Abstract

Fundo

Avançado tráfico lisossômico está associado ao câncer metastático. Numa tentativa para descobrir proteínas do motor lisossomal cancerosas relevantes, foram comparados os proteomas lisossomais de células MCF-7 de cancro da mama parentais com aqueles de alto poder invasivo, células MCF-7 que expressam uma forma activa do ErbB2 (ΔN-ErbB2).

Metodologia /Principais achados

a análise por espectrometria de massa identificou kinesin cadeia pesada proteína KIF5B como o único motor de microtúbulos associados com os lisossomos em células MCF-7, e ectópica ΔN-ErbB2 reforçada sua associação lisossômico. KIF5B associada a lisossomas também em células de carcinoma do colo do útero HeLa, tal como analisada por fraccionamento subcelular. A depleção de KIF5B desencadeada agregações periféricas dos lisossomas seguido de desestabilização lisossomal, e morte celular em células HeLa. Lisossomal exocitose em resposta ao dano da membrana plasmática, bem como a endocitose de fase fluida funcionaram, no entanto, normalmente, nestas células. Ambas as células HeLa e MCF-7 apareceu a expressar níveis semelhantes da isoforma KIF5B mas o fenótipo morte foi mais fraca em células empobrecido-KIF5B MCF-7. Surpreendentemente, a depleção KIF5B inibiu a acumulação induzida pela rapamicina de autofagossomas em células MCF-7. Em células com depleção de KIF5B os autofagossomas formada e acumulada na proximidade do aparelho de Golgi, enquanto que nas células de controlo que apareceu uniformemente distribuídas no citoplasma.

Conclusões /Significado

Nossos dados identificar KIF5B como uma proteína relevante câncer do motor lisossômico com funções adicionais na formação autophagosome

Citation:. Cardoso CMP, Groth-Pedersen L, Høyer-Hansen M, Kirkegaard T, Corcelle E, Andersen JS, et al. (2009) A exaustão das Cinesina 5B afeta Lisossomal Distribuição e Estabilidade e induz Peri-Nuclear Acumulação de autofagossomas em células cancerosas. PLoS ONE 4 (2): e4424. doi: 10.1371 /journal.pone.0004424

editor: Andreas Bergmann, UT MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de novembro de 2008; Aceite: 18 de dezembro de 2008; Publicação: 10 de fevereiro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Cardoso et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. CMP Cardoso foi um destinatário de uma bolsa da Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (SFRH /BPD /14448/2003). Este trabalho foi apoiado por subsídios da Sociedade Dinamarquesa do Câncer (MJ), a Danish National Research Foundation (MJ), o Conselho de Investigação Médica Dinamarquês (JN e MJ), o Meyer Foundation (MJ), o M. L. JÃ? ¸rgensen e Gunnar Hansen Foundation (MJ), a Fundação Novo (MJ e MHH), a Fundação Pedersen Vilhelm (JN e MJ), a Fundação de Pesquisa do Câncer da Dinamarca (MJ) eo consórcio Comissão Europeia FP7 APO-SYS (MJ e JSA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os lisossomos são organelas dinâmicas ligadas à membrana que representam o destino final de endocitose, secreção e as vias autofágicos [1]. A importância fisiológica dos lisossomos é destacado por uma série de doenças resultantes de defeitos na biogênese e função lisossomal [2]. Pelo contrário, a síntese aumentada, tráfico e liberação extracelular de proteases lisossomais (catepsinas), são características importantes de malignidade e associado com a capacidade invasiva e metastática de células cancerosas [3], [4]. Curiosamente, as alterações lisossomais associados com a imortalização e transformação das células cancerosas também sensibilizar células cancerosas para as vias de morte celular programada que envolvem a permeabilização da membrana lisossomal [5], [6]. Uma vez desencadeado, a permeabilização da membrana do lisossoma resulta na libertação de catepsinas e outras hidrolases lisossomais para o citosol, onde podem provocar a permeabilização da membrana exterior mitocondrial seguido de apoptose mediada por caspases [7], [8] ou mediar a morte celular programada independente de caspase [9]. Assim, a inibição de tráfico lisossomal /exocitose aparece como um alvo promissor para a terapia do cancro. Seria não só inibem a invasão mediada por catepsina mas também obstruir o tráfico geral e, eventualmente, resultar na acumulação dos lisossomas destinados a secreção e por isso mais sensibilizar células cancerosas para lisossomal vias de morte celular. Esta hipótese é suportada por dados que demonstram que a vincristina, uma droga anti-cancro desestabilizadores do microtúbulo, não só inibe o tráfico lisossoma mas também induz um rápido aumento do volume do compartimento lisossómico seguido de vazamento lisossomal e da morte de células dependentes de catepsina [10] .

Porque as drogas que perturbam o show rede de microtúbulos alta toxicidade geral, nós especulamos que uma interferência mais específico com o tráfico lisossoma pode resultar em estratégias anti-câncer com menos efeitos colaterais. Assim, queríamos identificar e caracterizar proteínas motoras importantes para o transporte lisossoma em células cancerosas. proteínas do motor que utilizam o citoesqueleto como substrato para o movimento são divididos em motores de miosina que se movem ao longo de filamentos de actina e motores de cinesina /dineína que utilizam microtúbulos através da interacção com a tubulina para o seu movimento [11]. proteínas do motor são alimentados pela hidrólise de ATP e converter energia química em trabalho mecânico que lhes permite mover carga (vesículas, proteínas e lipídeos) a longas distâncias. Microtúbulos motores específicos consistem em dois tipos básicos de motores de microtúbulos:. motores plus-finais e motores de menos de gama, dependendo da direcção em que se movem ao longo dos filamentos dentro da célula [12]

A forma truncada de o receptor ErbB2 é frequentemente encontrado sobre-expresso em cancro da mama e a sua expressão e a actividade correlaciona-se com o aumento da capacidade de invasão, motilidade e prognóstico pobre [13]. Por conseguinte, a expressão ectópica de ΔN-ErbB2 em células MCF-7 de cancro da mama torna-os altamente móvel e invasiva [14] (A nossa observação não publicada). Motivada pela constatação de que o fenótipo invasivo induzido ΔN-ErbB2 foi associada com o tráfico lisossômico alterada e um aumento de várias vezes na expressão e atividade de proteases lisossomais, escolhemos este sistema modelo para procurar proteínas motoras lisossômico câncer relevante. Nós aplicamos uma análise proteômica quantitativa em lisossomos purificada a partir de células MCF-7 e de controlo células ΔN-ErbB2 que mostram que alguns níveis de proteína motora foram significativamente regulada para cima após a indução ΔN-ErbB2. Curiosamente, verificou-se que ΔN-ErbB2 aumentou a expressão de cinesina 5B (KIF5B), uma proteína implicada no motor de lisossomal e transporte mitocondrial [15], [16]. Em consonância com isso, mRNA KIF5B tem sido relatada a ser regulado para cima em vários tipos de tecidos de câncer, incluindo câncer de bexiga (registro GDS1479), câncer gástrico avançado (GDS1210 registro), carcinoma de células escamosas (GDS2200 registro), mama basal-like esporádica câncer e câncer de mama associado a BRCA1 (registro GDS2250) (dados obtidos a partir NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez; Gene Expression Omnibus). KIF5B é um N-cinesina (Plus-motora), pertencente ao super-família de cinesina-1 motor proteínas moleculares que juntamente com dineína citoplasmática é responsável pelo transporte dependente de microtúbulos de cargas em células eucarióticas [17]. Para elucidar o papel do KIF5B em células cancerosas examinamos a sua função em várias vias lisossomais incluindo a via de morte celular lisossômico, a resposta de resselagem depois de dano à membrana plasmática (exocitose) e macroautofagia.

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamentos

MCF-7, células HeLa e células U2OS originam de carcinoma da mama humano, carcinoma de colo do útero e do osteossarcoma, respectivly. A linha de células MCF-7-eGFP-LC3 é um único clone celular de células MCF-7 que expressam uma proteína de fusão que consiste em reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) e LC3 de rato [18]. MCF-7-ΔNErbB2 e linhas de células de MCF-7-PTRE são clones de células únicas de células MCF-7 que expressam o transactivador de tetraciclina transfectadas com PTRE-ΔNErbB2 e PTRE, respectivamente [14]. células de HeLa-LIMP1-eGFP são as células HeLa que expressam eGFP lisossoma-tagged proteína de membrana integral-1 (LIMP-1) [19] (gentilmente fornecida pelo Dr. J. P. Luzio, Universidade de Cambridge). As células cancerosas e as suas variantes transfectadas foram propagadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro inactivado pelo calor 6% fetal de vitelo (FCS; Biological Industries) e penicilina-estreptomicina. O meio de células MCF-7 e MCF-ΔNErbB2-7-PTRE foi ainda suplementado com 5 ug /ml de tetraciclina. Para induzir a expressão ΔN-ErbB2, a tetraciclina (5 ug /ml) foi removido e as células foram lavadas 5 vezes em PBS antes do plaqueamento. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de ar humidificada a 5% de CO

2.

Análise de proteínas associadas a lisossomas por espectrometria de massa utilizando rotulagem isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC)

MCF-7-ΔNErbB2 e MCF-7-PTRE foram cultivadas em sintetizado por encomenda RPMI 1640 com tanto lisina normais 12C614N2 (Lys0) ou isótopo marcado 13C615N2 L-lisina (Lis8) (Sigma-Isotec, St . Louis, MO) suplementado com 10% de soro de vitelo fetal dialisado (Invitrogen) durante pelo menos 5 divisões celulares para incorporar integralmente os aminoácidos marcados. Lisossomas foram purificados por fraccionamento de ferro-dextrano (FEDEX) de acordo com um protocolo publicado previamente [20]. Resumidamente, as células (80-90 × 10

6 no total) pré-incubadas com a FedEx (8 h) foram lisadas mecanicamente num homogeneizador Dounce e a fracção de membrana de luz foi carregado numa coluna de MiniMachs ligado a um íman (sistema de separação MACS, Miltenyi Biotec). Lisossomas retidas na coluna foram eluídas em tampão de extracção de sacarose (sacarose 250 mM, HEPES 20 mM, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, e Pefabloc 1 mM, pH 7,5) através da remoção a coluna do ímã e expulsar lisossomos por um êmbolo. Lisossomas foram dissolvidos e as proteínas separadas por electroforese em NuPAGE Bis-Tris géis 4-12% de gradiente (Invitrogen) e corado com Comassie azul. fatias de gel foram cortadas em pequenos pedaços e incubados com 12,5 ng de tripsina /mL a 37 ° C durante a noite. Os péptidos resultantes foram analisados ​​por cromatografia líquida (Agilent HP1100) combinadas com espectrometria de massa tandem (LC MS /MS) usando um por captura de iões com transformada de Fourier de iões ciclotrão espectrómetro de massa de ressonância linear (LTQ-FT-ICR, Thermo-Finnigan). Lista de pico foram extraídos utilizando um in-house scripts desenvolvidos (DTA-Supercharge), combinadas para cada slides de gel, e usado para pesquisas de banco de dados de proteínas. critérios rigorosos foram necessários para a identificação de proteínas no banco de dados Index Proteína Internacional usando o programa Mascot (Matrix Science): pelo menos dois peptídeos correspondentes por proteínas, uma precisão de massa dentro de 3 ppm, uma pontuação Mascot para péptidos individuais de melhor do que 20, e uma pontuação delta do melhor do que 5. MS-Quant (https://msquant.sourceforge.net/), um programa de software in-house desenvolvido foi utilizado para calcular razão da abundância de péptidos e avaliar a certeza na identificação de péptidos.

siRNAs e transfecções

Três siRNAs foram concebidos para sequências alvo de ARNm KIF5B: 5′-CCAUCAUCAUACAAUGAGUCUGAAA-3 ‘(KIF5B-1), 5′-CGGCGACAAGUACAUCGCCAAGUUU-3′ (KIF5B-2), e 5’- CAUCUACCAGAAGGGAUCAAGACAA-3 ‘(KIF5B-3). Todos os ARNsi foram adquiridos a partir de Invitrogen. Em cada siRNA experimentar uma amostra de controlo tratada com o agente de transfecção sozinho e /ou um desfasamento de oligo KIF5B, 5’-CGGAACACAUGGCUAAACCGGCUUU-3 ‘(MM), foram incluídos. As células MCF-7 e HeLa foram transfectadas com 25 nM de ARNsi aplicação oligofectamine (Invitrogen) como agente de transfecção.

Medição da viabilidade das células e análise microscópica

As células viáveis ​​foram medidas pela sua capacidade para reduzir o sal de tetrazólio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-y) -2,5-diphenyltetrasodiumbromide (MTT, Sigma) a um corante de formazano detectável por análise espectrofotométrica em um leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices Ltd., Wokingham, Reino Unido), como descrito anteriormente [9]. Fase de contraste imagens de linhas celulares foram tiradas com uma Olympus IX-70 microscópio invertido conectado a uma câmera digital Olympus DP70. microscopia de lapso de tempo foi realizada com um microscópio de fluorescência Carl Zeiss Axiovert 200M usando software Metamorph.

Análise de translocação GFP-LC3

A autofagia foi induzida por incubação de células MCF-7-LC3-EGFP com 2,5 uM rapamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durante 24 h. A percentagem de células com translocação eGFP-LC3 em pontos (um mínimo de 100 células /amostra) foi contado em eGFP-LC3 células fixadas em formaldeído a 3,7% e 0,19% de ácido pícrico (vol /vol) de aplicação de laser Zeiss Axiovert 100 M confocal expressando Microscópio de Varredura. As células com ≥ 5 vesículas citosólicas verdes foram considerados positivos.

A medição da atividade das enzimas

Caspase-3-like (DEVD-AFC, Enxzyme System Products), catepsina cisteína (ZFR-AFC, Enzyme produtos do sistema), fosfatase ácida e SS

N-acetil-

glicosaminidase (foram determinados NAG) atividades essencialmente como descrito anteriormente [6], [9]. Resumidamente, a fracção citoplasmática foi extraída com 20-35 ug /ml de digitonina e a fracção celular total com 200 ug /ml de digitonina e a taxa de hidrólise do substrato apropriado V

max foi medida ao longo de 20 min a 30 ° C numa Spectramax Gêmeos fluorómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Lactato desidrogenase (LDH), a actividade do citosol determinado por um kit de detecção de citotoxicidade (Roche) foi usado como um padrão interno.

A análise de imunotransferência e imunocitoquímica

As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. Os anticorpos primários levantados contra KIF5B (SUK4 de Developmental Estudos Hibridoma Bank (DSHB), Universidade de Iowa) e ab5629 (de Abcam), associada ao lisossoma proteína-2 membrana (LAMP-2; H4B4 clone de DSHB), Grp75 (SPA825 de Stressgene ,), catepsina B (Ab1 de Oncogene), P70 S6 cinase 1 (p70

S6K1; # 9202) e phospo-p70

S6K1 (# 9206) (a partir de Cell Signaling Technology), e gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH, Biogenesis, Poole, UK) seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados de DAKO a /S (Glostrup, Dinamarca).

para imunocitoquímica, as células em lamelas foram fixadas com metanol gelado durante 10 min ou 3,7% de formaldeído durante 30 minutos a 25 ° C. As células foram coradas com os anticorpos primários indicados incluindo KIF5B rato anti ouriço do mar (1:20; SUK4), rato citocromo anti-humana

c

(clone 556.432 a 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , de cabra anti-humano γ-tubulina (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) e de ratinho anti-humano de LAMP-2 (1:100). Após a lavagem, as amostras foram incubadas com o apropriado Alexa Fluor-488- e 546-Fluor anticorpos secundários Alexa- /594-acopladas (Molecular Probes). imagens confocais foram feitas usando um Zeiss Axiovert 100 M Confocal Laser Scanning microscópio equipado com LSM 510 System (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

extracção de ARN, síntese de cDNA

e a transcrição reversa-PCR (RT-PCR)

o ARN foi colhido a partir de cultura de células com colunas RNeasy (Qiagen) e a síntese de ADNc foi efectuada com o kit TaqMan RT (Roche), utilizando oligo (dT)

16 iniciadores. As reacções de PCR foram realizadas de acordo com condições padrão com os seguintes iniciadores:

KIF1A-forw: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT; KIF3A-FORW: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC; KIF5A-FORW: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT; KIF5B-FORW: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC; KIF5C-FORW:. GCAACTGGAACAGGAGAAGC

KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-FORW: CATGTCTGGTAACGGCAATG; PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Porfobilinogénio-desaminase (PBGD; PubMed entrada BC000520) foi utilizada como controlo interno em conjunto com o gene de interesse. Os produtos de PCR foram tamanho separados num gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etídio, visualizado sob luz UV, fotografados utilizando película Polaroid.

subcelular fraccionamento

Para as células de fraccionamento de gradiente de densidade foram reunidas em tampão de homogeneização arrefecido em gelo (sacarose 250 mM, HEPES 20 mM e EDTA 1 mM, pH 7,4) e lisadas num homogeneizador Dounce em gelo. Os homogenatos foram centrifugados e o sobrenadante foi centrifugado a 3000 g durante 10 min a 4 ° C e o sedimento foi descartado. O sobrenadante foi centrifugado a 17000 g durante 20 min a 4 ° C. gradientes de iodixanol foram formados pela adição sequencial de 4, 10, 16 e 24% em soluções de tampão de homogeneização a 25 ° C durante 1 hora, resultando na formação de um gradiente contínuo. O sedimento final foi ressuspenso em tampão de homogeneização e introduziu-se um gradiente contínuo de 4-24% de iodixanol e centrifugou-se a 20.000

g

num rotor SW41Ti (Beckman) durante 17 h a 4 ° C. Os gradientes foram separados num total de vinte fracções de 500 uL, recolhidos a partir do fundo. A densidade de cada fracção foi determinada medindo a OD a 244 nm. Catepsinas B /L,

N

-acetylglucosaminidase (NAG) e actividades de fosfatase ácidas foram medidos para cada fracção após a adição de digitonina.

A análise da atividade exocitose em cima da membrana plasmática ferindo

ferimento membrana por electroporação foi efectuada como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, as células foram suspensas em Hanks solução de sal equilibrada (HBSS) (Gibco, Invitrogen), submetidas a electroporação a 200 V com níveis variáveis ​​de capacitância em um 0,2 cm Pulser gene eléctrodo cuvete (Bio-Rad), e incubou-se durante 1 minuto a 37 ° C. As células foram então incubadas com anti-LAMP-1 (SC-20011, Santa Cruz Biotechnology) de anticorpos em gelo durante 30 min, lavadas, fixadas e coradas com anticorpos secundários 488 Alexa Fluor (Molecular Probes). A citometria de fluxo sobre 10000 células por amostra foi realizada com um FACS (Becton Dickinson) e os dados foram analisados ​​pelo software CellQuest (Becton Dickinson). Para medir a actividade de células induzidas exocitose ionomicina foram incubadas em HBSS que continha 10 jiM de ionomicina (Sigma). Uma sonda específica para a catepsina B, ZFR-AMC (VWR International) foi adicionada a cada poço a uma concentração final de 100 uM no tempo 0 e 10 min. A taxa de hidrólise do substrato, tal como medido pela libertação de AMC (comprimento de onda de excitação, 400 nm; comprimento de onda de emissão, 489 nm). A 30 ° C num fluorómetro Gêmeos Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA)

resultados

ΔNErbB2 aumenta o nível de KIF5B nos lisossomos

células MCF-7 de carcinoma da mama expressar forma constitutivamente activa truncado terminalmente-amino de ErbB2 receptor tirosina quinase (ΔNErbB2) apresentam um fenótipo altamente móveis caracterizada por extensa ruffling membrana, as projecções da membrana plasmática e da dispersão das células (Fig. 1a). Além disso, a expressão ΔNErbB2 induz a localização de lisossomas para a filopios (Fig. 1A) e uma dobra-3-4-regulação de actividade de catepsina lisossomal cisteína [6] sugerindo que ΔN-ErbB2 altera o tráfico lisossomal e conteúdo. A fim de identificar proteínas do motor envolvidas no tráfico lisossomal em células cancerosas, que comparou os proteomas de lisossomos, isolados a partir de células MCF-7-ΔNErbB2 controlo MCF-7 e por rotulagem de isótopos estáveis ​​por aminoácidos (Lys0 /Lis8) em cultura de células ( SILAC) seguido por análise de espectrometria de massa [22]. Seis motores de miosina e um microtúbulo motora cinesina específica pode ser detectada por esta abordagem como proteínas de motor associado com lisossoma (Tabela 1 e conjunto de dados S1). A associação lisossomal de três das proteínas do motor identificadas (Miosina Ib, Ic e miosina de cadeia pesada cinesina KIF5B) foi regulado para cima em mais de 25% após a expressão ectópica ΔN-ErbB2 em células MCF-7. Para caracterizar o significado funcional destes três motores no que se refere ao crescimento, a sobrevivência e a distribuição do lisossoma que empobrecido-los em células de carcinoma do colo do útero MCF-7 e HeLa pela interferência de ARN. Apenas os siRNAs específicos para esses parâmetros KIF5B afectada (Fig. 2 e dados não mostrados). Assim, optou-se por estudar o papel da KIF5B na função lisossomal em mais detalhes.

(A) imunocoloração com específica LAMP-1 anticorpo lisossoma nas células de controle ΔN-ErbB2 e. (B) Análise de RT-PCR que mostra os níveis de expressão de mRNA de várias N-cinesinas incluindo KIF5A (349 pb), KIF5B (337 pb), KIF5C (320 pb), KIF3A (393 pb) e KIF1A (364 pb) em H: HeLa, M: MCF-7 e L: células U2OS. bandas de amplificação Kif são indicados com setas. O PBDG gene de manutenção da casa (257 bp) foi utilizado como controle interno. (C) fracções de membrana Luz de células HeLa foram separadas por ultracentrifugação de gradientes de iodixanol e os níveis de KIF5B expressão de proteínas, LAMP-2 (lisossomos) e Grp75 (mitocôndrias) foram visualizados por immunoblotting. Os níveis de catepsina B /G, da fosfatase ácida e NAG actividade enzimática foi medida em todas as fracções e serviram como marcadores lisossomais; a linearidade do perfil do gradiente de iodixanol foi determinada medindo a OD a 244 nm (gráfico inferior).

(A) Os níveis de proteína de KIF5B, 48 horas após a depleção com concentrações variáveis ​​de siRNA (KIF5B-1 siRNA ) para HeLa e MCF-7; β-tubulina serviu como controle interno. Oligof: células de controlo tratadas só com oligofectamine. (B) contraste de fase imagens representativas de células HeLa, MCF-7 e MCF-7-ΔN-ErbB2 células, 72 horas após o tratamento com ARNsi indicados. células (C) HeLa foram esgotadas para KIF5B ou tratados com o controlo MM siRNA e actividade metabólica determinada por um ensaio de MTT e morte estimada pelo ensaio de libertação de LDH (D). Os valores de MTT e LDH é apresentada como percentagem de células não tratadas. (E) caspase-3 como a actividade e a actividade da catepsina citosólica (F) em células HeLa após a depleção KIF5B (72 horas), medida por ensaios de enzima e DEVDase zFRase respectivamente. Os valores representam meio de medições em triplicado ± DP. Todas as experiências foram repetidas três vezes com essencialmente os mesmos resultados.

KIF5B é altamente expresso em várias células cancerosas

Em primeiro lugar, examinamos os níveis de KIF5B expressão de mRNA em cada três linhas celulares de cancro (MCF-7, HeLa e U2OS do osteossarcoma) e verificou-se ser altamente expressa em todas as três linhas de células, quando comparado com outras N-cinesinas incluindo KIF5A /KIF5C (cinesina 1), KIF3A (cinesina 2) e KIF1A (cinesina 3) (Fig. 1B). Detectamos apenas baixos níveis de KIF3A Considerando que tanto KIF5A e KIF5C mRNAs eram não-detectável em todas as três linhas celulares, de acordo com descobertas anteriores que sugerem que sua expressão é limitada aos neurônios [23] (Fig. 1B). A fim de desafiar a localização lisossômico de KIF5B detectados por análise proteômica de células MCF-7, nós submetido a fração de membrana de luz de células HeLa a um fraccionamento em gradiente de densidade e analisadas as diferentes frações por immunoblotting e atividade enzimática lisossomal medições. Como mostrado na Figura 1C, foi KIF5B exclusivamente presente nas fracções que contêm altos níveis de lisossomal LAMP-2 proteínas lisossómicas e marcadores de actividade enzimática (catepsinas de cisteína, fosfatase ácida e SS

N-acetil-glucosaminidase

). Convém, no entanto, notar-se que fracções contendo proteína marcadora Grp75 mitocondrial foram parcialmente sobreposta com frações lisossomais e KIF5B.

O esgotamento dos KIF5B induz vazamento lisossomal e morte celular em células HeLa

Para elucidar a papel de KIF5B no crescimento e sobrevivência celular, células HeLa e MCF-7 foram esgotadas para KIF5B por interferência de ARN (Fig. 2A). Interessantemente, as células HeLa-empobrecido KIF5B adquirido um fenótipo celular alongada seguido por inibição significativa do crescimento e morte celular (Fig. 2B-D). KIF5B depleção induzida semelhante, mas claramente mais fracos efeitos citotóxicos citostáticos /em células MCF-7 e um pouco mais em células MCF-7-ΔN-ErbB2, tal como analisada por microscopia de luz (Fig. 2B). Apesar de a indução de morte celular significativa, muito reduzida para a caspase-3 como a actividade foi detectada em células HeLa-empobrecido KIF5B (Fig. 2E). Em vez disso, as células KIF5B empobrecido apresentaram um aumento significativo na actividade da catepsina cisteína citosólica indicativo de permeabilização da membrana lisossomal (Fig. 2F).

A depleção de células HeLa em KIF5B induz agregações periféricos de lisossomas de células HeLa

Desde KIF5B células extraembryonic rato deficiente exibir o agrupamento perinuclear das mitocôndrias e diminuição do tráfico desencadeada por ácido dos lisossomos para a periferia celular [16], o próximo estudou a distribuição dessas organelas após a depleção KIF5B. A fim de investigar a distribuição lisossômico, tiramos vantagem das células HeLa que expressam uma eGFP-LIMP1 como um marcador lisossomal [19]. Em células HeLa-eGFP-LIMP1 empobrecido-KIF5B a distribuição de lisossomas eGFP-LIMP1-postive foi drasticamente alterado a partir de um padrão perinuclear difusa para grandes agregados periféricos (fig. 3A). Estes lisossomos apareceu em grupos e foram transportados ativamente de e para os agregados, como observado por microscopia de lapso de tempo vídeo (Video S1 e S2). Contrariamente aos lisossomas, a distribuição mitocondrial não foi afectada pela depleção KIF5B em células HeLa (Fig. 3A).

(A) representativos de imagens confocais a utilização de células HeLa ou células HeLa que expressam de forma estável LIMP-1-EGFP transfectadas com KIF5B MM ou ARNsi, e coradas com anticorpos indicados. (B) células HeLa cultivadas sobre lamelas de cobertura (80% de confluência) foram feridos membrana com um bisturi e imediatamente depois coradas para a superfície de LAMP-1; As células foram subsequentemente fixadas e coradas para KIF5B. células (C) HeLa transfectadas com ARNsi indicados estavam (após 48 h) estimuladas para exocitose com 10 pM de ionomicina. a secreção extracelular das catepsinas lisossomais foi medida por um ensaio de enzima e valores ZFR-AMC (meio de medições em triplicado ± DP) foram expressos como percentagem do teor total de LDH celular. (D) Quantificação da superfície de LAMP-1 em células HeLa electroporadas por citometria de fluxo. Vermelho e verde indica células em dois portões diferentes. A percentagem de células na porta vermelha foi usada para estimar a quantidade de LAMP-1 +/- electroporação expostos à superfície. FL1-H: intensidade de fluorescência. FSC-H:. Forward dispersão lateral

Desde funções KIF5B como

além

-END motor, ou seja, um motor que transporta carga do centrossoma para a periferia celular [24], a acumulação de lisossomas para a periferia celular em células com depleção de KIF5B poderia ser devido a uma localização periférica do centrossoma ou uma falha dos lisossomas para fundir com a membrana plasmática. A fim de testar a primeira possibilidade, coradas células de HeLa-eGFP-LIMP1 com um anticorpo contra γ-tubulina para marcar os centrossomas. No entanto, os aglomerados lisossómicas não se acumulam em torno dos centrossomas (Fig. 3a). Para examinar se KIF5B é essencial para exocytosis lysosomal, foram aplicados três métodos diferentes (coçar mecânica, eletroporação e ionomicina) para induzir lesões da membrana plasmática que desencadeiam Ca

2 + fluxo e indução da resposta de resselagem que envolve exocitose dos lisossomos [25 ]. Um bisturi foi utilizada para zero em uma camada semi-confluente das células HeLa para induzir mecanicamente danos na membrana de plasma, e lisossomal exocitose foi imediatamente testada utilizando um anticorpo de detecção um epitopo luminal de lisossomal LAMP-1 na superfície celular. A fluorescência da superfície de LAMP-1 foi significativamente aumentada no local de dano indicativo de resselagem membrana lisossomal, e observou-se uma co-localização e acumulação de KIF5B adicional no local do dano sugerindo que KIF5B está envolvido nesta resposta (Fig. 3B). Uma vez que este método não é adequado para estudos quantitativos, foram utilizados para induzir a electroporação pequenos poros hidrofílicos na membrana plasmática para investigar se KIF5B era essencial para o processo de transporte de lisossomas para os locais de danos. O método é amplamente utilizada para introduzir proteínas e DNA em células e depende da capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após a electroporação [26]. As células HeLa foram electroporadas com o aumento de capacitância e imediatamente depois de terem sido coradas para a superfície de LAMP-1 (Fig. 3D). Quantificação de LAMP-1 exposta sobre a membrana do plasma por citometria de fluxo revelou um nível detectável de LAMP-1 de 3,3% de células não tratadas. Em contraste, quando as células foram electroporadas a 125 uF e 250, foi detectado LAMP-1 na superfície de 11,4 e 21% das células, respectivamente. As células esgotadas para KIF5B e expostas a 125 uF não exibir qualquer mudança significativa na superfície de LAMP-1, em comparação com células de controlo tratadas expostas a 125 uF (Fig. 3D). Da mesma forma, a exocitose lisossomal induzida por ionomicina de proteases luminais não foi afectada pela depleção KIF5B (Fig 3C). Estes dados demonstram que KIF5B não é crucial para a exocitose lisossomal e da membrana plasmática de resselagem. Além disso, a absorção de Alexa Flour 488-Dextrano (10 kDa) não foi afectada pela depleção KIF5B KIF5B indicando que não é necessária para a endocitose de fase fluida (dados não mostrados).

A depleção de KIF5B induz a acumulação peri-nuclear de autofagossomas

em seguida, examinamos se KIF5B desempenha um papel na autofagia, a principal via de degradação lisossomal. Para este efeito, nós tratamos células MCF-7 que expressam de forma estável a proteína LC3 associada-autophagosome fundido com o reforçada proteína de fluorescência verde (MCF-7-LC3-EGFP) com qualquer rapamicina que induz autofagia por inactivação do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 ( mTORC1) ou concanamycin a que inibe a actividade de ATPase vacuolar V-nos lisossomas resulta na redução do turnover da autofagossomas, bem como a indução da formação de autophagosome através da inibição da mTORC1 [27]. Curiosamente, a depleção de KIF5B por três não-sobreposição siRNAs diminuiu significativamente a capacidade da rapamicina para desencadear a formação de vesículas autofágicos LC3-postive (Fig. 4a). Este efeito não foi provocada por alterações na capacidade da rapamicina para inibir mTORC1 desde o esgotamento dos KIF5B não têm qualquer influência sobre a actividade mTORC1 como analisado pelo estado de fosforilação da p70 S6 quinase 1 (p70

S6K1) (Fig. 4B). Para explorar ainda mais o fenómeno, que seguiu a formação autophagosome em células MCF-7-LC3-eGFP tratados com rapamicina (não mostrado) ou por microscopia concanamycin Um vídeo lapso de tempo de 45 min. Surpreendentemente, a distribuição de autofagossomas foi dramaticamente alterada pela depleção KIF5B. Em células KIF5B esgotados os autofagossomas apareceu e acumulada, principalmente em torno do núcleo (Fig 4C-E;. Vídeo S3), enquanto que em células tratadas com siRNA de controlo que foram distribuídos difusamente por todo o citoplasma (Fig 4C;. Vídeo S4). Os autofagossomas perinuclear nas células KIF5B depletados foram localizados em estreita proximidade com o aparelho de Golgi como visualizado por coloração com um anticorpo contra um

trans

proteína de membrana de rede -Golgi Golgin-97 (Fig. 4F e vídeo S5).