Abstract

Fundo

Nós teve como objetivo avaliar o significado clínico da densidade microvascular (MVD), densidade de vasos linfáticos (LVD), e fibroblastos associados ao câncer (FAC) em relação ao tumor localização no câncer colorretal avançado (CRC).

Métodos

Usando imunohistoquímica, foram examinados 181 pacientes avançados CRC para CD31 e D2-40 para medir MVD e LVD, respectivamente, α-actina de músculo liso (SMA) e desmina para identificar FAC, e PTEN para examinar as mudanças genéticas da FAC. Para avaliar a heterogeneidade regional dessas propriedades, que examinaram o tecido a partir de quatro sites (o centro ea periferia do câncer primário, uma metástase distante, e uma metástase em linfonodo) em cada paciente.

Resultados

MVD, LVD, e FAC mostraram heterogeneidade significativa no que diz respeito à localização do tumor. LVD foi o maior no centro dos cânceres primários e da quantidade de FAC foi o mais baixo em metástases à distância. Em metástases distantes, os do pulmão tinham maior LVD e MVD, mas menos do que aqueles FAC a partir do fígado, peritoneu, ou o ovário. Pacientes com baixa MVD e LVD no centro do cancro primário teve piores resultados e pacientes com poucas FAC em metástases à distância e no tumor primário tinha uma taxa de sobrevivência inferior. expressão de PTEN em FAC em metástases à distância foi perdida em 11 dos 181 pacientes de CRC (6,1%), que foi associado com um pior prognóstico.

Conclusões

O microambiente, incluindo microcirculação associada ao câncer e fibroblastos, é heterogénea em relação à localização do tumor em pacientes com CCR. Portanto, a heterogeneidade de microambientes devem ser tidos em conta na gestão de pacientes com CCR

Citation:. Kwak Y, Lee HE, Kim WH, Kim DW, Kang SB, Lee HS (2014) a implicação clínica do cancro do Associado microvasculatura e de fibroblastos em avançado colorretais pacientes com câncer com metástases sincrônicos ou metacrônicos. PLoS ONE 9 (3): e91811. doi: 10.1371 /journal.pone.0091811

editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 11 Janeiro, 2014; Aceito: 14 de fevereiro de 2014; Publicação: 18 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kwak et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo número de concessão 03-2011-012 do Bundang Fundo de Investigação Seoul National University Hospital. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora as taxas de mortalidade de câncer colorretal pacientes (CRC) diminuíram na maioria dos países ocidentais e em vários países em desenvolvimento da Ásia, avançou pacientes CRC que inicialmente apresentam-se com doença em estágio IV ou aqueles que desenvolvem metástases distantes vários meses após diagnóstico ainda tem uma menor taxa de sobrevivência de cinco anos [1], [2] ._ ENREF_4 recentemente, a gama de quimioterapia sistémica tem expandido e terapia-alvo, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) inibidor terapias , têm sido utilizados em pacientes avançados CRC, aumentando a sobrevida do paciente [3]. No entanto, alguns pacientes de CRC respondem fracamente a terapia orientada apesar de apresentar resultados positivos em estudos de mutação específicas da terapia direcionada [4]. Uma possível explicação para esta falha terapêutica é a heterogeneidade do tumor; vários estudos têm relatado que CRCs possuem um genótipo ou fenótipo heterogêneo, incluindo

KRAS

, p53, e

BRAF

[5] – [7]. Portanto, as características diferentes do local do tumor primário ea necessidade órgão metastizado correspondendo a ser esclarecida para melhorar a gestão dos pacientes de CRC com doenças metastáticas. Além disso, compreender as características clinicopatológicas de CRC avançado é importante para o desenvolvimento e melhoria das terapias sistémicas.

Desde Paget et al. em primeiro lugar descrito o microambiente do cancro pela teoria “semente e solo” [8], tem havido cada vez mais provas que o estroma associado a um cancro pode afectar as células cancerosas si e contribuem para a progressão tumoral [9]. Os principais componentes do microambiente do cancro são microvasculatura (microvasos e vasos linfáticos), células inflamatórias e fibroblastos associados ao cancro (FAC) [10] – [12]. O actual método de verificação da actividade angiogênicas e lymphangiogenetic em tecido de cancro é o de avaliar a densidade de microvasos (MVD) e densidade de vasos linfáticos (DBT), respectivamente. MVD tem sido proposto como um marcador substituto da angiogénese associada a cancro para identificar pacientes com um elevado risco de recorrência ou aqueles com mau prognóstico para vários cancros, incluindo CRC [13], [14]; No entanto, a correlação prognóstico da angiogênese no CRC ainda é controverso [15], [16]. Semelhante a angiogénese, LVD tem recebido um interesse como meio de metástases linfáticas e sobrevivência [17], [18], mas o seu papel na progressão tumoral ainda não é claro [19]. O outro componente proeminente de estroma, FAC, são constantemente activado e afectar muitos aspectos da iniciação do tumor, invasão e progressão [9]. Embora alguns estudos sugeriram que a FAC pode inibir a progressão tumoral [20], [21], estudos de outros propuseram que FAC pode promover a progressão na próstata, mama e cancros da pele [22] – [24]. No contexto da CRC, Tsujino et ai. sugeriram que α-actina de músculo liso (SMA) -expressing FAC pode ser um indicador útil de mau prognóstico. No entanto, estes resultados foram restritos a fase II e III CRCs [25].

Além de células cancerosas, alterações genéticas em FAC demonstraram incluindo a perda de heterozigosidade, instabilidade de microssatélites, e mutações genéticas [26], [27]. Recentemente, a inactivação genética de PTEN em FAC foi relatada em pacientes com câncer de mama [28]. Trimboli et ai. identificou-se que a perda de PTEN em fibroblastos do estroma resultou na extensa remodelação da matriz extracelular e que a angiogénese característica de progressão tumoral [28]. No entanto, a perda de PTEN e seu significado clínico expressão não foram investigadas em doentes com cancro colorectal.

O objetivo deste estudo foi investigar as características do microambiente, incluindo microvasculatures e FAC, em pacientes avançados CRC. Além disso, avaliou-se a heterogeneidade intratumoral no tumor primário e a discordância entre tumor primário e microambientes metástases à distância.

Materiais e Métodos

A seleção dos pacientes

Um total de 181 avançado pacientes com CCR com metástases síncronas ou metacrônicos, que foram tratados no Seoul National Bundang Hospital Universitário (Seongnam-si, Coréia do Sul) entre 2003 e 2009, foram incluídos neste estudo. metástases síncronas foram definidos como metástases à distância que ocorrem no prazo de seis meses do diagnóstico primário de CRC e metástases metacrônicos foram aqueles que ocorrem após esse ponto de tempo [29]. O tecido do cancro utilizada neste estudo foi recebido a partir de pacientes que tiveram ressecção cirúrgica de tanto do tumor primário e as metástases relacionados. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes da ressecção do tumor primário. prontuários médicos e relatórios de patologia foram revisados ​​para gravar dados clínicos e patológicos. lâminas de vidro foram revisados ​​para determinar o tipo histológico de acordo com a classificação da OMS [30]. foi coletado informações de acompanhamento, incluindo o resultado do paciente e o intervalo de tempo entre a data da ressecção cirúrgica e morte. Os casos perdidos para follow-up e as mortes de outros que CRC causas foram considerados dados censurados para a análise de sobrevivência. O período médio de acompanhamento foi de 37,9 meses (variação, 0.8-104.6 meses).

Ethical declaração

Todos os espécimes humanos foram obtidos a partir dos arquivos de casos cirurgicamente ressecados examinadas no Departamento de Patologia , Universidade Nacional de Seul Hospital Bundang para o diagnóstico patológico. O estudo retrospectivo foi realizada utilizando as amostras armazenadas após o diagnóstico patológico, e todas as amostras foram anónimos antes do estudo. Os participantes não forneceu consentimento informado por escrito neste estudo. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Seoul National University Hospital Bundang Institutional Review sob a condição de anonimização. (Referência: B-1109 /136-302)

métodos de arranjo de tecido

Para avaliar a diferenças regionais do estroma, as amostras foram retiradas de cada paciente a partir de quatro áreas: o centro ea periferia do câncer primário, metástases à distância, e de metástases linfáticas. As metástases distantes para as matrizes de tecidos foram os seguintes: fígado em 83 casos (45,9%), de pulmão em 38 casos (21,0%), seedings em 38 casos (21,0%), nódulos linfáticos distantes em 6 casos (3,3%), e dos ovários em 16 casos (8,3%). As amostras de tecido do núcleo representativo (2 mm de diâmetro) foram retirados de blocos de parafina individuais e reorganizados em novos blocos de matriz de tecido usando um aparelho trephine (Superbiochips Laboratories, Seoul, Coreia do Sul) [31].

Imunohistoquímica

lâminas de matriz foram marcadas por imuno-histoquímica utilizando anticorpos para CD31 (1:100, DAKO, Glostrup, Dinamarca), D2-40 (1:100, DAKO), SMA (1:1000, Neomarkers, Fremont, CA, EUA ), desmina (1:300, Dako) e PTEN (1:80, Epitomics, Burlingame, CA, EUA), após um processo de recuperação antigênica microondas exceto SMA. Os locais não reactivos foram bloqueados usando soro de cavalo a 1% em solução salina tamponada com Tris (pH 6,0) durante 3 min. Os anticorpos primários foram aplicados e a ligação do anticorpo foi detectada com diaminobenzidina (DAB). As secções foram contrastadas com hematoxilina. A reatividade de PTEN em cada secção de tecido foi marcado como negativo, fraco ou forte, e o percentual de fibroblastos PTEN-positivas foi quantificada. Para a análise estatística, a amostra foi considerada PTEN-positivo se 5% ou mais FAC foram classificados como positivos fortes.

Cálculo do LVD, MVD e FAC usando patologia digitais

As lâminas foram avaliadas simultaneamente por dois patologistas (HEL e HSL), utilizando microscopia de luz para melhorar a exactidão dos resultados (Fig. 1). células de CRC eram considerados como controlos negativos internos. De médio a navios de grande porte foram considerados como controlos positivos internos para CD31 e D2-40. camada muscular intestinal ou médio aos navios de grande porte foram considerados como controlos positivos internos para desmina e SMA. Amostras que apresentem coloração inadequada em controles negativos ou positivos internos foram considerados não-informativo e foram excluídos da análise. As lâminas foram digitalizados usando um instrumento Aperio ScanScope® CS (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA) a 20 × ampliação. Posteriormente, foram analisados ​​em ImageScope ™ usando o algoritmo v1 Análise de microvasos (Aperio Technologies), e MVD e LVD foram calculados. Porque desmina-positiva mucosa muscularis propria e são positivos para imunocoloração de SMA, a área de FAC (mm

2) foi calculada subtraindo-se as áreas de coloração de desmina de coloração que SMA. (SMA – desmina)

a análise estatística

Um teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher (2 lados) para variáveis ​​não contínuas e análise para variáveis ​​contínuas Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis foram utilizados para comparar cada parâmetro com respeito ao site do CRC e de acordo com suas características clínico-patológicas. A correlação entre as variáveis ​​contínuas foi analisada pelo coeficiente de correlação de Pearson. Para determinar os melhores pontos de corte de variáveis ​​contínuas para prever a sobrevida do paciente, o método do qui-quadrado máxima foi realizada utilizando o programa R (https://cran.r-project.org/). As curvas de sobrevida global foram plotados utilizando o método do produto-limite de Kaplan-Meier e o significado das diferenças entre estas curvas foi determinada pelo teste de log-rank. A análise de regressão univariada e multivariada foi realizada utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox para determinar taxas de risco (HR).

foram considerados estatisticamente significativos P

-Valores de menos de 0,05. Todas as análises estatísticas, excluindo o teste do qui-quadrado máxima, foi realizada com as estatísticas IBM SPSS 20 (Armonk, NY, EUA).

Resultados de

1. Heterogeneidade de estroma associado a um cancro de acordo com a examinou locais tumorais

As características clinicopatológicas dos pacientes avançados CRC estão descritos na Tabela 1. Os pacientes com CCR com metástases síncronas tinha características agressivas, incluindo maior tamanho do tumor, mais avançado pN PT e palco, ea presença de perineural e invasão venosa do que os pacientes com metástase metacrônica (p 0,05).

os valores heterogêneos para LVD, MVD, ea área CAF são mostrados na figura 2. LVD foi o mais alto no centro dos cânceres primários (mediana, intervalo interquartil (IQR); 37,00, 10,50-81,00) do que qualquer outro site (5,00, 1,00-23,75 na periferia; 2,50, 1,00-15,00 em metástases linfáticas; 3.00, 1.00 -20,00 em metástases distantes). MVD foi menor em metástases à distância (mediana, IQR; 641,50, 428,00-1006,75) do que na periferia do câncer primário (731,00, 508,25-1.049,75) e linfáticos metástases (893.50, 520,25-1.275,25). A área ocupada pelo FAC foi o mais baixo dos metástases à distância (mediana, IQR; 0,91, 0,68-1,18) do que qualquer outro site (1,12, 0,88-1,41 no centro; 1,22, 0,96-1,54 na periferia, 1,40, 1.00- 1,71 em metástases em linfonodos). Além disso, as características do estroma variaram em relação ao órgão metastático examinados. MVD e LVD foram os mais elevados em metástases do pulmão do que aqueles no fígado, nódulos linfáticos ou peritoneu (p 0,001; Fig. 3). No entanto, as quantidades de FAC foram consistentes entre os diferentes órgãos metastáticos (p = 0,180).

O LVD (A), MVD (B) e área de CAF (C) foi significativamente diferente de acordo com cada localização do tumor.

as características do estroma associado a um cancro diferem no que diz respeito ao local metastático. DBT (A) e MVD (B) foram maiores nas amostras tumorais metastáticas recolhidos a partir do pulmão do que em amostras recolhidas a partir de outras metástases (p 0,001). No entanto, a quantidade de FAC não foi significativamente diferente entre os locais metastáticos (C).

Apesar da heterogeneidade das características do estroma, casos de CRC com maior LVD, MVD e FAC no centro dos cânceres primários tinha um tendência de maior LVD, MVD e FAC na periferia (p 0,05; Tabela S1). No entanto, LVD no centro e na periferia do câncer primário não se correlacionaram com LVD na metástase distante relacionado (Tabela S1). Além disso, a quantidade de microvasculatura foi significativamente correlacionado com a quantidade de FAC (Tabela S2).

2. significado clínico do estroma associado a um cancro no CRCs avançados

O MVD, LVD e quantidade de FAC presentes em cada localização do tumor foram comparados de acordo com as suas características clínico-patológicas (Tabela 2). CRCs alto grau foram associados com FAC mais baixos em amostras retiradas do local do cancro central (p = 0,041). Quando comparado com metástases síncronas, os doentes com metástases metacrônicos tiveram maior LVD no centro e periferia do câncer primário e tinha maior MVD em metástases linfáticas. A maioria dos pacientes com metástases metacrônicos foram tratados por quimioterapia adjuvante antes metastasectomia. LVD e MVD nas metástases distantes foram significativamente maiores nos pacientes que receberam quimioterapia antes da metastasectomia do que aqueles que não o fizeram (p = 0,011 e 0,048, respectivamente).

3. Expressão perda de PTEN em FAC

PTEN foi expressa em citoplasma e, por vezes, o núcleo, tanto de células não neoplásicas e do cancro quando examinado usando imuno-histoquímica. Expressão de PTEN foi perdido em 8 casos no centro, 2 casos na periferia, 4 casos em metástases linfáticas, e 11 casos em metástases à distância (Tabela S3). Em todas as 11 metástases distantes com perda de PTEN, PTEN expressão estava intacto em ambos o centro e na periferia do tumor primário (dados não apresentados). perda de PTEN em metástases à distância foi correlacionada com metástases síncronas (p = 0,018).

4. estroma associado a um cancro eo prognóstico do paciente

Ao utilizar os-offs corte obtido, inferior LVD, MVD e FAC no centro, LVD e FAC na periferia e MVD e FAC em metástases distantes foram todos significativamente correlacionados com menor sobrevivência (p 0,05; Fig. S1). Entre outras características clínico-patológicas, metástase síncrona, velhice, de tamanho maior, alto grau histológico, avançado estágio pT e PN e presença de invasão perineural foram associados a um pior prognóstico (Tabela 3). Por análise de regressão multivariada de Cox, a taxa de risco de síncrona contra metacrônica foi o mais alto (4.029) com o valor de p menor (p 0,001). FAC em metástases à distância, LVD e MVD no centro, LVD na periferia, idade e invasão perineural também previu independentemente a sobrevida do paciente. Além disso, a perda de expressão de PTEN em FAC em metástases à distância foi associada a um pior prognóstico (p = 0,042; Fig S2), mas não no câncer primário ou metástases linfonodais

Discussão

.

As células de carcinoma em diferentes áreas de tecidos têm características distintas [32]. Em áreas centrais do tumor, células de carcinoma de manter um fenótipo de células epiteliais, mas as células de carcinoma na frente invasiva adquirir um fenótipo mais maligna e mesenquimais e pensa-se que têm uma maior capacidade migratória e contribuir para doenças metastáticas. Estas células metastáticas podem restabelecer o fenótipo epitelial em locais metastáticos [33]. Em adição às próprias células de carcinoma, microambiente é sugerido para ser irregular dentro de um determinado tumor porque a formação e progressão tumoral envolvem a co-evolução das células e microambientes [34] cancerosas. O presente estudo demonstrou que o microambiente associada ao câncer também tinha características distintas em diferentes áreas. Dos locais examinados, LVD foi maior no centro do cancro primário. MVD era ligeiramente superior no centro do que na periferia do tumor primário, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa. Curiosamente, a quantidade de FAC em metástases distantes foi significativamente menor do que no centro e na periferia do cancro primário. Nós mostramos que o microambiente do estroma tem heterogeneidade regional tanto dentro do tumor primário e entre o sítio primário e as suas metástases relacionados. Além disso, nossos dados sugerem que a heterogeneidade do estroma podem ser atribuídas à heterogeneidade do tumor. Portanto, seria benéfico para considerar tanto a heterogeneidade da célula do estroma e tumor a fim de gerir melhor os pacientes de CRC.

Foi avaliado o MVD, LVD e quantidade de FAC em tecidos metastáticos de vários órgãos, incluindo o fígado, pulmão , semeadura peritoneal, nódulos linfáticos distantes, e ovário. Dos órgãos metastáticos que examinamos, tanto LVD e MVD foram as mais altas no pulmão. Em nosso estudo anterior, o

KRAS

taxa de discordância também foi significativamente maior em metástases pulmonares combinados do que em outros órgãos metastáticos combinados [35]. O mecanismo subjacente não é conhecido. Pode ser que os CRCs primárias com alta LVD e MVD têm uma tendência para produzir metástases pulmonares; No entanto, os nossos resultados indicaram que LVD e MVD no centro e na periferia dos cancros primários foram mais baixas nos pacientes com metástases pulmonares (dados não mostrados). Alternativamente, pode ser devido às características fisiológicas de órgãos metastáticos, as interacções entre as células cancerosas e microambiente dentro do órgão metastática, ou as características dos clones celulares de cancro propensas a metástase pulmonar. No entanto, erros técnicos ou de amostragem também pode ser possível, portanto, ainda são necessários estudos em grande escala.

Apesar de numerosos estudos têm tentado demonstrar uma associação entre características microambiente do tumor e sobrevivência, os impactos prognósticos de MVD e LVD são ainda controverso. Alguns estudos têm sido apresentados que a angiogênese ativa e lymphangiogenesis representado pela alta MVD e LVD estão associados com mau prognóstico e fatores clínico-patológicas agressivos [36], [37]. Meta-análise recente demonstrou que LVD foi significativamente associada com sobrevida livre de doença, mas não a sobrevida global [38]. Outros estudos não relataram nenhuma significância estatística de MVD e LVD na sobrevida [39]. Prall et ai. relatou que a alta MVD e LVD estão relacionadas com uma melhor sobrevivência em uma série e do fígado consecutivos metástases [40]. Nossos resultados foram baseados em pacientes com doença avançada com metástases à distância e mostramos que a alta MVD e LVD estavam relacionados com a melhoria da sobrevivência. Isso pode ser porque todos os pacientes neste estudo tinha confirmado ter metástase e microvasculatures distante poderia influenciar até mesmo a entrega do medicamento quimioterápico no tumor. No entanto, nosso estudo teve algumas limitações em termos de análise de sobrevivência. Foram incluídos os pacientes com CCR com tecidos de câncer cirurgicamente ressecados disponíveis de ambos os tumores primários e tumores metastáticos correspondentes. Nem todos os pacientes com CCR avançado com doenças metastáticas foram incluídos e casos avançados agora não foram incluídos devido à sua inoperacionalidade. Portanto, preconceitos não reconhecidos pode ter influenciado nossos resultados de sobrevivência.

Alguns estudos têm demonstrado um efeito anti-tumorigénica de fibroblastos [20], [21]. No entanto, tornou-se claro que o FAC contribuem para a progressão do cancro e do seu significado prognóstico em vários cancros também tem sido levantada [41], e as alterações genéticas Além disso, vários estudos têm observado no FAC [26], [27]. perda de PTEN de FAC foi observada no cancro da mama e prognóstico de associação tem sido sugerido [27], [28]. Observou-se a perda de PTEN da FAC em pacientes com CCR e foi mais frequentemente observada nas metástases distantes correspondentes. Sugere-se que FAC, as células cancerosas não só, ter alterado a expressão do gene. Além disso, a perda de expressão de PTEN da FAC em metástases à distância foi significativamente correlacionada com a sobrevida dos pacientes. Para o nosso conhecimento, estes são os primeiros resultados que mostram a perda de PTEN em FAC em pacientes com CCR. Embora seja necessária mais investigação, esperamos que ele pode ser um fator prognóstico em pacientes com CCR.

Em nossa grande coorte de pacientes com CCR avançado com metástases à distância síncrona e metacrônica, que demonstrou a heterogeneidade regional de fatores estromal microambiente de acordo para a localização do tumor. A quantidade de microvasculatura medido por LVD e MVD também era heterogéneo em relação ao órgão metastático examinados. Pela análise de regressão Cox, centro de LVD e MVD, LVD periferia e FAC em metástases à distância foram independentemente associados com o prognóstico dos pacientes, além de metástases distantes síncrona, idade e invasão perineural. Heterogeneidade de microambiente, não só das células de cancro, é sugerido para contribuir para a heterogeneidade do tumor e complexidade biológica, pelo que deve ser considerado no tratamento de pacientes de CRC. Além disso, nossos resultados mostraram que a expressão de PTEN foi alterada em FAC de CRCs, sugerindo que a FAC pode ter alterado a expressão do gene e desempenhar um papel activo na progressão do cancro.

Informações de Apoio

Figura S1. A associação

prognóstico das características do estroma que se refere à localização do tumor. A análise foi realizada utilizando valores de corte obtidos por métodos qui-quadrado máximas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091811.s001

(TIF)

Figura S2.

Representante PTEN colorações de anticorpos de células do estroma e da associação prognóstico da expressão de PTEN. (A) a expressão Intact de PTEN em FAC (× 400) e (B) perda de expressão de PTEN em FAC (× 400). (C-F) curvas de Kaplan-Meier de sobrevida para o centro (C) e periferia (D) do tumor primário, metástases em linfonodos (E), e metástases à distância (F) de acordo com status de expressão CAF PTEN.

Doi : 10.1371 /journal.pone.0091811.s002

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Tabela S1. coeficientes de correlação de Pearson entre

centro, periferia, metástases em linfonodos e metástases à distância

doi: 10.1371. /journal.pone.0091811.s003

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Tabela S2.

coeficientes de correlação entre FAC e LVD ou MVD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091811.s004

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Tabela S3. expressão

PTEN na FAC e fatores clínico-patológicas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091811.s005

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