duras e suaves para determinar proteínas que são diferencialmente “expressas” ou traduzidas. Uma vez que as distribuições dos índices H /L diferiu entre as experiências duras e moles, os rácios H /L e variabilidade estimada foram normalizadas de forma independente para amostras A549 e mPanc96 (ver Métodos), e identificou proteínas com significativamente diferentes proporções H /L (p 0,05 ) usando t-testes. A Figura 5 mostra os gráficos de dispersão de rácios normalizados H /L entre amostras crescimento em substratos duros e macios. As proteínas que têm uma proporção significativamente menor de H /L (síntese preservado) em mole em comparação com géis firmes são indicados a vermelho e as proteínas que têm uma relação significativamente mais elevada H /L (síntese mais lenta) do que em soft géis firmes são indicados em verde. A linha pontilhada indica a relação H /L esperado sob a hipótese nula de que as proteínas manter o mesmo H /L proporção em relação à média.

rácios H /L de proteínas identificadas em ambas as amostras duras e moles plotados uns contra os outro para células A549 (à esquerda) e células mPanc96 (direita). H /L rácios da Figura 4 foram quantil normalizado e t-testes foram realizados utilizando variabilidade estimado (ver Métodos) para identificar proteínas individuais com relativamente diferentes taxas de síntese entre as amostras duros e moles. As proteínas que são sintetizadas mais rápido (relativamente mais baixo H /L proporção e valor de p 0,05). Em amostras moles (em comparação com amostras duros) são mostrados no vermelho, e as proteínas que são sintetizadas mais lenta nas amostras macias são mostrados em verde

a partir das proteínas identificadas por espectrometria de massa, que se separou as proteínas que exibiram significativamente diferentes rácios de H /L (p 0,05) entre as células cultivadas sobre géis firmes e moles (Tabela S3 para as células A549; a Tabela S4 mPanc96 células). Nas células A549, várias proteínas com funções biológicas comuns agrupados na categoria de síntese mais lento em géis macios (Tabela 1). Estas proteínas incluídas envolvidos na síntese de proteínas, tais como proteínas ribossomais e factores de alongamento. Subunidades de microtúbulos (tubulinas) também agrupados na categoria de síntese mais lento em géis macios. Curiosamente, duas proteínas com papéis cruciais na produção de ATP também exibida taxas mais lentas de síntese em géis macios: 6-fosfofrutoquinase tipo C (PFKP-1) e uma subunidade da ATP sintase. Estes dados sugerem que, quando células A549 foram cultivadas em um microambiente macio, um subconjunto de proteínas – incluindo aqueles que estão envolvidos na tradução e dinâmica dos microtúbulos – é sintetizado de forma mais lenta relativamente à velocidade média de síntese do que quando cultivados em géis firmes

por outro lado, as proteínas que tinham taxas de síntese mais elevada do que a maior parte das proteínas celulares, quando plaqueadas em géis macios incluídos membros da família da redutase de aldo-ceto, que estão envolvidos na defesa contra as espécies reactivas de oxigénio, e visfatina, que é importante para a manutenção de níveis fisiológicos dos cofactores nicotinamida (isto é, NADPH) que são importantes para estas reacções redox (Tabela 2). Além disso, proteínas com funções na endocitose e tráfego de vesículas, especificamente Anexinas e proteínas Rab, também foram encontrados para ser conservado em células A549 cultivadas em géis macios. Os dados apresentados neste quadro indicam que quando as células A549 são cultivadas num microambiente suave, a síntese de proteínas que são importantes para a regulação de espécies de oxigénio reactivas e a dinâmica da membrana é preservada.

semelhantes às células A549 cultivados em géis macios, várias proteínas ribossomais também foram sintetizados de forma mais lenta em células mPanc96 que foram cultivados em géis macios (Tabela 3). No entanto, ao contrário das células A549, várias proteínas com funções na tradução foram também encontrados a ter taxas de síntese mais elevada em células mPanc96 quando cultivados em géis macios (Tabela 4). Além disso, enquanto as células A549 mostrou proteínas envolvidas no tráfico de vesículas e de stress oxidativo vias como tendo taxas de síntese de conservas em géis macios, proteínas envolvidas nestes processos, tais como subunidades coatomer e superóxido-dismutase, respectivamente, foram sintetizados de forma mais lenta em células mPanc96 cultivadas sobre geles moles (Tabela 3), sugerindo que estes processos podem ser regulados negativamente quando as células estão a crescer em mPanc96 microambientes moles. Curiosamente, várias proteínas que estão envolvidas na regulação da adesão célula-matriz e de actina dinâmica, incluindo o membro da família Rac RhoG, fascina, e invertida formin-2, foram encontrados para ter maiores taxas de síntese quando as células mPanc96 são cultivados em géis macios (Tabela 4), além de duas proteínas (sintase de citrato e malato desidrogenase) que têm papéis cruciais no ciclo do ácido cítrico, um importante processo metabólico para a produção de ATP e de aminoácidos precursores. Estes dados sugerem que quando a linha celular independente de rigidez mPanc96 é cultivada num microambiente macio, há uma diminuição na síntese de proteínas envolvidas no tráfico de vesículas e de stress oxidativo vias, ao passo que há um aumento na síntese de proteínas envolvidas em actina dinâmica e o ciclo do ácido cítrico.

Uma vez que estes dados refletem apenas a síntese das proteínas, e os níveis globais das proteínas são determinados pelo equilíbrio de síntese e degradação, procuramos testar se esta alteração da síntese de proteínas foi realmente afectar os níveis celulares destas proteínas. Os lisados ​​de A549 e células mPanc96 cultivadas em geles moles ou duros foram sujeitos a Western blot para a actina, uma proteína que tinha não mostrou mudanças significativas em síntese relativa quando cultivados em géis macios, e duas proteínas que mostraram alta sensibilidade a rigidez, a saber, a tubulina e fosfofrutoquinase-1. Os níveis das proteínas foram normalizadas para GAPDH como um controlo de carga, porque não havia uma diferença significativa na síntese relativa de GAPDH entre géis macios e duros (p = 0,55, ver Tabela S1, linha 275). Como mostrado na Figura 6, a actina foi expressa em níveis semelhantes quando cultivadas em geles moles ou duras, enquanto os níveis de tubulina e PFKP-1 foram mais baixos nos géis macios em células A549, o que sugere que a taxa inferior de síntese destas proteínas observado no SILAC dados é reflectido por menores níveis destas proteínas nas células. Em contraste, as células mPanc96 não mostraram alterações em tubulina ou níveis PFKP-1 quando cultivados em géis macios. Estes dados indicam que, pelo menos para as proteínas examinadas (tubulina e PFKP-1), uma taxa mais lenta de síntese corresponde a níveis mais baixos de proteína celular.

. Os níveis de actina, tubulina, e fosfofrutoquinase-1 em células A549 cultivadas em (19200 Pa) geles moles (150 Pa) ou rígidas foram analisados ​​por Western blot. painéis inferiores mostram os níveis de GAPDH como um controlo de carga. B. Os níveis de actina, tubulina, e PFKP-1 em células cultivadas mPanc96 em geles moles ou duras, tal como analisada por Western blot. painéis inferiores mostram os níveis de GAPDH em lisados ​​de células como um controlo de carga. C. A quantificação dos resultados de Western blot em (A) e (B). Os níveis de cada proteína foi normalizada para a quantidade de GAPDH em cada amostra. Os níveis de proteína em amostras preparadas a partir de géis firmes foram definidos como 100%, e os níveis de proteína nas amostras macias são apresentados como percentagem de expressão destas amostras. Os resultados mostram a média ± D.P. de pelo menos três experiências. * P . 0,05 quando comparado com o nível de expressão de actina

Discussão

Neste artigo, demonstramos que a rigidez da matriz extracelular regula o metabolismo celular ea síntese de proteínas no câncer células. As linhas celulares de cancro dependentes de rigidez A549 e MDA-MB-231 sustentar a expressão de ciclina D1, quando cultivadas em soro em géis de poliacrilamida que têm propriedades mecânicas semelhantes às do tecido mole, tais como pulmão ou da mama. Apesar de a expressão da ciclina D1, células A549, quando cultivados em géis macios, apresentam um alongamento da fase G1 do ciclo celular, o que sugere que pode haver defeitos na síntese dos componentes estruturais e enzimáticas necessárias para a transição para a fase S . Por conseguinte, as linhas celulares dependentes de rigidez apresentam níveis mais baixos de níveis de ATP celular quando cultivadas em géis macios. Além disso, a síntese de proteínas em células A549 é mais lenta sob estas condições, com a síntese de proteínas estruturais específicos e as enzimas glicolíticas, tais como a tubulina, fosfofrutoquinase, e ATP sintase especialmente sensível à diminuição da rigidez extracelular. As proteínas que eram menos sensíveis à mudança na rigidez incluídas enzimas tais como a redutase de aldo-ceto e visfatina que estão envolvidas no metabolismo de produtos de ROS.

Matriz de rigidez tem sido sugerido para ser um mecanismo subjacente ao tropismo de tecidos de metástases de cancro, porque o crescimento de linhas celulares de carcinoma em geles moles ou rígidas se correlaciona com a sua capacidade para crescer em tecidos moles ou duros [5], [14]. No entanto, o mecanismo (s) que regulam o crescimento de células cancerosas de uma maneira específica do tecido são, sem dúvida complicada. As nossas observações sugerem que uma maneira em que as células de cancro dependentes de rigidez pode responder a um menos do que favorável ambiente tecido de matriz é o de diminuir o seu estado metabólico, o que oferece um mecanismo potencial para o tropismo de tecidos observada de células tumorais, e, talvez, dependente dos tecidos dormência tumor.

dormência tumor é definido como um estágio na progressão do cancro em que a doença residual está presente, mas é assintomática [15]. células cancerosas dormentes podem residir sem ser detectado em locais distantes do tumor primário, enquanto se aguarda posterior crescimento e recorrência clínica [16]. Estudos recentes suportam um modelo em que as células cancerosas do tumor primário irá difundir cedo durante a progressão da doença, de modo que no momento em que o tumor primário é detectado, pode haver células cancerígenas latentes já que residem em locais distantes [17]. Estas células são ou não proliferativa temporariamente, ou há um equilíbrio entre a proliferação e a morte celular, ou o sistema imunitário é manter o número de células em cheque. Curiosamente a última possibilidade está sob escrutínio por causa de estudos que mostram uma falta de recorrência do tumor em pacientes com câncer que foram submetidos a terapia imunossupressora [18].

Estudos recentes têm implicado o microambiente como um regulador chave de dormência de células tumorais e recorrência. Especificamente, as propriedades da matriz extracelular em locais de metástases podem desempenhar papéis importantes na determinação do estado das células tumorais disseminadas [9]. No entanto, uma visão mecanística sobre o modo como ocorre a dormência é escasso, uma vez que as células cancerígenas latentes são difíceis de detectar e estudar in vivo, e há uma escassez de modelos in vitro para a dormência de células tumorais. Até recentemente, tais modelos têm sido limitados a células cultivadas em membranas corioalantóicas (CAMs) ou na matriz 3D derivadas do tumor de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS matriz, ou Matrigel) [19], [20]. Matrigel é uma mistura de laminina, colagénio IV, e nidog�io, para além de uma variedade de proteases e factores de crescimento tais como TGF-p, FGF, EGF, PDGF, IGF e [21]. Uma vez que é gerado a partir de um tumor, a composição específica de Matrigel não é bem definida, e que pode variar de lote para lote, produzindo variabilidade nos resultados experimentais [22]. Embora as propriedades mecânicas de Matrigel foram analisados, eles também estão sujeitos a variabilidade devido a sua polimerização é afectada pela sua composição e outros factores experimentais, tais como a temperatura [23]. Além disso, actualmente, a única forma de alterar as propriedades mecânicas de Matrigel é adicionar componentes de matriz adicionais, tais como o colagénio I [24], o que também pode complicar a interpretação dos resultados experimentais.

Recentemente, modelos in vitro para dormência tumor ter expandido para incluir a utilização de géis de poliacrilamida como substratos de crescimento [25]. Ao contrário de Matrigel, um polímero de poliacrilamida é estável, homogénea, e as suas propriedades mecânicas não são sensíveis a alterações na temperatura [26]. A sua rigidez é facilmente sintonizável através da modulação da quantidade de agente reticulante bis sem afectar a sua capacidade para se ligar moléculas de ECM para a sua superfície [6]. hidrogeles de poliacrilamida pode abranger uma gama de módulos de elasticidade que inclui uma variedade de tecidos humanos provenientes de gordura para o músculo esquelético [27], e uma variedade de moléculas de ECM podem ser conjugados com a sua superfície, incluindo o colagénio, a fibronectina, e não polimerizado Matrigel. Além disso, um sistema de elevado rendimento foi desenvolvido recentemente para permitir o rastreio de inibidores de moléculas pequenas com as células cultivadas sobre géis de poliacrilamida, abrangendo uma gama de módulos elásticos [5], [6].