Abstract
Defective IFN sinalização resulta em perda da imunidade inata e sensibiliza células para matar citolítica reforçada após Vesticular vírus da estomatite (VSV) infecção. Exame do estado imunidade inata das células normais humanas epiteliais brônquicas Beas2B e 7 células de câncer de pulmão revelou que a revogação da sinalização de IFN em células de câncer está associado a uma maior sensibilidade à infecção por VSV. A interrupção da via IFN em linhas celulares de cancro do pulmão e tecidos tumorais primária é causada por silenciamento epigenético de interferon crítica transcrição responsiva fatores IRF7 e /ou IRF5. Embora o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina falha para reactivar IRF7 e IRF5 expressão ou a proteger as células da infecção por VSV, a manipulação de sinalização de IFN por alteração da expressão de IRF altera a susceptibilidade viral destas células. células de câncer de pulmão pode ser parcialmente protegido da morte viral usando IRF5 + IRF7 superexpressão, enquanto que IFN via de interrupção por transfecção de siRNAs para IRF5 + IRF7 aumenta a vulnerabilidade das células à infecção viral. Portanto, IRF5 e IRF7 são fatores de transcrição chave em IFN via que determinam a sensibilidade viral das células de câncer de pulmão; a via de IFN prejudicada epigenetically em tecidos de câncer de pulmão fornece potenciais biomarcadores para a morte selectiva bem sucedida de células cancerosas por terapia viral oncolytic
Citation:. Li Q, Tainsky MA (2011) epigenética silenciamento de IRF7 e /ou IRF5 em Lung As células cancerosas leva ao aumento da sensibilidade ao Oncolíticos vírus. PLoS ONE 6 (12): e28683. doi: 10.1371 /journal.pone.0028683
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 15 Agosto, 2011; Aceito: 13 de novembro de 2011; Publicado: 14 de Dezembro, 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Li, Tainsky. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela cadeira dotada Barbara e Fred Erb em Câncer Genetics ao Dr. Tainsky, os fundos do Instituto Karmanos Cancer, a Medicina Molecular e Genética Aplicada Genomics Centro de Tecnologia da Wayne State University, e os Genómica e Bioestatística Cores do Karmanos Cancer Institute , P30CA022453. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Como a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em homens e mulheres, o cancro do pulmão é responsável por mais de 1 milhão de mortes em todo o mundo anualmente. Embora o diagnóstico e tratamento foram melhorados, a taxa de sobrevivência de cinco anos é de apenas 14%, em grande parte devido ao fracasso da cirurgia debulking tumor e quimioterapia sistêmica. A melhoria do tratamento do câncer de pulmão é um dos principais objectivos da saúde pública. Recentemente, de ocorrência natural ou geneticamente modificado oncolytic vírus, incluindo o vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle (NDV), VSV, adenovírus, reovírus e vírus Herpes simplex oferecer uma abordagem terapêutica alternativa eficaz e promissora para combater esta doença [1]. Usados sozinhos ou em combinação com a quimioterapia, os vírus oncolí ticos destruir selectivamente células tumorais por segmentação defeitos cancerosas em vias principais, como supressor de tumor p53, ras a transdução de sinal e as vias de sinalização de IFN [1], [2]. Atualmente a eficácia e segurança dos diferentes vírus oncolytic no tratamento de vários cancros está sendo avaliada em modelos animais pré-clínicos e fase I-III de ensaios clínicos [3]. Entre eles, um vírus de ARN de cadeia negativa de VSV, o que pode desencadear os mecanismos de imunidade inata, tem sido mostrado para ser eficaz contra o glioma maligno, melanoma, leucemias, hepatocelular, do peito, da bexiga e próstata que têm respostas antivirais defeituosos. via [4], [5], [6], [7].
IFN do Tipo I de sinalização é activado por infecção VSV como primeira linha de resposta imune inata para proteger tecidos normais de morte virai e, portanto, as células tumorais que perderam a sua reatividade antiviral representam alvos seletivos para VSV. A resposta primária após infecção viral e a absorção de ARN de cadeia dupla é a activação de TLR3 que é mediada por IRF-3, cJun /ATF-2, NFkB e, induzindo desse modo a produção de genes de resposta imediata-primeiros principalmente de IFNp. Essas IFNs de resposta iniciais ligam-se a receptores de IFN do Tipo I (IFNAR) de uma forma autócrina ou parácrina para activar STAT1 e induzem a expressão de genes de resposta secundária anti-virais, incluindo o factor de transcrição que depois IRF7 promove a expressão de outros genes de IFN estimulada (ISGs). Finalmente, a onda de transcrição terciário de IFN estabelece um estado antiviral [8], [9].
O comprometimento da sinalização de IFN está ligada a um risco aumentado de desenvolvimento de tumor [10], [11], [12 ] como a via IFN também exibe actividades de vigilância antiproliferativa e imunológico contra o câncer. Assim, a maioria (~ 80%) de 60 NCI painel visor linhas celulares de cancro rompidas respostas da imunidade inata [9]. Mostrámos que a via de sinalização de IFN foi anulada durante a imortalização espontânea em fibroblastos de pacientes Li-Fraumeni, síndrome de (IFT), que têm predisposição para o início precoce e vários tumores devido a mutações da linha germinativa no p53. Como um importante mecanismo de controlo epigenética, a hipermetilação do ADN de CpG nas regiões promotoras reprime a expressão do gene, tanto durante o desenvolvimento e a tumorigénese. Vários ISGs foram regulados negativamente pelo silenciamento epigenético durante a imortalização, um passo inicial e necessário na carcinogênese, e alguns dos mesmos ISGs foram regulados positivamente sobre envelhecimento replicativo [13], [14], [15]. O tratamento das linhas de células imortais LFS com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), um inibidor de ADN metiltransferases restaurado de sinalização de IFN e induzido um estado de senescência, do [13], [15].
os factores de transcrição de IFN-induzível, IRFs, são mediadores fundamentais do IFN-resposta. Falta de
IRF7
expressão correspondeu a hipermetilação do promotor aberrante de ilhas CpG dentro de seu promotor e também foi identificado como um dos genes silenciados-metilação em vários tipos de câncer, incluindo pulmão, hepatocelular, gástrico e pancreático [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. redução da expressão de IRF5, outro fator de transcrição importante da via IFN, também foi observado em doenças hematológicas malignas, o que é consistente com o seu papel de induzir a paragem do crescimento G2-M e apoptose [20]. inativação epigenética de
IRF5
foi igualmente observada em hepatocelular e câncer gástrico [21], [22]. Como indutores diretos de IFN caminho, IRF7 e IRF5 induzir a sobreposição ISG perfis de transcrição, no entanto, diferencial padrões de expressão e cinética da ISGs indiciado que possuem funções não redundantes e distintos na resposta imune inata. Em comparação com IRF7, IRF5 é um activador mais forte dos genes precoces antivirais incluindo IFNp [23]. Em um relatório recente, demonstraram que a expressão aumentada de IRF5 e /ou IRF7 poderia reativar genes relacionados IFN, inibir o crescimento celular e induzir a senescência [15]. Silenciamento destes IRFs essenciais e o crescimento de IFN via-supressora pode ser um evento precoce necessário para o desenvolvimento de cancro, particularmente associada com a imortalização.
Embora as células cancerosas, com o IFN-via revogada, pode ter adquirido uma vantagem de crescimento /sobrevivência sobre os seus homólogos normais, eles simultaneamente comprometer a sua capacidade de protecção antiviral. Aqui, novas terapêuticas que envolvem paradigmas vírus de ARN oncolíticos para direccionar o sistema imune inato defeituosa em células cancerosas estão a ser exploradas. Verificou-se que a sensibilidade ao oncolítico VSV foi fortemente e significativamente associados com o rompimento da via de sinalização de IFN. Uma falha para sobre-regular a expressão após estimulação ISG ARNcd indicou uma resposta antiviral enfraquecida sensibilizar linhagens de células de cancro do pulmão para a morte celular induzida pelo VSV oncolítico. No entanto, nem todas as células de câncer de pulmão podem ser mortos por infecção VSV, como alguns deles possuem um caminho relativamente normal imunidade inata e, portanto, são resistentes à morte viral VSV-mediada. seqüenciamento bissulfito revelou hipermetilação do promotor de qualquer
IRF7
e /ou
IRF5
em várias linhas celulares de cancro do pulmão. Da mesma forma, quando nós investigamos o DNA de tecidos de câncer de pulmão congeladas frescas, observamos metilação do promotor de
IRF7
e /ou
IRF5
, sugerindo que a sua resposta antiviral IFN foi também epigenetically silenciados como IRF7 funcional e IRF5 são necessárias para uma via de IFN intacta. No entanto o tratamento com 5-aza-dC falhou para reactivar IRF5 ou IRF7 expressão ou células de cancro de pulmão de salvamento de infecção VSV. Alterando a imunidade inata através da manipulação de expressão IRF mudou susceptibilidade viral de Beas2B normal de células epiteliais brônquicas ou células de câncer de pulmão. Células sem uma resposta IFN funcional são parcialmente protegidos contra o vírus seguinte IRF5 e IRF7 superexpressão, ao passo que a interrupção da sinalização de IFN alvejando IRF5 e IRF7 usando siRNAs maior vulnerabilidade células Beas2B ‘aos efeitos citolíticos de VSV. Portanto, IRF5 e IRF7 são factores cruciais na via de IFN que determinam a sensibilidade viral das células aos vírus oncolíticos. A matança VSV altamente seletiva de células de câncer de pulmão com uma via IFN prejudicada devido à regulação baixa epigenetically de IRFs indica que estes genes são biomarcadores ideais para determinar a suscetibilidade de tumores à terapia viral oncolytic.
Resultados
deficiência de sinalização de IFN está associada com sensibilidade VSV
a via IFN controla a resposta celular à infecção virai e ARNcd. As células que têm um sistema antiviral inata totalmente funcional são capazes de se proteger contra vírus, em grande parte devido à indução de IFN cascata de sinalização. Mostrámos que a via de IFN foi epigeneticamente inactivado em fibroblastos de pacientes depois de imortalização espontânea LFS [14]. Exame do estado de imunidade inata na linha de células epiteliais brônquica normal Beas2B, seus
ras
transformado células derivadas e 2 clones tumorigênicos revelou que como atividade de sinalização IFN diminuiu a sensibilidade à VSV matar aumentou durante tumorigênese pulmonar (Li e Tainsky, inédito dados). Porque inativação funcional do IFN caminho tem sido uma característica comum de muitos tipos de câncer, usamos 7 linhas celulares de cancro de pulmão de longo prazo (4 adenocarcinomas: CRL5800, CRL5807, CRL5810 e CRL5872, 2 carcinomas escamosos: HTB172 e CRL5928 e um carcinoma de pequenas células: CRL5869) para estudar as mudanças em seu sistema imune inato.
Usando um conjunto representativo de ISGs em ensaios Q-RT-PCR, foram examinados tanto os níveis basais de expressão ISG e sua expressão após estimulação da via IFN por ARNdc sintético polyI: C, que imita o RNA viral [15]. Encontrámos inferior expressão da linha de base da maioria dos ISGs testados em todas as linhas celulares de cancro do pulmão, em comparação com células Beas2B (Tabela 1). A via IFN poderia ser ativado em células Beas2B como 12 dos 14 genes foram inducible por polyI: estimulação C. Em contraste, polyI: C não conseguiu induzir mRNAs de todos os 14 genes testados em CRL5810 células, enquanto as deficiências de indução variável de genes de resposta antivirais essenciais, tais como
IFN
,
IFNp
,
IRF7
,
IRF5
e
STAT1
foram detectados em células CRL5800, CRL5807, CRL5872 e CRL5869. Surpreendentemente, Q-RT-PCR demonstrou polyI:. C expressão indutível de 10 dos 14 ISGs em HTB182 e CRL5928 células em níveis semelhantes aos Beas2B indicando uma resposta antiviral relativamente normal nessas duas células de câncer de pulmão (Tabela 2)
Como sinalização imune inata comprometida leva muitas vezes a um aumento da sensibilidade à morte viral, sensibilidade de VSV foi investigada para determinar se a falta de activação ISG corresponde a vulnerabilidade elevada para matar oncolítico viral nas células de cancro do pulmão. Como esperado, as células Beas2B com resposta de IFN intacta resistiu a infecção VSV exibindo pouca alteração na viabilidade celular. Além disso, HTB182 e CRL5928 eram relativamente resistentes em relação a outras células de cancro de pulmão, como mais de 60% das células ainda estavam vivas em dose elevada de VSV (MOI5) mesmo sem o pré-tratamento de IFNa exógena (Figura 1A). Em contrapartida, o resto das linhas de células de câncer de pulmão variavelmente perderam a capacidade de se proteger de VSV. Um número crescente de células de cancro de pulmão de IFN-sinalização deficientes (de ~ 30% para ~ 70%) foram mortos através do aumento da dose de exposição de VSV e adicionando ao meio de IFNa não conseguiu inibir a citotoxicidade de doses elevadas de VSV (MOI5) em CRL5800, células CRL5810 e CRL5869 (Figura 1A). Curiosamente, os reduzidos níveis basais da maioria ISGs em todas as linhas celulares de cancro de pulmão sugeriram nenhuma associação entre o VSV e susceptibilidade níveis ISG basais (Tabela 1). A sensibilidade variável para matar viral correspondeu à revogação diferencial da resposta de IFN em linhas celulares de cancro do pulmão. Os efeitos selectivos virolytic de VSV foram mais significativas em CRL5810 células consistentes com os defeitos mais graves no seu sistema anti-viral inata (Tabela 2 e Figura 1A). Também identificamos 5 ISGs (
IRF5
,
IRF7
,
STAT1
,
IRF3
e
IFI16
), cuja expressão era distintamente elevada 3 vezes na resposta a poli I: C tratamento apenas em linhas de células resistentes a VSV (Tabela 2 e Figura 1A). A análise Western blot confirmou que a expressão elevada de ARNm ISG sobre polyI: indução C resultou em níveis de proteína sobre-regulada em células resistentes a VSV. Ser727 fosforilação de STAT1 só pode ser induzida por IFNp, mas não por IFNa [24], e foi usada como um marcador específico para a activação de genes de resposta precoce de IFN via. Um polyI forte: C-indução de fosforilada-STAT1 (p-STAT1, Ser727), os níveis de proteína de STAT1, IRF5 e IRF7 foi consistente com a resistência de células Beas2B normais e as duas células cancerosas, HTB182 e CRL5928, a infecção por VSV e vice versa para a linha de células do cancro do pulmão viral e minúsculas. fosforilação Ser727 leve de STAT1 pode ser detectada em células indicando CRL5807 relativamente normal de sinalização precoce IFN nesta linha de células em comparação com outras linhas de células de VSV-sensível. IRF5 e os níveis de proteína não foram uniformemente IRF7 induzível sobre polyI: Tratamento C em todas as linhas celulares de cancro de pulmão sensível ao vírus (Figura 1B). Nenhuma mudança significativa de proteína foi observada por IRF3 polyI: Tratamento C entre todas as células de cancro do pulmão, talvez porque a sua actividade é principalmente regulada pós-translacionalmente por alterações na fosforilação (dados não apresentados). Portanto, nossas observações apoiou a associação inversa entre a sensibilidade oncolytic a VSV ea capacidade de indução da sinalização de IFN em células epiteliais células Beas2B e câncer de pulmão brônquicas normais.
A. citotoxicidade selectiva de VSV em células de câncer de pulmão com defeito via de IFN. Beas2B e 7 linhas celulares de cancro de pulmão foram avaliados quanto à sua capacidade para induzir uma resposta anti-viral, por infecção VSV com ou sem pré-tratamento por IFNa citopaticidade induzida por vírus utilizando o ensaio MTT. Os valores foram normalizados para o valor de células não infectadas de controlo, o qual foi definido como 100% a partir de pelo menos duas experiências independentes (
N
= 3) com SD a 10%. (-): Sem controle de infecção VSV. MOI0.05: multiplicidade de infecção de 0,05, baixa dose de infecção VSV. MOI5: multiplicidade de infecção de 5, dose elevada de infecção VSV. B. níveis de expressão de proteína de vários ISGs em polyI: C tratados Beas2B e as células de câncer de pulmão foram comparadas com células não tratadas utilizando Western blot. Fold alterações de expressão e IRF5 IRF7 após polyI: C tratamento foram indicados. Tubulin foi usado como um controle de normalização.
epigenética silenciamento de fatores de transcrição críticos
IRF7
e
IRF5
resulta na anulação de IFN via
hipermetilação do promotor é um mecanismo epigenético de regulação gene conhecido para silenciar a expressão de genes em mecanismos de especificação autônoma e carcinogênese. Nós relatado anteriormente que a via de IFN foi revogada pelo silenciamento epigenético de uma chave mediador defesa antiviral IRF7 em fibroblastos LFS imortais [14], [15]. Curiosamente, um outro estudo encontrou exposição à fumaça de cigarro levou à supressão da sinalização de IFN devido ao
IRF7
hipermetilação do promotor, o que resultou na diminuição defesas antivirais do epitélio respiratório [25]. Portanto, nós investigamos se metilação do promotor de
IRF7
também poderia ser a causa de IFN interrupção via em linhas celulares de cancro do pulmão. sequenciamento de DNA do DNA genômico tratado pelo bissulfito de sódio revelou
IRF7
hipermetilação do promotor em linhas celulares de cancro do pulmão 2 (CRL5810 e CRL5869), o que sugere que o silenciamento epigenético de
IRF7
tem desempenhado um papel na perturbação de IFN sinalização nestas linhas celulares (Figura 2A). Desde IRF5 induziu um perfil mais forte transcrição dos genes virais precoces [23] e foi recentemente identificado como um novo marcador para o cancro da metilação [21], [22], examinámos ainda mais o estado de metilação de
promotor IRF5
regiões em células de câncer de pulmão. Aumentando
IRF5
hipermetilação foi encontrado em CRL5800, CRL5807, CRL5872 e CRL5810 linhas celulares (Figura 2B), assim a susceptibilidade semelhante vírus da
IRF7
-unmethylated CRL5800, CRL5807, CRL5872 células foi a consequência de epigenética
IRF5
inativação. Além disso, hipermetilação do promotor de ambos
IRF7
e
IRF5
explicou a maior sensibilidade para VSV manifestada por CRL5810 células. Em contraste, regiões promotoras de nem
IRF7
nem
IRF5
foram encontrados para ser metilado no Beas2B, CRL5928 e HTB182 linhas celulares compatíveis com a sua imunidade inata intacta e resistência à morte viral oncolytic. No total, a perda selectiva de protecção virai em células de cancro do pulmão foi relacionada com inactivação epigenética de pelo menos um dos IRFs implicando a necessidade de ambos IRF7 e IRF5 estar activo para uma via de IFN funcional.
O estado de metilação de ilhas CpG no
IRF7
e
IRF5
regiões promotoras em Beas2B, linhas de células de câncer de pulmão e tecidos humanos primários foi examinado por sequenciamento de bissulfito tratado DNA genômico. A. IRF7. B. IRF5. círculos fechados, C metilado em dinucleótidos CpG; círculos abertos, C não metilado em dinucleótidos CpG. TSS, local de início da transcrição.
Como os eventos epigenéticos podem ocorrer durante a cultura de longo prazo, que não estavam presentes no câncer original, que analisou padrões de metilação IRF-promotor em tecidos de câncer de pulmão primário fresco congelado . O
IRF7
promotor foi totalmente metilado em 6 de 20 CPNPC, enquanto outros 5 tumores tinham metilação 5′- parcial (Figura 2B) como um evento inicial que pode se espalhar para a vizinha locais CpG [26]. Em paralelo, encontramos metilação pesado em 4 de 20 amostras de NSCLC e 11 outros tinham metilação parcial das
IRF5
regiões promotoras. Em geral, 15 dos 20 doentes tinham amostras de metilação do promotor de um ou ambos os IRFs, eventos suficientes para atenuar a resposta de IFN. Sem aberrante
IRF7
ou
IRF5
hipermetilação foi detectada nos correspondentes DNAs revestimento buffy destes mesmos pacientes que indicam que o promotor hipermetilação IRF não tinha resultado de germinativas mudanças epigenéticas. Portanto, a metilação
IRF7
ou
IRF5
promotores encontrados nas linhas de células de câncer de pulmão, provavelmente teve sua origem no tumor em vez de ser um evento selecionado durante a cultura de células. Os nossos resultados demonstram que o aumento da susceptibilidade a infecção virai é mediada por mecanismos epigenética regulação negativa principais reguladores via de defesa antiviral IRF5 e IRF7. A prevalência de silenciamento epigenético de IRFs e sua associação apertada com sensibilidade VSV torná-los biomarcadores theranostic ideais para triagem de pacientes com cancro do pulmão para uma possível terapia viral oncolytic.
Manipulação de IFN via de sinalização visando IRFs altera VSV sensibilidade viral
Nós anteriormente demonstrado que o 5-aza DC-tratamento desmetilação poderia restaurar a expressão do gene de epigenetically silenciados
IRF7
e outros ISGs reativando assim a via de sinalização de IFN em linhas de células de fibroblastos imortais LFS [14], [15] . Para nossa surpresa, os níveis IRF7 e expressão IRF5 permaneceu ausente (Figura 3A, a menos de 1,5 vezes maior para ambos IRF5 e IRF7) na linha de células de cancro do pulmão CRL5810 após o tratamento 5-aza-dC por até 4 semanas. Surpreendentemente, a sequenciação de DNA tratado pelo bissulfito no
IRF5
e
IRF7
regiões promotoras revelou que prolongado aplicação 5-aza-dC não foi capaz de reverter a hipermetilação do promotor de IRFs em CRL5810 células (dados não mostrado). resistência semelhante a 5-aza-dC tratamento foi encontrado para a outra linha de células de cancro do pulmão metilado-IRF7 CRL5869 (dados não mostrados). Como resultado, o tratamento desmetilação estendida com 5aza-CC foi incapaz de afectar a sensibilidade do VSV de CRL5810 células (Figura 3B) e ainda mais indicam que IRF5 e IRF7 são dois dos factores fundamentais na sinalização de IFN que podem regular a sensibilidade viral oncolítico.
A. Western blots revelou qualquer aumento da expressão da proteína ou IRF7 IRF5 após o tratamento com 5-aza-dC CRL5810 de células. Fold alterações de expressão e IRF5 IRF7 foram indicadas no topo da coluna tratada 5-aza-dC. células B. CRL5810 ainda eram sensíveis a VSV efeitos cytolyic após 5-aza-dC tratamento.
Nenhum destes dois fatores de transcrição IRF foi capaz de ser induzida em células VSV-sensíveis cancro do pulmão (Tabela 2 e Figura 1B), enquanto que a sobre-expressão de IRF5 e /ou IRF7 em fibroblastos LFS imortais upregulated outro ISGs, manifestou uma sinalização imune mais rápida e mais forte quando da estimulação ARNcd inata, a qual é suficiente para induzir a senescência [15]. A fim de reanimar a resposta de IFN deficientes em células de câncer de pulmão, IRF5 e IRF7 sozinho ou em combinação foram estavelmente transfectado em CRL5810 células, nas quais sustentados de tratamento de 5-aza-dC não teve efeito sobre desmetilação do promotor de IRF. A análise Western blot confirmou a expressão da proteína basal elevada de IRFs em IRF5 e IRF7 células que sobre-expressam (Figura 4A). restauração individuais de expressão de IRF parcialmente protegido a partir de células CRL5810 VSV citólise com o maior aumento de viabilidade celular de ~ 50% a mais de 85% em MOI0.05, e a partir de -30% a -50% em MOI5 de infecção VSV em células que sobre-expressam tanto IRF5 e IRF7 em comparação com células de controlo do vector (Figura 4B). Explicamos o ganho modesto de proteção viral mesmo depois IRF5 e IRF7 transfecção combinada por uma grave perda de outras ISGs importantes na CRL5810 células como indicado pela falta de efeito sobre IFN exógeno.
A. níveis de STAT1, IRF5 e IRF7 expressão da proteína foram analisados por Western blot em IRF estável transfectada CRL5810 células. anticorpo anti-FLAG foi aplicado para detectar os níveis de proteína IRF transfectadas, enquanto IRF5- e anticorpos específicos de IRF7 foram usadas para a expressão de proteína total de IRF. B. A sobre-expressão de IRF5 e /ou aumento da resistência IRF7 parcialmente CRL5810 ‘células à infecção por VSV com a maior aumento na trasfection combinado. * P 0,02, ** p . 0.001
A replicação seletiva de VSV em tumores com comprometido via IFN é a pedra angular para a sua aplicação clínica como terapia viral oncolytic. No entanto, nem todos os cancros dos doentes com cancro do pulmão são deficientes em seu caminho imune inato. Para superar esse obstáculo e destruir as células VSV-resistente, siRNAs para IRF5 (siIRF5) e IRF7 (siIRF7) foram aplicados para suprimir a resposta de IFN em células com via de IFN ativa. Em comparação com células transfectadas com Beas2B controlo scrambled siRNA, as células transfectadas com siIRF5 ou siIRF7 resultou numa diminuição da IRF5 e indução IRF7 após polyI: Tratamento C, enquanto a transfecção de ambos siIRF5 + siIRF7 totalmente eliminado IRF activação (Figura 5A). A transfecção de siIRF5 polyI sozinho inibiu significativamente: C-activação de ambos IRF5 e IRF7, o que pode ser explicado por um papel essencial para IRF5 como um forte indutor de IFNp [23]. expressão IRF5 diminuída por siIRF5 resultou em muito menos produção de IFNp levando à diminuição da estimulação dos IRF7 gene resposta secundária. Como esperado, a supressão dos 2 genes por ARNsi resultaram em perda significativa da protecção contra a infecção por VSV com o aumento mais citotoxicidade para quase 40% mais elevada mediante exposição a uma dose de VSV nas knockdowns combinada comparado com ARNsi de controlo (Figura 5B). Descobertas similares foram observadas em estudos de transfecção de células paralelas CRL5928-resistentes VSV, que têm de sinalização de IFN relativamente intacta (dados não apresentados). Isto demonstra claramente que IRF5 e IRF7 são funcionalmente essencial para a imunidade inata que determina a sensibilidade virai destas células.
. Revogação da IRF5 e /ou indução IRF7 por siRNAs sobre polyI: tratamento foi C mostradas por western blot. Fold alterações de expressão e IRF5 IRF7 após polyI: C tratamento foram indicados. Si (-): ARNsi de controlo. B. IRF5 e IRF7 são fatores importantes que determinam a sensibilidade viral das células. A inibição destas 2 genes resultou na perda de protecção contra a infecção por VSV com o aumento mais citotoxicidade na combinação knockdown. * P 0,03, ** p . 0,001
Em resumo, a perda de sinalização de IFN é necessária e suficiente para o aumento da sensibilidade à morte por vírus oncolíticos. A manipulação da via de IFN por meio de factores de transcrição e IRF5 IRF7 alterou a resposta das células à infecção VSV. Análise da via de IFN usando estes marcadores de metilação IRF pode fornecer novos biomarcadores theranostic para determinar a sensibilidade do paciente para os vírus oncolí ticos.
Discussão
Um sistema imune inato antiviral funcional protege as células contra a infecção viral, principalmente devido à indução da cascata de sinalização de IFN defensiva, o que parece ser a base para a resistência ao vírus e propriedades estimuladoras imunitárias. Aqui, temos demonstrado a forte relação inversa e convincente entre a resposta antiviral inata eficaz e susceptibilidade viral oncolytic utilizando linhas celulares de cancro do pulmão. Além disso, factores de transcrição e IRF5 IRF7 foram identificados como reguladores críticos do sistema imune inato e biomarcadores úteis para a susceptibilidade do vírus oncolítico em células de cancro de pulmão, como ambos têm que ser indutivel para uma via de IFN funcional. Inativação de qualquer IRF5 ou IRF7 enfraquecido a resposta antiviral com a perda mais significativa quando ambos IRFs foram epigenetically silenciada na CRL5810 células. O grau variável da morte citolítica foi relacionada com a gravidade diferencial de defeitos da via IFN. Apesar da presença de IFNa exógeno, CRL5810 células não são responsivos e permanecem vulneráveis a VSV matando correspondente à interrupção completa de actividade da via de IFN.
A perda de expressão do gene supressor de tumor por metilação aberrante do promotor é um dos primeiros e comum evento epigenético durante o início e progressão do câncer [27]. Nós mostramos silenciamento epigenético de
IRF5
e
IRF7
em ilhas CpG de regiões promotoras de cancro do pulmão. segmentação farmacológica de alterações epigenética aberrantes por agentes de desmetilação demonstrou eficácia clínica em várias malignidades hematológicas [28]. No entanto, esses inibidores de metilação pode não prevenir a recorrência de hipermetilação e nós têm apresentado evidências de que a desregulação epigenética não pode ser totalmente revertido em uma série de linhas celulares de cancro do pulmão. A falha de agentes de desmetilação para restaurar a expressão ISG cruciais indica que as células de cancro do pulmão são os alvos ideais para a terapia oncolitica viral.
Embora a maioria dos níveis basais de ISGs foram reduzidos em todas as linhas celulares de cancro do pulmão em comparação com epiteliais brônquicas normais células, sensibilidade viral oncolítico está associado apenas com polyI: os níveis de expressão de c-indutível de certos ISGs chave, tais como IRF7 e IRF5. No entanto, a sobre-expressão e IRF5 IRF7 não é suficiente para restaurar completamente IFN via e células apenas parcialmente resgatados da infecção viral devido a deficiência de outras ISGs importantes. A falha para induzir a fosforilação mediante Ser727 polyI: C tratamento sugerido defeitos na imunidade inata adicionais em várias linhas de células sensíveis de VSV (Figura 1B). Além disso, o ARNm de outros 3 ISGs (STAT1, e IRF3 IFI16, Tabela 2) é consistente induzida em células resistentes a VSV. Mais estudos são necessários para confirmar os como biomarcadores theranostic e pode identificar ISGs adicionais como biomarcadores em câncer de pulmão cuja activação pode distinguir resistente a vírus de cancros sensíveis ao vírus.
Nós apresentou provas de que a inativação funcional do IRF5 e IRF7 é o principal mecanismo para interromper IFN sinalização em células de câncer de pulmão. No entanto, várias malignidades abrigar diversos defeitos moleculares desta via. Desregulados JAK3 e RNase L percursos em células cancerosas da próstata LNCaP [29], STAT1 com defeito e activação STAT2 em células de fibrossarcoma e melanoma [30], [31] e sub-regulada IFNAR no cancro da bexiga de alto grau [32] têm sido relatados à desativar a sinalização imune inata. Em geral, a via de IFN é frequentemente regulados negativamente durante a tumorigénese, embora conjuntos distintos de ISGs são suprimidos por diferentes mecanismos de um modo específico do cancro do tipo-.
A incapacidade de resposta activar a imunidade inata por infecção de vírus de RNA conduz a oncolítico recarga altamente selectiva das células tumorais IFN-inadequadas. Além de VSV, outros vírus de RNA de NDV, tais como [33] e o vírus da gripe [34] também foram demonstradas ter citotoxicidade tumoral-selectiva utilizando o mesmo mecanismo de células com actividade de IFN diminuída alvo. Os ensaios clínicos da administração intravenosa de NDV (PV701) provou seus efeitos oncolíticos iniciais em vários tumores sólidos [35]. Em adição, estirpes com mutações VSV proteína M (AV1 e AV2) desencadeada resposta antiviral mais robusta por causa dos seus defeitos na capacidade de sinalização de IFN desligamento; estes mutantes são destruídas selectivamente em células de IFN-responsivo a uma dose terapêutica inferior, embora altamente lítica em células [9] cancerosas. Expressão de proteínas imunoestimulantes, tais como interleucina-2 (IL-4) ou IFNp em VSV engenharia genética também foi gerado para promover respostas citolíticas virais [5], [6]. Assim, as respostas de reforço anti-virais em células normais vai melhorar a selectividade oncolítico em tumores de IFN-não responsivos.
Apesar de uma resposta anti-viral reduzida pode ser uma característica comum de uma ampla gama de tipos de cancro, a eficácia oncolitica de ARN que ocorre naturalmente vírus ainda pode ser relativamente baixo, como alguns tumores manifestar robustas respostas da imunidade inata que inibem a replicação viral e se espalhar.